喻志芳，韓 彬，柴文戍

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·論著·

Krupple樣因子6調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合酶介導(dǎo)銅綠假單胞菌感染小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的研究

喻志芳，韓 彬，柴文戍

121001遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科

【摘要】目的通過(guò)研究Krupple樣因子6(KLF6)在銅綠假單胞菌感染肺組織中表達(dá)水平的變化，探討KLF6調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)介導(dǎo)銅綠假單胞菌感染小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法于2014年10—12月，30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和低感染組，每組15只，低感染組注射銅綠假單胞菌1.0×107 CFU制作動(dòng)物模型，感染后3、9、24 h，分別隨機(jī)取各組5只小鼠留取標(biāo)本。另10只小鼠隨機(jī)分為中感染組和高感染組，每組5只，分別注射銅綠假單胞菌5.0×107、1.0×108 CFU，均在感染后9 h留取標(biāo)本。在各時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后無(wú)菌分離肺組織,左肺結(jié)扎后測(cè)定濕干重之比。采用TUNEL法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)，采用硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(NO)水平,化學(xué)比色法測(cè)定iNOS活性，采用Western blotting法檢測(cè)肺組織KLF6水平。結(jié)果光鏡下可見(jiàn)低感染組小鼠肺組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡隔增厚，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，局部有肺泡膨脹不全或肺泡塌陷,并擴(kuò)散到肺間質(zhì)內(nèi)，24 h時(shí)炎癥改變最為嚴(yán)重。3 h時(shí),對(duì)照組和低感染組肺組織濕干重之比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；9、24 h時(shí)，低感染組肺組織濕干重之比大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低感染組不同時(shí)間肺組織凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3、9、24 h時(shí)，低感染組肺組織NO水平、iNOS活性均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織NO水平、iNOS活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低感染組不同時(shí)間肺組織KLF6表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織KLF6表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論銅綠假單胞菌感染能誘導(dǎo)KLF6的表達(dá)，并有可能通過(guò)iNOS調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌；Krupple 樣因子6；一氧化氮合酶；細(xì)胞凋亡

喻志芳，韓彬，柴文戍.Krupple樣因子6調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合酶介導(dǎo)銅綠假單胞菌感染小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(20)：2435-2439.[www.chinagp.net]

YU Z F,HAN B,CHAI W S.KLF6 and iNOS regulated apoptosis during pseudomonas aeruginosa lung infection in mice[J].Chinese General Practice，2016，19(20)：2435-2439.

銅綠假單胞菌是自然環(huán)境中廣泛存在的革蘭陰性桿菌，可導(dǎo)致免疫功能低下者急性感染，有肺基礎(chǔ)疾病者慢性終生感染[1]。組織損傷時(shí)，一氧化氮(NO)作為細(xì)胞因子可使靶細(xì)胞凋亡，加強(qiáng)局部炎性反應(yīng)，而誘導(dǎo)型一氧化氮?jiǎng)t在感染后產(chǎn)生[2]。雖然感染銅綠假單胞菌時(shí)，NO是加重肺疾病的關(guān)鍵因素，但其在感染過(guò)程中誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚未明確。已有研究表明，Krupple樣因子6(KLF6)在炎性反應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]，但其與銅綠假單胞菌所致組織細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究較少。本文探討感染銅綠假單胞菌時(shí)KLF6的作用機(jī)制，為臨床治療提供新的方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)昆明小鼠〔許可批號(hào)：SCXK(遼)2014-0004〕；銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)中心贈(zèng)送；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche公司；KLF6(R-173)購(gòu)自美國(guó)Santa cruz biotechnology,貨號(hào)SC-7158；NO試劑盒(硝酸還原酶法)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠盒均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株配制于2014年10—12月，參考文獻(xiàn)[4]配制銅綠假單胞菌菌株，加1.0 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)菌,用分光光度比色法測(cè)定菌液的濃度，懸浮于無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液調(diào)整至1.0×108CFU/ml備用。

1.2.2動(dòng)物模型40只昆明小鼠，體質(zhì)量20～30 g，雌雄各半，其中30只隨機(jī)分為對(duì)照組和低感染組，每組15只，在感染后3 、9 、24 h，分別隨機(jī)取各組5只留取標(biāo)本。對(duì)照組小鼠不做處理。低感染組小鼠腹腔內(nèi)注射體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛0.6～1.0 ml麻醉，參考文獻(xiàn)[5]制作銅綠假單胞菌感染模型，每只小鼠注射銅綠假單胞菌1.0×107CFU。剩余10只隨機(jī)分為中感染組和高感染組，每組5只，分別注射銅綠假單胞菌5.0×107、1.0×108CFU，均在感染后9 h留取標(biāo)本。在各時(shí)間點(diǎn)處死小鼠后無(wú)菌分離肺組織,左肺結(jié)扎后測(cè)定濕干重之比，結(jié)扎的右上葉肺組織用4%多聚甲醛固定液固定,行石蠟包埋、切片，剩余的部分右肺組織于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.3肺組織濕干重之比的測(cè)定處死小鼠取肺時(shí)將左肺稱重，記為濕重。70 ℃烤箱中烘烤24 h后所稱重量記為干重，計(jì)算濕干重之比。

1.2.4肺組織病理學(xué)檢測(cè)將由4%多聚甲醛固定液固定后的肺組織行石蠟包埋和切片,隨機(jī)抽取1張切片行蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織的形態(tài)學(xué)改變,在400倍視野下連續(xù)觀察10 個(gè)不同視野。

1.2.5肺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL法進(jìn)行檢測(cè)，操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。凋亡細(xì)胞胞核呈棕褐色顆粒狀，在400倍視野下，每張切片觀察10個(gè)視野，以凋亡細(xì)胞數(shù)量占同一視野中的細(xì)胞總數(shù)的百分比表示為凋亡指數(shù)。

1.2.6肺組織NO水平及iNOS活性的測(cè)定取出存放于-80 ℃凍存的肺組織，在4 ℃的0.9%氯化鈉溶液中漂洗,濾紙拭干,分析天平準(zhǔn)確稱取重量后，加入9倍的0.9%氯化鈉溶液,制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿，4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min(離心半徑為6 cm),取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用硝酸還原酶法測(cè)定NO水平,用化學(xué)比色法測(cè)定iNOS活性。

1.2.7肺組織KLF6表達(dá)水平的測(cè)定每0.01～0.02 g肺組織加入100～200 μl RIPA裂解液和1～2 ml PMSF，用剪刀剪碎肺組織，冰浴上超聲10 s，停20 s，反復(fù)20次，直至組織均勻，冰上靜置20 min，4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min(離心半徑為6 cm)，取上清液后經(jīng)BCA法定量。取40 g蛋白上樣，完成一抗、二抗孵育后，加ECL顯色劑顯色，圖像掃描分析條帶,以灰度值表示KLF6的相對(duì)表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1外觀觀察對(duì)照組小鼠肺外觀呈粉紅色,無(wú)明顯異常改變；低感染組小鼠3 h時(shí)可見(jiàn)肺組織表面散在點(diǎn)狀出血，9、24 h肺體積增大,呈暗紅色,且有片狀出血。

2.2病理學(xué)觀察光鏡下可見(jiàn)低感染組小鼠肺組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡隔增厚，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，局部有肺泡膨脹不全或肺泡塌陷,并擴(kuò)散到肺間質(zhì)內(nèi)，24 h時(shí)炎癥改變最為嚴(yán)重；而對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)清晰，肺泡間隔均一，肺泡、肺間質(zhì)內(nèi)無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1，本文彩圖見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

注：a為對(duì)照組肺組織病理切片，b～d分別為低感染組3、9、24 h肺組織病理切片

圖1兩組小鼠肺組織病理變化(HE染色，×400)

Figure 1Pathological changes of lung tissue of two groups

2.3肺組織濕干重之比3 h時(shí),對(duì)照組和低感染組肺組織濕干重之比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；9、24 h時(shí)，低感染組肺組織濕干重之比大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.4凋亡指數(shù)低感染組不同時(shí)間肺組織凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織凋亡指數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05,見(jiàn)表2)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著劑量的增加，肺組織凋亡指數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05,見(jiàn)表3)。

Table 1Comparison of wet and dry weight ratio between control group and low-infection group at different time points

組別只數(shù)3h9h24h對(duì)照組54.49±0.304.55±0.234.70±0.38低感染組54.77±0.166.38±1.087.94±1.29t值1.7803.7065.370P值0.1120.0210.006

Table 2Comparison of lung tissue apoptosis index of low-infection group among different time points

時(shí)間(h)凋亡指數(shù)316±2924±3a2434±3abF值54.520P值<0.001

注：與3 h比較，aP<0.05；與9 h比較，bP<0.05

Table 3Comparison of lung tissue apoptosis index at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

組別只數(shù)凋亡指數(shù)對(duì)照組58±1低感染組524±3a中感染組532±3ab高感染組541±3abcF值132.469P值<0.001

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與低感染組比較，bP<0.05；與中感染組比較，cP<0.05

2.5肺組織中NO水平和iNOS活性比較3、9、24 h時(shí)，低感染組肺組織NO水平、iNOS活性均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表4、5)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織NO水平、iNOS活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，低感染組、中感染組和高感染組肺組織NO水平、iNOS活性高于對(duì)照組，中感染組和高感染組肺組織iNOS活性高于低感染組，高感染組肺組織iNOS活性高于中感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表6)。

2.6肺組織KLF6表達(dá)水平比較低感染組不同時(shí)間肺組織KLF6表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織KLF6表達(dá)水平呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05，見(jiàn)表7)。不同劑量銅綠假單胞菌感染9 h后肺組織KLF6表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著劑量的增加，肺組織KLF6表達(dá)水平呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(P<0.05，見(jiàn)表8)。

Table 4Comparison of NO level between control group and low-infection group at different time points

組別只數(shù)3h9h24h對(duì)照組51.13±0.521.40±0.39 1.66±0.39 低感染組52.84±0.368.43±1.1213.69±1.44t值6.10713.21718.059P值<0.001<0.001<0.001

Table 5Comparison of iNOS activity between control group and low-infection group at different time points

組別只數(shù)3h9h24h對(duì)照組50.21±0.110.25±0.150.31±0.10低感染組50.56±0.060.93±0.221.61±0.12t值6.1945.75918.779P值<0.001<0.001<0.001

Table 6Comparison of NO level and iNOS activity at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

組別只數(shù)NO(mmol/gprot)iNOS活性(U/mgprot)對(duì)照組51.40±0.390.25±0.15低感染組58.43±1.12a0.93±0.22a中感染組59.57±1.25a1.24±0.19ab高感染組511.07±1.47a1.64±0.23abcF值71.30042.186P值<0.001<0.001

注：NO=一氧化氮，iNOS=誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與低感染組比較，bP<0.05；與中感染組比較，cP<0.05

Table 7Comparison of the KLF6 expression of low-infection group among different time points

時(shí)間(h)KLF6349.52±2.04957.64±3.84a2469.01±3.50abF值46.130P值<0.001

注：KLF6=Krupple樣因子6；與3 h比較，aP<0.05；與9 h比較，bP<0.05

Table 8Comparison of KLF6 expression at 9 h among infections by different dosages of pseudomonas aeruginosa

組別只數(shù)KLF6對(duì)照組541.64±2.62低感染組557.64±3.84a中感染組569.57±3.01ab高感染組585.66±5.18abcF值120.520P值<0.001

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與低感染組比較，bP<0.05；與中感染組比較，cP<0.05

3討論

銅綠假單胞菌廣泛存在于土壤、水、空氣，以及正常人的皮膚、呼吸道、腸道，在人體是一種條件致病菌，易感染免疫力低下人群。由于人口老齡化、HIV廣泛傳播以及結(jié)核病復(fù)燃的趨勢(shì)，使得免疫力低下人群廣泛存在，加之抗生素濫用，面臨難治性銅綠假單胞菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。

KLF6是Sp/Kruppel 樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，能夠參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程，并與腫瘤等多種疾病有關(guān)[6]。有研究表明，KLF6基因的表達(dá)受到多種生理過(guò)程的調(diào)控，并且被誘導(dǎo)表達(dá)的KLF6能調(diào)節(jié)應(yīng)激過(guò)程[7-8]。BOTELLA等[9]研究進(jìn)一步闡明了肝星狀細(xì)胞的激活、結(jié)構(gòu)基因及細(xì)胞因子的刺激能誘導(dǎo)KLF6表達(dá)迅速增高。在氰化鈉誘導(dǎo)的缺氧時(shí)，原發(fā)性T淋巴細(xì)胞中KLF6的iNOS啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)增加，導(dǎo)致增加內(nèi)源性iNOS基因的表達(dá)，釋放更多的NO[10]。本研究中，小鼠感染銅綠假單胞菌后，肺組織明顯充血、水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織病理改變?cè)街?，濕干重之比也越高，KLF6表達(dá)水平升高，iNOS活性升高，NO水平升高，細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，說(shuō)明銅綠假單胞菌感染肺組織可誘導(dǎo)KLF6的表達(dá)，有可能通過(guò)調(diào)控iNOS產(chǎn)生NO增加細(xì)胞凋亡率。為進(jìn)一步驗(yàn)該推論，本研究對(duì)小鼠注射不同劑量銅綠假單胞菌，而隨著劑量的增加，KLF6表達(dá)水平升高，iNOS活性及NO水平亦明顯升高，進(jìn)一步支持KLF6有可能通過(guò)調(diào)控iNOS產(chǎn)生NO增加細(xì)胞凋亡率。近年研究表明，NO的抗菌活性是通過(guò)作為吞噬細(xì)胞衍生的氧化劑而體現(xiàn)的，已知因素包括部分細(xì)胞因子和微生物產(chǎn)品調(diào)節(jié)iNOS的水平，iNOS活性的重要性是與宿主的防御和炎性反應(yīng)一致[11]。

綜上所述，隨著肺組織炎癥的加重，肺組織KLF6表達(dá)水平升高，且隨著iNOS活性和NO水平升高，細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，提示銅綠假單胞菌感染能誘導(dǎo)KLF6的表達(dá)，并有可能通過(guò)iNOS調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為治療銅綠假單胞菌感染提供新的思路。

作者貢獻(xiàn)：喻志芳進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；韓彬進(jìn)行課題實(shí)施、評(píng)估、資料收集；柴文戍進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

參考文獻(xiàn)

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(本文編輯：吳立波)

KLF6 and iNOS Regulated Apoptosis During Pseudomonas Aeruginosa Lung Infection in Mice

YUZhi-fang,HANBin,CHAIWen-shu.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

【Abstract】ObjectiveTo research the changes of KLF6 expression in lung tissue with pseudomonas aeruginosa infection and investigate the mechanism of KLF6 and iNOS regulated apoptosis during pseudomonas aeruginosa lung infection in mice.MethodsFrom October to December in 2014,30 mice were randomly divided into control group and low-infection group,with 15 mice in each group.The low-infection group was injected with pseudomonas aeruginosa by 1.0×107 CFU to make models;5 mice were randomly selected respectively at 3,9 and 24 hours.Other 10 mice were divided into medium-infection group and high-infection group,with 5 mice in each group.Medium-infection group and high-infection group were infected with pseudomonas aeruginosa by 5.0×107 CFU and 1.0×108 CFU respectively,and samples were obtained 9 hours later.At each time point mentioned above,animals were killed to perform sterile separation of their lung tissue,and litigation was conducted on the left lung to determine wet and dry weight ratio.Lung tissue apoptosis index was detected using TUNEL method,and NO level was determined using nitrale reduetase method,iNOS activity was determined by chemical colorimetry.The KLF6 expression of lung tissue was detected by Western blotting.ResultsUsing the microscope,we observed much inflammatory cell infiltration,thickened alveolar septa,destroyed structure of the alveolar wall,and local alveolar atelectasis or alveolar collapse spreading to pulmonary interstitium;the inflammatory changes became the severest at 24 h.At 3 h,control group and low-infection group were not significantly different in wet and dry weight ratio(P>0.05);at 9 and 24 h,low-infection group was higher than control group in wet and dry weight ratio(P<0.05).There were significant differences in the lung tissue apoptosis index of low-infection group among different time points(P<0.05).There were significant differences in the lung tissue apoptosis index among different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused at 9 h(P<0.05).At 3,9 and 24 h,the low-infection group was higher than control group in NO level and iNOS activity(P<0.05).Different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused significant differences in NO level and iNOS activity at 9 h(P<0.05).There were significant differences in KLF6 expression of low-infection group among different time points(P<0.05).Different dosages of pseudomonas aeruginosa infection caused significant differences in KLF6 expression at 9 h(P<0.05).ConclusionPseudomonas aeruginosa infection can induce the expression of KLF6,and may mediate cell apoptosis by the regulation of iNOS.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa；KLF6；Nitric oxide synthase；Apoptosis

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014022015，20092189)

通信作者：柴文戍，121001遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科；E-mail：cws1964@163.com

【中圖分類號(hào)】R 378.991

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.20.016

(收稿日期：2015-11-11；修回日期：2016-03-24)