中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科(沈陽(yáng)110032 )

王　露　張　丹　史　亮　王　薇　楊麗剛

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胰高糖素肽-1對(duì)軟脂酸培養(yǎng)中胰島細(xì)胞的影響

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科(沈陽(yáng)110032 )

王露張丹史亮王薇楊麗剛

摘要目的：探討胰高糖素樣肽-1(GLP-1)對(duì)軟脂酸培養(yǎng)下胰島細(xì)胞的影響。方法：體外培養(yǎng)胰島細(xì)胞INS-1，將其分為空白對(duì)照組、軟脂酸組(0.25 mmol/L)及GLP-1作用組(濃度分別為10nmol/L，20nmmol/L，30nmol/L)，培養(yǎng)24h后，取上清測(cè)定胰島素水平及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量。結(jié)果：軟脂酸可使胰島素分泌量減少，GSH-Px濃度下降，MDA含量增加，GLP-1可以明顯抑制軟脂酸引起的上述變化，抑制作用隨GLP-1濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)論：胰高糖素樣-1(GLP-1)對(duì)軟脂酸導(dǎo)致的胰島細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，并且呈濃度依賴性。

主題詞胰高糖素樣肽-1谷胱甘肽過(guò)氧化物酶丙二醛細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

胰高糖素樣肽-1(GLP-1)以葡萄糖依賴的形式促進(jìn)體內(nèi)胰島素的分泌，且能刺激胰島β細(xì)胞的增殖和新生β細(xì)胞的分化，抑制其凋亡，從而增加胰島β細(xì)胞的數(shù)量，改善胰島β細(xì)胞功能，進(jìn)一步延緩體內(nèi)胰島β細(xì)胞的衰竭[1-2]。 “脂毒性”是指血循環(huán)中游離脂肪酸濃度過(guò)高以及脂肪組織分泌的各種脂肪素含量增高所引起的致糖尿病作用。脂毒性對(duì)胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能均可產(chǎn)生不利影響。有研究表明，軟脂酸可以導(dǎo)致胰島素分泌減少[3]，而應(yīng)用胰高糖素樣-1能否減輕此反應(yīng)也不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用軟脂酸培養(yǎng)胰島細(xì)胞，并進(jìn)一步探討胰高糖素樣-1對(duì)此的影響。

材料與方法

1材料細(xì)胞株和試劑：大鼠胰島細(xì)胞株INS-1(武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù))，軟脂酸購(gòu)于美國(guó)Calbiochem公司，GLP-1(Sigma公司，美國(guó));放射免疫法測(cè)定試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免研究所。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠胰島細(xì)胞株INS-1培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640 培養(yǎng)基中(含10%mmol/L Hepes, 1mmol/L丙酮酸鈉，50μmol/L 2- 巰基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml 的鏈霉素)，置于37%℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁生長(zhǎng)的INS-1 細(xì)胞用0.25%胰酶消化離心，用RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，并校正細(xì)胞濃度至1×106/ml。分別將iNS-1細(xì)胞按1×105個(gè)/ml種植于24孔板內(nèi)，分為①正常對(duì)照組; ②軟脂酸組(0.25 mmol/L);③GLP-1低劑量組：軟脂酸0.25 mmol/L+10nmol/L GLP-1;④GLP-1中劑量組：軟脂酸0.25mmol/L+ 20nmol/L GLP-1;⑤GLP-1高劑量組：軟脂酸0.25 mmol/L +30nmol/L GLP-1。孵育24h收集上清液，-20°C保存。

2.2胰島素含量:采用放免法測(cè)定。

2.3GSH-Px、MDA含量：采用比色法測(cè)定。

結(jié)果

1胰島素含量的比較單用軟脂酸培養(yǎng)組的胰島素水平較對(duì)照組明顯降低(P﹤0.05)，加用GLP-1干預(yù)后胰島素水平較單用軟脂酸組明顯增加(P﹤0.05)，隨GLP-1濃度增加改善作用逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)附表。

2GSH-Px、MDA含量的比較單用軟脂酸培養(yǎng)組的GSH-Px含量較對(duì)照組明顯降低(P﹤0.05)，加用GLP-1干預(yù)后明顯改善(P﹤0.05)，隨GLP-1濃度增加改善作用逐漸增強(qiáng)。與對(duì)照組比較，單用軟脂酸培養(yǎng)組的MDA含量明顯增加(P﹤0.05)，經(jīng)GLP-干預(yù)后明顯得到抑制(P﹤0.05)，隨GLP-1濃度增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)附表。

附表　各組胰島素及GSH-Px、MDA含量的比較

注： 與對(duì)照組比較，#P﹤0.05 ，與軟脂酸組比較，*P﹤0.05

討論

本研究應(yīng)用軟脂酸培養(yǎng)胰島細(xì)胞發(fā)現(xiàn)胰島素水平明顯降低，進(jìn)一步證明了游離脂肪酸對(duì)胰島細(xì)胞脂毒性的作用，脂毒性可以誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡[4]，影響胰島素分泌。李麗英等[5]也發(fā)現(xiàn)將大鼠胰島β細(xì)胞置入含有過(guò)氧化氫的環(huán)境中后, 胰島β細(xì)胞的增值活性、存活率和胰島素分泌能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。這其中的機(jī)制，目前比較公認(rèn)的是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激[6]。胰島是所有組織中對(duì)氧化應(yīng)激最敏感的組織,胰島中抗氧化酶的含量在所有組織中是最低的。本實(shí)驗(yàn)也研究發(fā)現(xiàn)軟脂酸培養(yǎng)組的GSH-Px含量明顯減低，MDA含量明顯增加，表明軟脂酸組氧化應(yīng)激水平明顯增加。氧化應(yīng)激時(shí)過(guò)剩的活性氧族可以直接對(duì)脂質(zhì)、蛋白、溶酶體、DNA造成氧化損傷，大量氧自由基可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化,線粒體膜形狀改變,導(dǎo)致線粒體功能障礙,生成減少,使質(zhì)膜和肌漿網(wǎng)膜的鈣泵失活,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子增多,激活磷脂酶活性,使膜磷脂分解,導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡。

胰高糖素樣肽-1的應(yīng)用是否能保護(hù)胰島細(xì)胞功能，到目前為止國(guó)際上也開(kāi)展了各種研究。臨床在應(yīng)用GLP-1類似物治療2型糖尿病患者后，可觀察到載脂蛋白B/載脂蛋白A1比值顯著降低，從而改善高脂血癥[7]。但體外研究對(duì)GLP-1影響脂質(zhì)代謝仍存有爭(zhēng)議，認(rèn)為其對(duì)脂質(zhì)合成和脂質(zhì)分解作用呈雙重作用。有研究[8]表明，GLP-1能夠增加脂肪細(xì)胞表明胰島素受體和胰島素底物(IRS-1)數(shù)量，促進(jìn)GLUT-4的表達(dá)，從而改善胰島素抵抗。而胰高糖素樣-1是否能保護(hù)胰島細(xì)胞，目前研究很少，本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同濃度的GLP-1與軟脂酸共同培養(yǎng)胰島細(xì)胞時(shí)，可明顯改善軟脂酸所致的胰島細(xì)胞損傷，并且這種保護(hù)作用隨GLP-1的濃度的增加而增強(qiáng)。這其中的原理可能是，GLP-1能夠抑制胰島β細(xì)胞因暴露于炎癥因子、高糖及游離脂肪酸等引起的細(xì)胞凋亡，拮抗β細(xì)胞因不良環(huán)境引起的損害并促進(jìn)前體細(xì)胞分化為β細(xì)胞[9]，且有學(xué)者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GLP-1能夠降低糖尿病鼠的氧化應(yīng)激水平從而減少β細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)前體細(xì)胞分化為β細(xì)胞[10]。在本實(shí)驗(yàn)中就發(fā)現(xiàn)加入GLP-1培養(yǎng)后，GSH-Px含量明顯增加，MDA含量明顯降低，并隨濃度增加，這種改變逐漸顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)胰高糖素樣肽-1顯著改善了由軟脂酸造成的胰島細(xì)胞分泌減少和氧化應(yīng)激水平增加，這不僅說(shuō)明氧化應(yīng)激在胰島功能損傷中起一定作用，同時(shí)也為改善胰島功能損傷的治療提供了一條思路。

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(收稿:2015-07-23)

【中圖分類號(hào)】R392.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.03