陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院 (咸陽712046)

楊曉航　李　舒　劉文奇　許小凡△ 　張　紅△ 　劉　力△▲

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二甲基亞砜、二甲基酰胺、甲醇、乙醇四種溶劑對Hela細胞培養(yǎng)干預效應研究*

陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院 (咸陽712046)

楊曉航李舒劉文奇許小凡△張紅△劉力△▲

摘要目的：觀察二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇四種常用有機溶劑對Hela細胞生存率的影響，為開展體外細胞干預實驗研究選擇溶劑種類和濃度提供參考。方法：采用MTT法檢測四種溶劑各9個濃度下Hela細胞的存活率；在此基礎上采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙標記流式細胞術，觀察8種不同濃度的乙醇對Hela細胞凋亡的影響。結果：四種有機溶劑不同濃度時對Hela細胞生存率產生不同影響，DMSO最佳濃度為0.5%；DMF最佳濃度0.1%，甲醇的最佳濃度0.1%～0.5%；Hela細胞的存活率和凋亡結果均表明乙醇作為有機溶媒的最佳濃度0.25%。結論：DMSO、DMF、甲醇、乙醇四種溶劑對Hela細胞活性和生存率存在負向影響，程度從小到大依次為乙醇、DMSO、DMF、甲醇，用于體外細胞培養(yǎng)的濃度最大均不可超過0.5%；乙醇是體外細胞培養(yǎng)中較為理想的溶劑，但濃度不可超過0.25%，刺激時間不可超過12h。

主題詞Hela細胞二甲亞砜甲酰胺類甲醇乙醇細胞培養(yǎng)技術干預性研究

Hela細胞是體外細胞干預實驗中常用的細胞株，在化學離子探針、分子作用靶向、血清藥理學等研究領域使用廣泛[1-4]。大量體外細胞培養(yǎng)的干預效應研究都涉及了有機溶劑的使用，但有機溶劑的使用多根據溶質需要確定濃度且差異較大[5-7]。目前未見針對使用有機溶劑的濃度差異對活細胞計數的干預效應研究[8-10]?，F有實驗中細胞活性或計數的研究結果，理論上均為溶質成分(分子)與有機溶劑形成溶液體系的疊加效應，忽略了有機溶劑對細胞的干預效應，從而引起實驗結果的誤差。本研究擬通過觀察二甲基亞砜(DMSO)、二甲基酰胺(DMF)、甲醇、乙醇四種有機溶劑對Hela細胞存活率的影響，為體外細胞實驗中有機溶媒的選擇和矯正相關研究結果的誤差提供實驗依據。

材料與方法

1實驗材料宮頸癌細胞株Hela細胞，購于西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心；緩沖液(PBS)配成0.01mmol/L，RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Solarbio公司， 胎牛血清、胰酶購于北京全式金生物技術有限公司 ，酶標儀為美國Bio-TEK公司產品。DMSO購于美國Sigma公司(純度>99.9%)、DMF購于廣東光華科技股份有限公司(純度>99.5%)、甲醇購于天津富宇精細化工有限公司(純度>99.5%)、乙醇購于天津市達森化工產品有限公司(純度>99.7%),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴鹽(MTT)購于美國Sigma公司。

2細胞培養(yǎng)宮頸癌細胞用RPMi1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、10mmol/L HEPES)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數生長期，觀察細胞貼壁狀況良好，即可使用。

3MTT法檢測細胞存活率細胞經過胰酶消化后計數。調整細胞密度至1×105個/ml,分別接種于4個96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h后分別設空白對照組、DMSO組、DMF組、甲醇組和乙醇組。空白對照組只加細胞和等體積培養(yǎng)基，不加有機溶劑，復孔8個；實驗組分別加入DMSO、DMF、甲醇、乙醇這四種有機溶劑的9個不同濃度，分別為0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、5%、10%、20%，濃度單位均為體積比,每組濃度設8個復孔，孵育24h后加入MTT 50μl(終濃度是5mg/ml)，孵育4h，小心吸取上清后，每孔繼續(xù)加入DMSO 150μl，孵育10min，充分震蕩，放入酶標儀，在490nm處測吸光度(OD值)，重復3次。得到的實驗數據，通過下面公式計算細胞相對存活率R。

R(%)=×100%

4細胞形態(tài)的觀察倒置顯微鏡20倍、40倍物鏡下觀察并記錄細胞的形態(tài)變化。

5AnnexinⅤ-FiTC/Pi雙標的流式細胞術觀察8種不同濃度的乙醇對Hela細胞凋亡的影響。Hela細胞經過胰酶消化后計數。調整細胞密度至1×106個/ml,接種于6孔板，每孔2ml，培養(yǎng)24h后分為6h實驗組、12h實驗組、24h實驗組。每組實驗組中均包含空白對照組和8種不同乙醇濃度組?？瞻讓φ战M共兩個復孔，只加細胞和等體積培養(yǎng)基，不加有機溶劑；實驗組各組分別加入8種不同濃度的乙醇，濃度分別為：0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、5%、10%；每組兩個復孔，放入細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，分別在6h、12h、24h時取出細胞，制成細胞懸液，經細胞曬網濾過之后，按試劑盒說明加入AnnexinⅤ-FiTC和Pi雙染，流式細胞儀檢測。重復3次，得到實驗數據。

結果

1DMSO對Hela細胞存活率的影響在濃度為0.5%以內，DMSO對Hela 細胞存活率無明顯影響。DMSO濃度在0.01%～0.05%時，細胞生存率與培養(yǎng)基對照組均無差異。但是，當濃度超出0.5%時，隨著濃度的增加，存活率顯著下降。以5%濃度組同0.5%濃度組相比較，細胞存活率明顯下降(P<0.05)。濃度對于0.5%的各組細胞生存率明顯下降，且隨著濃度的升高，存活率逐漸下降，見表1。

表1　DMSO不同濃度組Hela細胞OD均值與存活率

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P>0.05

2DMF對Hela細胞存活率的影響DMF的濃度為0.01%組、0.05%組、0.1%組、0.25%組、0.5%組分別與培養(yǎng)基對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，存活率與培養(yǎng)基對照組比無差異；DMF濃度為1%組、5%組、10%組、20%組分別與培養(yǎng)基對照組比較差異具有極顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，Hela細胞的存活率與培養(yǎng)基對照組比較有統(tǒng)計學差異，以0.5%濃度組同1%濃度組相較，細胞存活率有明顯下降(P<0.05)，見表2。

3甲醇對Hela細胞存活率的影響甲醇濃度為0.01%組、0.05%組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Hela細胞的存活率與培養(yǎng)基對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，且小于培養(yǎng)基對照組；0.1%組和0.5%組分別與培養(yǎng)基對照組比較，存活率無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)；0.25%組與培養(yǎng)基對照組比較，存活率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，且大于培養(yǎng)基對照組；1%組、5%組、10%組和20%組分別與培養(yǎng)基對照組比較，存活率有極顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.01)，且隨著濃度的升高存活率逐漸下降，見表3。

表2　DMF不同濃度組Hela細胞OD均值與存活率

注：與空白對照組比較，*P>0.05；與0.5%組比較，**P<0.05；與空白對照組比較，***P<0.01

表3　甲醇不同濃度組Hela細胞OD均值與存活率

注：與空白對照組比較，*P<0.05， **P>0．05，***P<0.01

4乙醇對Hela細胞存活率的影響乙醇9種不同濃度各組分別與培養(yǎng)基對照組比較，差異有極顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，濃度從0.01%～0.25%，隨著濃度的升高，存活率逐漸升高。0.5%組、1%組、5%組、20%組，隨著濃度的增加，Hela細胞的存活率逐漸降低，而10%濃度組與5%濃度組相較，10%組Hela細胞的存活率高。以0.5%組同0.25%組相較，Hela細胞的存活率有顯著下降差異有極顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示乙醇濃度超過0.25%時，Hela細胞的存活率明顯降低，見表4。

5相同濃度梯度下DMSO、DMF、甲醇、乙醇對Hela細胞存活率影響的比較當濃度同在0.25%以內時，乙醇分別與甲醇、DMSO、DMF相比較，Hela細胞的存活率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，乙醇中Hela細胞的存活率高于其他三種溶劑。提示0.25%濃度以內，首選乙醇作為有機溶媒。當有機溶媒濃度超0.5%，隨著濃度的增大，Hela細胞的存活率逐漸下降，與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示，DMSO、DMF、甲醇、乙醇四種有機溶劑在參與到Hela細胞培養(yǎng)的離體實驗中時，濃度均不可高于0.5%(圖1)。

表4　乙醇不同濃度組Hela細胞OD均值與存活率

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與0.5%組比較，**P< 0.01

圖1　相同濃度梯度下四種溶劑對Hela細胞存活率影響

6Hela細胞在四種溶劑中形態(tài)變化的比較對照組(圖2A)細胞核清晰可見、完整、型好，細胞個體緊實、邊界清楚、貼壁良好、緊緊相連。與空白對照組相比，DMSO組細胞隨著濃度的增加，細胞腫脹，細胞核明顯腫脹、變形、固化，邊界清晰可見無連接(圖2B、C、D)；DMF組細胞中可見，細胞體積腫脹，細胞核變大、固化(圖2E、F、G)；甲醇組細胞隨著濃度增大，細胞核逐漸腫脹變大，相較于其他三種溶劑其細胞核折疊程度明顯增加(圖2H、I、J)；乙醇組細胞隨著濃度增大體積逐漸腫大，固化，邊界清晰，無連接，細胞核腫大與保質邊界清晰可見(圖2K、L、M)。各組Hela細胞形態(tài)變化與MTT檢測結果一致。

7不同時間段相同濃度梯度下乙醇對Hela細胞存活率影響當乙醇濃度為0.25%時，以刺激6h后Hela細胞的存活率與刺激12h后Hela細胞的存活率相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示乙醇刺激Hela細胞6h和12h，Hela細胞的存活率無差別。

圖2　四種溶劑不同濃度對Hela細胞形態(tài)的影響

同樣比較Hela被乙醇刺激6h與24h，12h與24h，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示當乙醇濃度為0.25%時，刺激時間在24h內，Hela細胞的存活率無差別。同理比較乙醇濃度為0.5%時，Hela細胞被刺激6h與24h比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示乙醇濃度為0.5%時，Hela細胞被刺激6h與24h后的存活率有差別。當Hela細胞被乙醇刺激同為12h時，以濃度為1%組同5%組相比較，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示同被乙醇刺激12h后，Hela細胞的存活率1%組與5%組有顯著性差別，5%組Hela細胞的存活率明顯低于1%組。當Hela細胞被乙醇刺激同為6h時，同樣以濃度為1%組同5%組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示1%組與5%組Hela細胞的存活率有差別。結果顯示，Hela細胞離體實驗中，乙醇作為有機溶媒時，濃度不可超過0.5%，與MTT檢測結果基本一致，刺激時間控制在12h為最佳(圖3)。

8乙醇對Hela細胞刺激12h流式細胞儀檢測結果及細胞形態(tài)乙醇刺激12hHela細胞流式細胞儀檢測結果顯示：對照組Hela細胞群99.99%集中在Q3象限；0.25%乙醇組有少部分細胞分散到其他3個象限，同時Q3象限細胞數量明顯減少；5%乙醇組可以看到明顯的有多部分細胞分散到Q1和Q2象限，Q3象限相較0.25%組有減少；10%乙醇組細胞數量明顯減少，分散在4個象限的細胞也明顯稀疏(圖4)。乙醇刺激12hHela細胞顯微鏡下顯示：對照組細胞均勻分布，細胞形態(tài)完好，呈梭狀或不規(guī)則形狀，貼壁。0.25%乙醇組細胞有部分呈圓形，不貼壁，透亮度增大，另一部分呈梭形。5%乙醇組可以看見細胞少部分貼壁，腫脹，同樣透亮度增大。10%乙醇組細胞已沒有細胞形態(tài)，皺縮呈黑色團狀，周圍有光暈，細胞數量也明顯減少(圖5)。鏡下觀察與流式檢測結果基本一致。

圖3　不同時間段相同濃度梯度下，乙醇對Hela細胞存活率的影響

討論

細胞體外培養(yǎng)計數及存活率檢測是細胞研究的基本技術指標， DMSO、DMF、甲醇和乙醇是開展細胞研究最常用的四種有機溶劑。雖然目前已開展了四種有機溶劑對不同細胞株的毒性和干預效應研究，但缺乏在同一細胞和培養(yǎng)環(huán)境四種溶劑的比較研究[11-13]，造成在有機溶劑選擇時缺乏實驗依據。本研究結果證實了四種有機溶劑對Hela細胞活性和生存率存在負向干預效應，其影響程度從小到大依次為乙醇，DMSO、DMF、甲醇。同時研究結果表明在細胞培養(yǎng)中應用四種溶劑的體積比濃度上限為0.5%，否則會一定程度上導致Hela細胞的死亡，影響細胞計數及存活率。

研究結果顯示乙醇是體外細胞培養(yǎng)中較為理想的溶劑，但濃度不可超過0.25%，時間不可超過12h。研究還發(fā)現乙醇刺激24h后，濃度小于1%時，Hela細胞的數量和存活率均較6h、12h高，且與濃度呈正相關，提示較低濃度的乙醇可以刺激細胞增殖。結合MTT的實驗原理[14]推測導致上述結果的原因可能為：低濃度的乙醇激活了琥珀酸脫氫酶，使三羧酸循環(huán)加快，從而使得OD值升高。同時低濃度的乙醇可以刺激Hela細胞的增殖，線粒體增多。但琥珀酸脫氫酶是否被激活以及其激活途徑本實驗尚未涉及，有待進一步研究。

研究還發(fā)現甲醇溶劑培養(yǎng)的Hela細胞核明顯折疊，細胞腫脹沒有其他三種溶劑中的細胞明顯。推斷可能甲醇可能通過對細胞核的影響引起了細胞凋亡。因此建議在實驗中，如溶質分子可能進入細胞核時，應慎重考慮使用甲醇。

細胞內外的物質交換、細胞內的生物化學反應影響著細胞的生存、結構和功能，胞內存在的多種信號轉導途徑之間又存在著復雜的交叉對話機制[15]，細胞的生存率、形態(tài)變化、染色質凝縮、空泡出現等事件受到來自細胞內外諸多因素的影響和調控[16-17]。離子探針、化學藥物、中藥藥效成分等在體外與細胞共培養(yǎng)過程中使用的有機溶劑雖然用量較少，可理論上都會對細胞的活性和計數產生一定影響，甚至影響研究結果。

本次研究結果明確了四種常見有機溶劑在不同濃度時對離體培養(yǎng)細胞計數和形態(tài)的干預效應，對開展離體細胞培養(yǎng)時有機溶劑類型和濃度的選擇有一定指導意義，但溶劑濃度差異與細胞存活率和形態(tài)差異形成的機制仍待進一步闡明。

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(收稿:2016-02-11)

【中圖分類號】R392.1

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.02

The optimum concentration of four kinds of organic solvents such as DMSO，DMF，methyl alcohol，ethyl alcohol as solvents effect on Hela cell in vitro experiments

Department of Medical Technology of Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Yang XiaohangLi ShuLiu Wenqiet al

ABSTRACTObjective :To research the best concentration of four kinds of organic solvents DMSO 、DMF 、methyl alcohol、ethyl alcohol effect on Hela cell through measure the optical density value (OD value) of the four solvents under various survival rate. Provide guidance for select solvention microprobe and traditional Chinese medicine experiment. Methods: Using determined by MTT reagent combined enzyme standard meter method to concentrations of 9 Hela survival rate. Using 8 different concentrations of ethanol and 3 time periods in Hela cells with AnnexinⅤ-FiTC/Pi marked, and then characteristics on the apoptosis of Hela cells by flow cytometry method. Result: The best concentration of ethyl alcohol could not more than 0.25%;The bestconcentration of DMSO could not more than 0.5%;The best concentration of DMF could not more than 0.1%;The best concentration of methyl alcohol was between 0.1% and 0.5% . Conclusion: Ethyl alcohol is the best one of these 4 organic solvents which used in experiment of Hela cell in vitro. You’d better use the concentration less than 0.25%;stimulate time can not more than 12 hours. if there is something wrong with the solubitity, the order of these 4 organic solvents is ethyl alcohol, DMSO 、DMF and methyl alcohol. Take care ,the concentration must be less than 0.5%.

KEY WORDSHela cellsDimethyl sulfoxideFormamidesMethanolEthanolCell culture techniquesIntervention studies

*國家自然科學基金資助項目(81173156)

陜西省教育廳科學研究計劃項目(14JK1188)

△陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學科研實驗中心

▲陜西省中醫(yī)藥研究院