西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(西安710061)

喬　晉　王新陽△　陸文慧　秦　星

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海馬RAGE和BACE異常表達(dá)與SHR認(rèn)知功能損害相關(guān)性研究*

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(西安710061)

喬晉王新陽△陸文慧秦星

摘要目的：探討自發(fā)性高血壓大鼠海馬β淀粉樣蛋白(Aβ)代謝通路的變化，揭示Aβ代謝通路異常在高血壓認(rèn)知損害中的意義。方法： 以SHR和WKY大鼠為研究對象，使用RT-PCR和Western blot方法分別檢測SHR及WKY海馬RAGE、LRP-1、APP和BACE 的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果：與WKY大鼠相比，SHR海馬組織RAGEmRNA、BACEmRNA的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，而APP mRNA表達(dá)水平相對降低(P>0.05),LRP-1mRNA表達(dá)水平相對增高(P>0.05);與WKY大鼠相比，SHR海馬組織RAGE、BACE的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，而APP和LRP-1表達(dá)水平相對增高(P>0.05)。結(jié)論: SHR海馬RAGE和BACE的mRNA及其蛋白表達(dá)水平異常增高，提示Aβ代謝異?？赡軈⑴c了高血壓認(rèn)知損害的發(fā)生機制。

主題詞高血壓/病理生理學(xué)認(rèn)知障礙淀粉樣前蛋白分泌酶@高級糖基化終末產(chǎn)物受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1大鼠

β-淀粉樣蛋白 (β-amyloidprotein,Aβ) 異常沉積是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)病理的主要環(huán)節(jié)，是AD發(fā)病的關(guān)鍵因素和治療靶點。Aβ是阿爾茨海默病老年斑的主要成分，其來源于淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein ，APP)的裂解。β-分泌酶(β- amyloid precursor protein cleaving enzyme ，BACE )是APP裂解過程中產(chǎn)生Aβ的主要限速酶。高級糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end products， RAGE)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1( Low-density lipid protein receptor-related potein-1，LRP-1)是負(fù)責(zé)Aβ的跨血腦屏障轉(zhuǎn)運。大量流行病學(xué)證據(jù)表明血管病性危險因素在AD發(fā)病中扮演著重要角色,可以促使AD的發(fā)生和加速AD臨床惡化[1]。高血壓是最常見的心腦血管病危險因素，也是AD發(fā)病的重要危險因素。血管病危險因素可以造成老年人認(rèn)知障礙的發(fā)生，但其導(dǎo)致認(rèn)知損害的發(fā)生機制復(fù)雜，特別是高血壓在AD發(fā)病中的作用尚未完全闡明，導(dǎo)致認(rèn)知損害的發(fā)生是否與淀粉樣蛋白的異常代謝有關(guān)，目前尚不明確。因此探索高血壓大鼠Aβ代謝途徑的變化，對于闡明在高血壓在AD發(fā)病中的作用具有重要價值,為AD的防治提供新的理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1主要試劑及儀器APP抗體、BACE抗體和GAPDH抗體購自美國Cell Signal公司；HRP-抗兔IgG 和HRP-抗小鼠IgG購自美國Santa Cruz公司。Western 印跡檢測試劑盒購自武漢博士德公司。Trizol試劑購自美國Inv itrogen公司, RT-PCR 試劑盒購自立陶宛Fermentas公司

2方法

2.1實驗動物和標(biāo)本處理

2.1.1動物:Spontaneously Hypertensive Rat SHR(14～15w)和WKY Wistar Kyoto rat大鼠(8～10周)各10只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心清潔飼養(yǎng)到18～20周。飼養(yǎng)溫度(24 ±2)℃,濕度(50±10)%,大鼠自由進(jìn)水、進(jìn)食。實驗過程中SHR死亡1只

2.1.2動物處死和標(biāo)本留?。焊骨蛔⑸?0%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉動物,麻醉成功后仰臥位固定于手術(shù)板上，打開胸腔，暴露心臟，從左心室把玻璃插管插至主動脈根部，用絲線結(jié)扎以防脫落，眼科剪剪開右心房放血，經(jīng)左心室主動脈插管快速灌注生理鹽水100 ml。然后斷頭取腦，分離兩側(cè)海馬組織，稱重，編號，液氮罐儲存，按待測指標(biāo)要求留取海馬組織待檢。

2.2RT-PCR檢測：取50～100 mg 冰凍的海馬組織，Trizol一步法提取總RNA后，計算所提取RNA的A260/280值，電泳后紫外燈下觀察RNA 樣本的完整性。再按說明書操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 取2μl進(jìn)行后續(xù)25μl體系 PCR反應(yīng) , 擴增目的基因片段。委托上海捷瑞生物工程公司合成5對引物APP、BACE、RAGE、LRP-1和內(nèi)參照GAPDH。APP上游引物：5′-GGATGCGGAGTTCGGACATG -3′，下游引物5′-GTTCTGACTCTGCTCAAAG-3′；BACE上游引物：5′-GATGGTGATGCGGAAGGACTGATT-3′，下游引物： 5′-CCGGCGGGAGTGGTATTATGAAGT-3′； RAGE上游引物：5′-CAGGGTCACAGAAACCGG-3′， 下游引物：5′-ATTCAGCTCTGCACGTTCCT-3′；LRP-1上游引物：5′-GAGTGTTCCGTGTATGGCAC-3′ ，下游引物：5′-GATGCCTTGGATGATGGTC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3′，下游引物：5′- ATG TCACGCACGATTTCCCGC - 3′。按照美國Cell signaling公司提供的TRizol試劑盒說明步驟提取RNA,然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增: ①逆轉(zhuǎn)錄:按照立陶宛Fermentas公司試劑盒上說明操作:逆轉(zhuǎn)錄條件為: 25℃, 10 min; 42℃, 60 min； 70℃, 10 min; ② PCR的條件是: APP：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s， 52℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環(huán)后，72℃最終延伸7min。BACE:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火45s,72℃延伸45s，30個循環(huán)后; 72℃最終延伸7min。RAGE:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環(huán)后， 72℃最終延伸7min。 LRP-1:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s;51℃退火45s， 72℃延伸45s，35個循環(huán)后 ,72℃最終延伸7min。終產(chǎn)物片段長度分別為298、 322、214、768和500bp。 PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳, 上樣總量為15μl (擴增產(chǎn)物樣品量10μl、5μl DNA Marker)，并在Bio-RAD凝膠成像分析儀上進(jìn)行分析。以APP/GAPDH、BACE/GAPDH、RAGE/GAPDH、LRP-1/GAPDH的PCR產(chǎn)物的灰度值比值代表APPmRNA、BACEmRNA、mRNA、LRP-1mRNA表達(dá)水平。

2.3Western blot檢測：取50～100mg海馬組織進(jìn)行蛋白的提取,并按照Bradford試劑盒測定蛋白的濃度。取蛋白樣品30μg,經(jīng)過SDS-PAGE電泳后,將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜, 以5%脫脂奶粉TBST液封閉后,分別加入I抗APP抗體、BACE抗體、RAGE抗體、LRP-1抗體、GAPDH抗體，4℃孵育1.5h,洗滌后加入Ⅱ抗(HRP-抗兔IgG和抗小鼠IgG，1∶3000)，室溫孵育1h后, ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光顯影。通過Scannerk708型BenQ掃描儀成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光分析。分別以APP/GAPDH、BACE/GAPDH、RAGE/GAPDH、LRP-1/GAPDH 的光密度值之比代表APP、BACE、RAGE、LRP-1的表達(dá)水平。

結(jié)果

1SHR和WKY大鼠海馬組織RAGE、LRP-1、APP和BACE mRNA的表達(dá)情況采用RT-PCR方法檢測結(jié)果提示,與WKY大鼠相比較，SHR海馬組織RAGE、BACEmRNA的表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而APP mRNA表達(dá)水平相對降低(P>0.05)；LRP-1mRNA表達(dá)水平相對增高，但兩組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

2SHR和WKY大鼠海馬組織RAGE、LRP-1、APP和BACE的表達(dá)情況采用Western blot方法檢測結(jié)果提示,與WKY大鼠相比較，SHR海馬組織RAGE、BACE的表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而APP和LRP-1表達(dá)水平相對增高，但兩組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1　兩組大鼠海馬RAGE、LRP-1、APP和表達(dá)水平

注：與WKY比較，ΔP>0.05,*P<0.05

表2　兩組大鼠海馬組織的表達(dá)水平

注：與WKY比較，*P<0.05,ΔP>0.05

討論

Aβ是阿爾茨海默病老年斑的主要成分，其來源于淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解。而BACE是APP裂解過程中產(chǎn)生Aβ的主要限速酶。在病理情況下，APP在BACE和γ-分泌酶的共同作用下，產(chǎn)生含有40～42氨基酸序列的少量Aβ42和大量Aβ40，其中Aβ40主要沉積于血管壁，而Aβ42是老年斑的主要成分之一。同時RAGE通過內(nèi)吞和跨膜作用，不斷的攝取外周血液中的Aβ經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)進(jìn)入腦內(nèi)，而LRP-1則負(fù)責(zé)將腦間質(zhì)液的Aβ經(jīng)血腦屏障介導(dǎo)轉(zhuǎn)運出腦外，這樣Aβ在腦細(xì)胞間液的凈含量，不但取決于由APP經(jīng)BACE裂解的生成量，也受RAGE 和LRP-1的經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)運平衡狀況的影響。在遺傳性家族性AD發(fā)病機制中，Aβ產(chǎn)生過多是其主要原因，但已有研究資料表明散發(fā)性AD發(fā)生的機制可能并不是Aβ的生成增多，而主要是由于Aβ經(jīng)血腦屏障的轉(zhuǎn)運減少有關(guān)[2]。

血管病性危險因素是引起血管性癡呆的的主要因素。隨著人們對AD研究的不斷深入，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)高血壓等血管病性危險因素在AD發(fā)生發(fā)展中也起了一定的作用[3-4]，可以促進(jìn)AD的發(fā)生或?qū)е翧D的臨床惡化。但對其發(fā)生機制尚不完全清楚，大多推測與血管因素造成腦血管損害而繼發(fā)腦的缺血性損害相關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)和正常血壓WKY大鼠比較，SHR大鼠海馬組織APPmRNA表達(dá)不變，而BACEmRNA的表達(dá)增高，而后者表達(dá)增高有助于APP裂解生成Aβ。同時發(fā)現(xiàn)SHR大鼠海馬組織RAGEmRNA的表達(dá)也明顯增高，而LRP-1mRNA的表達(dá)變化不大，這樣可能導(dǎo)致Aβ經(jīng)血腦屏障的轉(zhuǎn)運平衡發(fā)生了障礙，使得更多的Aβ轉(zhuǎn)運入腦，從而增加了腦細(xì)胞間液Aβ的凈含量。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠海馬組織BACE和RAGE的表達(dá)較血壓正常的WKY大鼠明顯增高；而APP 和LRP-1表達(dá)水平雖也增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。因此SHR確實存在Aβ代謝通路的異常改變，可能通過上調(diào)BACE的表達(dá)造成Aβ的生產(chǎn)增多和通過上調(diào)RAGE的表達(dá)造成Aβ轉(zhuǎn)運入腦增加，從而造成腦細(xì)胞間液Aβ凈含量異常增多，導(dǎo)致Aβ異常沉積，進(jìn)而造成海馬膽堿能神經(jīng)元的功能障礙，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能的損害。已有研究發(fā)現(xiàn)AD患者和APP轉(zhuǎn)基因動物模型中，RAGE在血腦屏障的表達(dá)顯著上調(diào)，而LRP-1表達(dá)下調(diào)，且與Aβ的聚集有關(guān)[5]。血腦屏障上LRP-1 和RAGE 的表達(dá)異常，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)運Aβ功能失衡出現(xiàn)腦Aβ水平異常升高,繼而Aβ聚集和沉淀,形成老年斑[6]。

另外動物實驗研究表明大鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造成腦缺血模型后β-分泌酶mRNA上調(diào)接近100 %。大鼠單側(cè)腦缺血模型后顯示結(jié)扎側(cè)大腦皮質(zhì)的BACE1活性上調(diào)30 % , BACE1 蛋白量上調(diào)67 %[7]，提示腦缺血可誘發(fā)Aβ代謝紊亂，提示SHR大鼠也可能是通過高血壓造成腦缺血，而后由于腦缺血導(dǎo)致BACEmRNA表達(dá)上調(diào)，使得Aβ生成增多；同時由于RAGEmRNA的表達(dá)上調(diào)而導(dǎo)致Aβ經(jīng)血腦屏障的轉(zhuǎn)運平衡發(fā)生了障礙，使Aβ更多轉(zhuǎn)運入腦，造成腦細(xì)胞間液Aβ凈含量明顯增多而沉積形成老年斑。

AD患者腦內(nèi)RAGE表達(dá)上調(diào)，尤其在老年斑周圍神經(jīng)元表面和微血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)尤為明顯。RAGE與Aβ結(jié)合后，跨血腦屏障轉(zhuǎn)運入腦，然后被小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元攝取誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)炎性因子釋放，并激活NF-κB系統(tǒng)，使炎性反應(yīng)進(jìn)一步加強，同時，RAGE和Aβ結(jié)合可促進(jìn)內(nèi)皮素表達(dá)增多，進(jìn)而誘發(fā)缺血反應(yīng)，二者均可造成神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡。最新的利用主動脈縮窄造成高血壓小鼠模型探討了高血壓認(rèn)知損害和機制[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓誘導(dǎo)了腦小血管Aβ和小鼠認(rèn)知功能的降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種改變與血管壁上RAGE的表達(dá)上調(diào)相關(guān)，而RAGE表達(dá)上調(diào)可能與氧化應(yīng)激和糖基化產(chǎn)物形成有關(guān)。這和我們的結(jié)果相似。

另外在我們研究發(fā)現(xiàn)LRP-1在SHR海馬的表達(dá)和WKY上表達(dá)差異不大。但AD 患者和AD模型動物的血腦屏障上LRP-1表達(dá)顯著減少[9]。但也有證據(jù)表明AD模型動物腦微血管上LRP-1的表達(dá)與Aβ沉積呈負(fù)相關(guān)[10]。而另有研究發(fā)現(xiàn)在抗RAGE抗體IgG能阻斷Aβ對RAGE的影響，使處于豐富Aβ條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞LRP-1的表達(dá)上調(diào)，說明在Aβ富集區(qū)域RAGE和LRP-1表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)[11]。因此腦內(nèi)LRP-1的表達(dá)可能主要受腦局部微環(huán)境的影響，在疾病的不同階段可能表達(dá)水平存在差異。

因此,我們認(rèn)為高血壓在AD的發(fā)生中具有一定的作用，其發(fā)生機制除了高血壓造成的腦缺血有關(guān)外，也可能與β淀粉樣蛋白代謝途徑異常有關(guān)。但Aβ代謝異常和高血壓及腦缺血之間的因果關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究。AD的發(fā)生除了被大家廣為接受的Aβ沉積級聯(lián)反應(yīng)學(xué)說外，血管假說也是值得重視和研究，二者之間的關(guān)系密不可分，但之間的因果關(guān)系或協(xié)同作用仍不十分清楚?；凇吧窠?jīng)血管單元”這一結(jié)構(gòu)的解剖和生理理論體系，血管神經(jīng)解耦聯(lián)學(xué)說可能更好的詮釋了血管因素和AD發(fā)病的內(nèi)在聯(lián)系和機制[12]，而Aβ、RAGE和BACE三者之間的相互關(guān)系是研究血管因素在AD發(fā)生中的作用焦點之一，也是AD防治的一個值得關(guān)注的潛在靶點。

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(收稿:2015-12-04)

【中圖分類號】R363.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.06

The correlation research of abnormal expression of RAGE and BACE in Hippocampal and cognitive impairment in SHR

Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Qiao JinWang XinyangLu Wenhuiet al

ABSTRACTObjective: To explore the changes of β-amyloid proteins (Aβ)metabolic pathways in spontaneously hypertensive rats and reveal significance of Aβmetabolic abnormalities in cognitive impairment related to hypertension. Methods: SHR and WKY rats as the research object, using RT-PCR and Western blot method to detect mRNA and protein expression level of RAGE, LRP - 1, APP and BACE in SHR and WKY hippocampal. Results: Compared with WKY rats, the expression levels of RAGEmRNA and BACEmRNA in SHR hippocampal tissue increased significantly (P < 0.05), whILe the APP mRNA expression level relativly decrease (P > 0.05), LRP - 1 mRNA expression level was relatively higher (P> 0.05); Compared with WKY rats, the expression level of RAGE and BACE in SHR hippocampal tissue signIFIcantly increased (P< 0.05), whILe the APP and LRP - 1 expression level was relatively higher (P> 0.05). Conclusion：Abnormal expression of mRNA and protein of RAGE and BACE in hippocampus is associated with SHR cognitive impairment, it is to say that Aβ metabolic abnormalities may be involved in the mechanism of cognitive impairment due to high blood pressure.

KEY WORDSHypertension/physiopathologyCognition disordersAmyloid precursor proteinSecretasesReceptor for advanced glycation end productsLow-density lipid protein receptor-related protein-1Rats

*陜西省衛(wèi)生和計劃生育委員會基金資助項目(2014D34)

△教育部環(huán)境與基因相關(guān)疾病研究室