夏 陽，朱慶超，汪 昱，彭佳遠(yuǎn)，錢海鑫

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·論著·

高脂飲食引發(fā)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性研究

夏 陽，朱慶超，汪 昱，彭佳遠(yuǎn)，錢海鑫

200233江蘇省蘇州市，蘇州大學(xué)(夏陽)；上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院外科(朱慶超，汪昱，彭佳遠(yuǎn))；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科(錢海鑫)

【摘要】目的采用高脂飲食干預(yù)結(jié)直腸癌模型大鼠，觀察其結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及腸道菌群結(jié)構(gòu)改變情況，分析高脂飲食引發(fā)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性。方法2014年9月—2015年9月，選取4周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠120只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：普通飲食+乙二胺四乙酸(EDTA)非誘導(dǎo)腫瘤組(SDC組)、普通飲食+1,2-二甲基肼(DMH)誘導(dǎo)腫瘤組(SDT組)、高脂飲食+EDTA非誘導(dǎo)腫瘤組(HFDC組)、高脂飲食+DMH誘導(dǎo)腫瘤組(HFDT組)，每組30只。SDC組和SDT組大鼠給予含13.5%脂肪的普通飼料，HFDC組和HFDT組大鼠給予含45.0%脂肪的高脂飼料。SDT組和HFDT組大鼠給予40 mg/kg DMH腹腔注射，1次/周，連續(xù)注射10周；SDC組和HFDC組大鼠給予等量的EDTA+0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。獲取大鼠整段結(jié)直腸，收集大鼠腸道糞便樣本，病理學(xué)檢查結(jié)直腸組織，利用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行基因組DNA抽提，然后進(jìn)行基因組DNA鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增16S rRNA V3可變區(qū)，采用焦磷酸測序和生物信息學(xué)分析比較高脂飲食與普通飲食干預(yù)下腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異及其與結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果HFDT組平均結(jié)直腸癌數(shù)目多于SDT組〔(3.0±0.4)與(2.0±0.4),t=2.143,P=0.038〕。焦磷酸測序結(jié)果分析顯示，4組大鼠Shannon多樣性指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SDC組、SDT組大鼠Shannon多樣性指數(shù)高于HFDT組(P<0.05)。SDC組檢測到1 407個(gè)門、134 581個(gè)屬菌群；SDT組檢測到808個(gè)門、128 582個(gè)屬菌群；HFDC組檢測到1 519個(gè)門、125 197個(gè)屬菌群；HFDT組檢測到896個(gè)門、91 957個(gè)屬菌群。基于光轉(zhuǎn)換單位(OTU)群落聚類分析結(jié)果顯示，SDT組厚壁菌門、放線菌門、螺旋體門相對(duì)豐度較SDC組降低，擬桿菌門、梭桿菌門相對(duì)豐度較SDC組升高(P<0.05)；HFDT組厚壁菌門相對(duì)豐度較HFDC組降低，變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門相對(duì)豐度較HFDC組升高(P<0.05)；HFDT組放線菌門相對(duì)豐度較SDT組降低，梭桿菌門相對(duì)豐度較SDT組升高(P<0.05)。結(jié)論高脂飲食干預(yù)下結(jié)直腸癌誘導(dǎo)大鼠發(fā)生腫瘤的數(shù)量多于普通飲食的結(jié)直腸癌誘導(dǎo)大鼠，高脂飲食能夠引起腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，增加多種潛在性致病菌，特別是梭桿菌門，提示高脂飲食及其導(dǎo)致的腸道菌群結(jié)構(gòu)改變?cè)诮Y(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中有一定的促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤；膳食,高脂；菌群失調(diào)

夏陽，朱慶超，汪昱，等.高脂飲食引發(fā)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(20)：2473-2480.[www.chinagp.net]

XIA Y,ZHU Q C,WANG Y,et al.Relationship between the intestinal flora structure changing and the occurrence of colorectal cancer by the intervention of high-fat diet[J].Chinese General Practice，2016，19(20)：2473-2480.

目前，結(jié)直腸癌已成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率第3位的惡性腫瘤，而且預(yù)后不佳、病死率較高[1-2]。近期，流行病學(xué)研究已經(jīng)為高脂飲食與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)升高之間的相關(guān)性提供了新的證據(jù)[3]。盡管高脂飲食能夠增加罹患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的具體機(jī)制尚不清楚，但是有學(xué)者指出兩者之間的相關(guān)性與癌基因表達(dá)增強(qiáng)[4]、膽汁酸的分泌[5]、氧化應(yīng)激[6]以及腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，從而最終形成了促癌微環(huán)境有關(guān)[7-8]。人體腸道內(nèi)微生物群落被認(rèn)為由至少1014個(gè)細(xì)菌組成，這些菌群由超過1 000種、人均150種的細(xì)菌組成[9]。盡管目前此方面的研究相對(duì)較少，但是越來越多的證據(jù)表明腸道內(nèi)菌群在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[10-12]。檢測人體微生物的高通量測序技術(shù)已經(jīng)為揭示正常個(gè)體內(nèi)和罹患各種疾病狀態(tài)下微生物的種、系、型鑒定做出了巨大的貢獻(xiàn)[13-14]。然而，絕大多數(shù)有關(guān)腸道微生物與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)之間的研究是人群內(nèi)的相關(guān)性研究，且對(duì)于研究者而言，既要排除人群背景差異，又要單獨(dú)分析高脂飲食導(dǎo)致結(jié)直腸癌人群腸道菌群改變的研究十分困難。因此，使用相同背景的模型動(dòng)物，并建立能夠模擬人群結(jié)直腸癌發(fā)病過程的結(jié)直腸癌模型動(dòng)物，就為單獨(dú)分析高脂飲食對(duì)結(jié)直腸癌的影響提供了有利的實(shí)驗(yàn)工具。本研究利用化學(xué)致癌劑1,2-二甲基肼(DMH)誘導(dǎo)Wistar大鼠發(fā)生結(jié)直腸癌，并加以高脂飲食干預(yù)，進(jìn)而對(duì)腸道糞便樣本中16S rRNA進(jìn)行了焦磷酸測序，通過生物信息學(xué)分析，以期篩選出在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用的菌群。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2014年9月—2015年9月選取4周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠120只，購自上海Shriek實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，體質(zhì)量180～200 g，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境中。動(dòng)物日常護(hù)理和實(shí)驗(yàn)條件參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施(GB 14925-2001)》[15]，本研究通過蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)證。

1.2飼料及主要試劑含13.5%脂肪的普通飼料購于美國LabDiet公司(St.Louis,MO,USA)，含45.0%脂肪的高脂飼料購于美國Research Diets公司(New Brunswick,NJ,USA)；DMH購于Sigma-Aldrich公司(美國)，QIAamp DNA Mini Kit試劑盒、QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒購于Qiagen公司(德國)，RNA引物購于上海英駿生物科技有限公司，F(xiàn)as tPfu Polymerase聚合酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen Biotech)，AxyPrep DNA Gel提取試劑盒購于Axygen公司(美國)，GS FLX Tianium SV emPCR試劑盒、GS FLX Tianium Filters SV試劑盒購于Roche公司(瑞士)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理所有大鼠經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：普通飼料+乙二胺四乙酸(EDTA)非誘導(dǎo)腫瘤組(SDC組)、普通飼料+DMH誘導(dǎo)腫瘤組(SDT組)、高脂飼料+EDTA非誘導(dǎo)腫瘤組(HFDC組)、高脂飼料+DMH誘導(dǎo)腫瘤組(HFDT組)，每組30只。SDC組和SDT組大鼠給予含13.5%脂肪的普通飼料；HFDC組和HFDT組大鼠給予含45.0%脂肪的高脂飼料。SDT組和HFDT組大鼠給予40 mg/kg DMH腹腔注射，1次/周，連續(xù)注射10周；SDC組和HFDC組大鼠給予等體積的0.9%氯化鈉溶液+0.01%EDTA腹腔注射，1次/周，連續(xù)注射10周。

1.4取材第12、14、16、18、20周每組采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取3只大鼠處死，第22周將各組剩余大鼠全部處死。每只大鼠腹腔注射氨芐噻嗪15 mg/kg+克他命100 mg/kg麻醉，完全麻醉后，心臟采血至大鼠死亡，腹部十字切口剖開腹腔，獲取大鼠整段結(jié)直腸，將結(jié)直腸放置于無菌巾單上，腫瘤組織完整取材，并獲取腸道糞便樣本。以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗腸道，將結(jié)直腸組織放于10%甲醛溶液固定，用于組織學(xué)檢查明確病理性質(zhì)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1結(jié)直腸組織病理學(xué)檢查將普通載玻片放入防脫片劑——3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APES)工作液(用時(shí)配制)中停留20～30 s，取出后稍停，放入純丙酮溶液以去除載玻片中未結(jié)合的APES。通風(fēng)櫥中晾干，即制備完成防脫載玻片，裝盒備用，注意防塵；固定后的結(jié)直腸組織依次經(jīng)過脫水、透明、透蠟、包埋、切片、展片、貼片(貼于防脫載玻片上)、脫蠟、復(fù)水后，用0.5%伊紅乙醇溶液對(duì)比染色30 s～1 min,75%乙醇漂洗5～10 min,95%乙醇溶液中浸泡10 min×2次(室溫)，100%乙醇中浸泡10 min×2次(室溫)，100%二甲苯浸泡10 min×2次(室溫)后，再經(jīng)過分化、漂洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封固以完成蘇木素-伊紅(HE)染色；最后進(jìn)行切片判讀：病理切片的判讀由兩位資深病理專家單獨(dú)進(jìn)行評(píng)定，并以最終達(dá)成一致意見為準(zhǔn)。

1.5.2基因組DNA抽提使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行基因組DNA抽提：稱取500 mg玻璃珠于2 ml離心管中，加入0.2～1.0 g糞便樣本，再加入1 ml SLX Mlus Buffer，用最大速度(3 000 r/min)渦旋3～5 min，以充分溶解糞便樣本；混合后70 ℃溫育10 min，并以10 000 r/min離心5 min(離心半徑為10 cm)，然后轉(zhuǎn)移上清液于1個(gè)新的2 ml離心管中并加入0.7倍體積的異丙醇，顛倒混勻20～30次，如果樣本DNA濃度過低，于-20 ℃放置1 h，取出上清液，把離心管倒置在吸水紙上1 min，吸干液體，不必干燥DNA沉淀，真空完全冷凍干燥后，將DNA沉淀溶于100 μl無菌水或者TE緩沖液中，加入10 μl 20 mg/L無DNA酶的核糖核酸酶A(RNAaseA)，37 ℃溫育30 min，得到總的DNA液，各取2 μl用1%(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度與完整性，并取2 μl用Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader(Bio Tek,USA)測定DNA的濃度。所有提取的DNA樣本置于-20 ℃冷凍保存，用于后續(xù)分析。

1.5.3基因組16S rRNA V3可變區(qū)PCR擴(kuò)增和焦磷酸測序每組采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10只大鼠，利用454焦磷酸測序方法深度分析各組腸道菌群的多樣性，首先需要對(duì)腸道菌群基因組16S rRNA V3可變區(qū)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物為腸道菌群16S rRNA V3的通用引物27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，533R 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′。為實(shí)現(xiàn)多樣本的高通量測序，需要合成帶有“5′ 454 A/B接頭-特異引物3′”的融合引物，A端為測序端，需要加標(biāo)簽，B端引物可共用。本實(shí)驗(yàn)在引物兩端加上了測序接頭(接頭A 5′-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3′，接頭B 5′-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3′)和Barcode標(biāo)簽，Barcode標(biāo)簽為不同樣本的唯一標(biāo)識(shí)號(hào)，由10個(gè)堿基組成，根據(jù)Roche公司官網(wǎng)(www.454.com)指導(dǎo)的Barcode標(biāo)簽設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了所使用的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增在ABI GeneAmp?9700反應(yīng)儀(Applied Biosystems,USA )上進(jìn)行，經(jīng)過PCR擴(kuò)增以后，每個(gè)磁珠含有成百萬單一序列的DNA簇，乳液擴(kuò)增液經(jīng)打破，DNA雙鏈變性，使每個(gè)磁珠帶有單一序列單鏈DNA簇。將磁珠和測序試劑放入含有350萬個(gè)光纖小孔的Pico Titer Plate板中，光纖小孔與磁珠直徑相近，保證了每個(gè)孔含有一個(gè)磁珠，然后Pico Titer Plate板上Roche 454 GS FLX測序平臺(tái)進(jìn)行檢測。根據(jù)堿基配對(duì)時(shí)釋放的焦磷酸將熒光素氧化而釋放的光信號(hào)，讀取序列的生物學(xué)信息。

1.5.4生物信息學(xué)分析利用已經(jīng)建立的流程和程序?qū)⒃夹蛄懈鶕?jù)每個(gè)標(biāo)本的識(shí)別標(biāo)記(Barcode標(biāo)簽)及引物序列進(jìn)行整理,去掉低質(zhì)量的序列，并將其分配至每個(gè)樣本之中。對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控，符合以下標(biāo)準(zhǔn)的序列予以保留：兩端引物和Barcode標(biāo)簽完全匹配；兩端引物不完全匹配(部分堿基錯(cuò)配時(shí))，用Mothur在序列中搜索引物，設(shè)置字長，能夠找到匹配引物的序列予以保留；引物均完整時(shí)，兩端Barcode標(biāo)簽的編輯區(qū)域(插入、刪除、缺失、錯(cuò)配)不超過1個(gè)堿基；序列中不確定堿基的數(shù)目少于2個(gè)；序列長度大于100 bp。經(jīng)以上步驟可以得到合格的有效序列?；诠廪D(zhuǎn)換單位(Optical Transform Unit，OTU)群落聚類分析結(jié)果〔OTU是在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元(品系、屬、種、分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志。要了解一個(gè)樣本結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對(duì)序列進(jìn)行歸類操作(cluster)。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組就是一個(gè)OTU〕，對(duì)測序深度進(jìn)行檢測，計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)(用來估算樣本中微生物多樣性指數(shù)之一，Shannon多樣性指數(shù)越大，說明群落多樣性越高)。利用各組中每一個(gè)樣本OTU的相對(duì)豐度信息構(gòu)建非加權(quán)的Unifrac距離矩陣，基于Unifrac距離矩陣進(jìn)行主成分分析(PCA)，PCA是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的技術(shù)，可以有效地找出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)；通過分析不同樣本中OTU(97%相似度水平)組成可以反映樣本間的差異和距離，PCA運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)軸上，坐標(biāo)軸能夠最大反映方差值的兩個(gè)特征值；如樣本組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。

“一個(gè)人對(duì)世界的看法相當(dāng)程度上來自他對(duì)他所在的家庭的看法，說得更確切些，個(gè)人的體驗(yàn)和人生經(jīng)歷，尤其是童年時(shí)代的生命感覺(印象)，決定了他日后的世界觀。一個(gè)人會(huì)最終脫離對(duì)母親的依賴和父親的權(quán)威，成為自己的父母，從而使人的靈魂成長，達(dá)到成熟。”[7]53費(fèi)洛姆的觀點(diǎn)在卡夫卡身上很說明問題，從某種程度上說，卡夫卡從未真正意義上地長大和成年，他絕不是能夠主宰自己命運(yùn)的強(qiáng)者。他不自主地受到父親的巨大影響，深陷其中；他終生在作品中表現(xiàn)出對(duì)父親巨大影響的無可逃匿。

2結(jié)果

2.14組不同時(shí)間結(jié)直腸癌檢出情況第12周即已發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，其中SDT組3只被處死大鼠中1只發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，HFDT組2只發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，SDC組和HFDC組大鼠均未發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌；結(jié)直腸癌主要集中出現(xiàn)于第14周以后，組織學(xué)病理切片檢查均證實(shí)為腺瘤/癌(見表1)。SDT組和HFDT組大體形態(tài)可見結(jié)直腸黏膜上出現(xiàn)散在息肉狀贅生物，尤以HFDT組還同時(shí)合并潰瘍狀病理損傷。經(jīng)組織學(xué)切片和HE染色證實(shí)，腸黏膜上出現(xiàn)的贅生物和潰瘍?yōu)椴煌只潭鹊慕Y(jié)直腸瘤/癌，以腺癌為主要病理類型(見圖1、2，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。通過肉眼仔細(xì)觀察全結(jié)直腸黏膜面，以直徑為1 mm及以上的贅生物或潰瘍物計(jì)為結(jié)直腸癌，結(jié)果顯示，HFDT組平均結(jié)直腸癌數(shù)目多于SDT組〔(3.0±0.4)與(2.0±0.4)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.143,P=0.038)。

表14組不同時(shí)間結(jié)直腸癌檢出情況(n/N)

Table 1The number of rats with CRC in different time period in four groups

組別第12周第14周第16周第18周第20周第22周aSDC組0/30/30/30/30/30/15SDT組1/31/32/33/33/312/13HFDC組0/30/30/30/30/30/15HFDT組2/31/33/33/33/312/12

注：n=檢出結(jié)直腸癌大鼠數(shù)；N=該組處死大鼠總數(shù)；SDC組為普通飼料+乙二胺四乙酸非誘導(dǎo)腫瘤組，SDT組為普通飼料+1,2-二甲基肼誘導(dǎo)腫瘤組，HFDC組為高脂飼料+乙二胺四乙酸非誘導(dǎo)腫瘤組，HFDT組為高脂飼料+1,2-二甲基肼誘導(dǎo)腫瘤組；a第22周處死各組剩余大鼠，SDC組15只；SDT組死亡2只，剩余13只；HFDC組15只；HFDT組死亡3只，剩余12只

注：SDC組為普通飼料+乙二胺四乙酸非誘導(dǎo)腫瘤組，SDT組為普通飼料+1,2-二甲基肼誘導(dǎo)腫瘤組，HFDC組為高脂飼料+乙二胺四乙酸非誘導(dǎo)腫瘤組，HFDT組為高脂飼料+1,2-二甲基肼誘導(dǎo)腫瘤組；箭頭所指為結(jié)直腸黏膜中息肉狀或潰瘍狀腺癌

圖14組大鼠結(jié)直腸大體形態(tài)

Figure 1The general form of rats′ colorectum in four groups

2.2焦磷酸測序結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)共生成51 123個(gè)OTU、40個(gè)標(biāo)本平均每個(gè)標(biāo)本1 278個(gè)OTU。Good′s coverage指數(shù)分析顯示，各組的測序覆蓋率均超過了94.50%，提示本次測序的16S rRNA序列代表了各組中絕大多數(shù)菌群的種、系、型，覆蓋率較高。稀釋性曲線所示，在此測序深度下，每個(gè)樣本的Shannon多樣性指數(shù)的測定則已經(jīng)達(dá)到了穩(wěn)定(見圖3)。4組大鼠Shannon多樣性指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中SDC組、SDT組大鼠Shannon多樣性指數(shù)高于HFDT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SDC組與SDT組，SDC與HFDC組，SDT組與HFDC組，HFDC組與HFDT組大鼠Shannon多樣性指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表2　4組大鼠Shannon多樣性指數(shù)比較

注：與SDC組比較，aP<0.05；與SDT組比較，bP<0.05

2.34組大鼠菌群整體結(jié)構(gòu)分析從圖4可看出腫瘤組與非腫瘤組的菌群之間存在著共有部分，此部分亦可認(rèn)為是與腸道組織功能相關(guān)的基礎(chǔ)菌群，該分析的前兩個(gè)主成分(PC1,PC2)分別解釋了總變量的37.19%和22.77%?；贠TU(97%相似度水平)相對(duì)豐度的PCA也揭示了SDT組和SDC組之間的菌群結(jié)構(gòu)存在差異(PC1=47.67%,PC2=25.88%)。與此同時(shí)，雖然HFDC組和HFDT組之間、SDC組和HFDC組之間的菌群結(jié)構(gòu)存在著某些重疊，但仍可見到其之間的整體構(gòu)成存在差異(PC1、PC2分別為：HFDC組和HFDT組，52.49%、25.58% ；HFDT組和SDC組，51.96%、33.55%)。此外，SDT組和HFDT組之間的菌群整體結(jié)構(gòu)存在差異(PC1=50.25%，PC2=22.00%)。

2.44組大鼠菌群檢測情況SDC組檢測到1 407個(gè)門、134 581個(gè)屬菌群；SDT組檢測到808個(gè)門、128 582個(gè)屬菌群；HFDC組檢測到1 519個(gè)門、125 197個(gè)屬菌群；HFDT組檢測到896個(gè)門、91 957個(gè)屬菌群。4組大鼠門水平相對(duì)豐度排名前十位菌群情況見圖5，4組大鼠屬水平相對(duì)豐度排名前十位菌群情況見圖6。

2.5SDC組與SDT組的門水平菌群相對(duì)豐度比較根據(jù)OTU分類分析的結(jié)果，SDC組與SDT組共包含前五位的門水平菌群為厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、螺旋體門、梭桿菌門。SDT組厚壁菌門、放線菌門、螺旋體門相對(duì)豐度較SDC組降低，擬桿菌門、梭桿菌門相對(duì)豐度較SDC組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

Table 3Comparison of relative abundance of bacterial flora between SDC group and SDT group

組別例數(shù)厚壁菌門放線菌門擬桿菌門螺旋體門梭桿菌門SDC組1040.2±1.930.2±2.125.0±1.51.8±0.11.6±0.2SDT組1025.6±2.524.3±1.535.0±2.21.2±0.117.3±1.6t值4.6882.2413.6944.0149.760P值<0.0010.0380.0020.001<0.001

2.6HFDC組與HFDT組的門水平菌群相對(duì)豐度比較根據(jù)OTU分類分析的結(jié)果，HFDC組與HFDT組共包含前五位的門水平菌群為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門。兩組放線菌門相對(duì)豐度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HFDT組厚壁菌門相對(duì)豐度較HFDC組降低，變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門相對(duì)豐度較HFDC組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

Table 4Comparison of relative abundance of bacterial phylum between HFDC group and HFDT group

組別例數(shù)厚壁菌門變形菌門擬桿菌門放線菌門梭桿菌門HFDC組1071.9±2.718.8±2.8 4.2±0.3 1.0±0.20HFDT組1020.4±1.528.4±2.230.7±2.41.6±0.422.6±1.8t值16.5202.74310.8901.4099.760P值<0.0010.013<0.0010.176<0.001

圖2　4組大鼠結(jié)直腸組織病理改變(HE染色)

注：A為稀釋性曲線，B為各樣本總Shannon多樣性指數(shù)曲線，C為SDC組Shannon多樣性指數(shù)曲線，D為SDT組Shannon多樣性指數(shù)曲線，E為HFDC組Shannon多樣性指數(shù)曲線，F(xiàn)為HFDT組Shannon多樣性指數(shù)曲線

圖3各樣本稀釋性曲線及Shannon多樣性指數(shù)曲線

Figure 3The rarefaction curve and Shannon multiple index curve of different samples

圖4　基于OTU(97%相似度水平)相對(duì)豐度的PCA

Table 5Comparison of relative abundance of bacterial phylum between SDT group and HFDT group

組別例數(shù)擬桿菌門變形菌門厚壁菌門放線菌門梭桿菌門SDT組1035.0±2.228.6±2.225.6±2.524.3±1.517.3±1.6HFDT組1030.7±2.428.4±2.220.4±1.5 1.6±0.4 22.6±1.8t值1.3240.0541.77814.6002.196P值0.2020.9580.092<0.0010.042

3討論

本研究使用DMH誘導(dǎo)大鼠結(jié)直腸癌模型，并加以高脂飲食干預(yù)，通過比較結(jié)直腸癌形成情況以及腸道菌群構(gòu)成，初步解析高脂飲食干預(yù)引發(fā)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)系。

目前，使用DMH誘導(dǎo)大鼠結(jié)直腸癌模型已被證實(shí)是一種可靠的、被廣泛認(rèn)可的動(dòng)物模型，與其他類似的模型相比，DMH誘導(dǎo)大鼠結(jié)直腸癌模型更接近人群自然狀態(tài)下結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，減少了諸如皮下移植瘤或尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞等伴隨的人工干預(yù)誤差[16-17]。因此，DMH誘導(dǎo)大鼠結(jié)直腸癌模型被廣泛用來評(píng)估環(huán)境或者飲食因素影響結(jié)直腸癌發(fā)病的研究。

圖5　4組大鼠門水平相對(duì)豐度排名前十位菌群情況

Figure 5Top ten bacterial phylum and their relative abundance in four groups

圖6　4組大鼠屬水平相對(duì)豐度排名前十位菌群情況

Figure 6Top ten bacterial genus and their relative abundance in four groups

關(guān)于腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與結(jié)直腸癌之間關(guān)系的研究，已有部分報(bào)道。如WEI等[18]曾報(bào)道使用誘癌劑誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生腸道癌前病變，并分析比較誘導(dǎo)組和對(duì)照組大鼠腸道菌群構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)存在明顯菌群結(jié)構(gòu)分離情況；TURNBAUGH等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食干預(yù)的大鼠腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的含量比值顯著升高；另有研究證實(shí)，在具有罹患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的人群結(jié)直腸黏膜中也存在著諸如腸桿菌科或擬桿菌屬亞種等潛在性致病菌的定植[20]；KASAI等[21]也報(bào)道，在結(jié)直腸癌患者中擬桿菌屬和普氏菌屬的豐度顯著高于健康人群等。

本研究結(jié)果顯示，HFDT組平均結(jié)直腸癌數(shù)目明顯多于SDT組。根據(jù)PCA前兩個(gè)主要成分PC1和PC2的結(jié)果，觀察到不同飲食干預(yù)組之間的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。本研究中，SDT組擬桿菌門、梭桿菌門相對(duì)豐度較SDC組升高，HFDT組擬桿菌門、梭桿菌門、變形菌門相對(duì)豐度較HFDC組升高；同時(shí)，HFDT組梭桿菌門較SDT組升高，放線菌門相對(duì)豐度較SDT組降低，提示結(jié)直腸癌大鼠腸道菌群中不同門水平相對(duì)豐度有升高也有降低，但梭桿菌門相對(duì)豐度在腫瘤組(SDT組和HFDT組)中均升高。提示高脂飲食在影響腸道菌群結(jié)構(gòu)方面有著重要的作用，且推測在高脂飲食干預(yù)的大鼠中較高的結(jié)直腸癌發(fā)生率與改變了的菌群結(jié)構(gòu)之間存在正相關(guān)，腸道菌群失衡是結(jié)直腸癌發(fā)病的一個(gè)重要致病因素。此外，本研究進(jìn)一步證實(shí)了在高脂飲食條件下某些在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用的潛在致病菌(特別是梭桿菌)的相對(duì)豐度明顯增加。值得注意的是，既然絕大多數(shù)的結(jié)直腸癌患者中能夠檢測到梭桿菌門相對(duì)豐度的升高，梭桿菌門具備了作為結(jié)直腸癌潛在診斷標(biāo)志物的特征。多種因素參與了正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞向結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)化過程，且越來越多的證據(jù)顯示腸道菌群與疾病的起始和進(jìn)展密切相關(guān)。研究顯示在結(jié)直腸癌組織中可檢出梭桿菌屬，其可能與炎癥性腸病(IBD)存在著密切的聯(lián)系，而IBD屬常見的結(jié)直腸疾病之一，且與結(jié)直腸癌的發(fā)生也有一定的相關(guān)性[22]?；谒髼U菌屬能夠誘導(dǎo)機(jī)體腸道炎性反應(yīng)[23]，進(jìn)而促進(jìn)其與人體結(jié)直腸上皮細(xì)胞黏附和侵入等，KOSTIC等[24]認(rèn)為梭桿菌屬能通過炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制而促進(jìn)結(jié)直腸癌形成，盡管目前還沒有找到人群研究中與結(jié)直腸癌之間相關(guān)性的直接證據(jù)，但后續(xù)新的研究應(yīng)該能解開其中的重要致病機(jī)制。

綜上所述，本研究揭示了高脂飲食引發(fā)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展之間的重要關(guān)系，但不足的是未涉及具體的作用機(jī)制研究，需在后續(xù)的研究中補(bǔ)充完善，為尋找新的結(jié)直腸癌干預(yù)、治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：夏陽、錢海鑫進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；朱慶超、汪昱、彭佳遠(yuǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；錢海鑫進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Relationship Between the Intestinal Flora Structure Changing and the Occurrence of Colorectal Cancer by the Intervention of High-fat Diet

XIAYang,ZHUQing-chao,WANGYu,etal.

SoochowUniversity,Suzhou200233,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of high-fat diet on the incidence of colorectal cancer(CRC) in an animal model,and to investigate the change of intestinal flora and the relationship with the occurrence of CRC.MethodsFrom September 2014 to September 2015,120 SPF male Wistar rats which were four weeks old were randomly divided into four groups:normal diet+EDTA not induced tumor group(SDC group);normal diet+DMH induced tumor group(SDT group);high fat diet+EDTA not induced tumor group(HFDC group);high fat diet+DMH induced tumor group(HFDT group).Each group included 30 rats.SDC group and SDT group were fed with normal diet which contained 13.5% fat while HFDC group and HFDT group were fed with high fat diet which contained 45.0% fat.SDT group and HFDT group were intraperitoneal injected with DMH 40 mg/kg every week for ten weeks,the SDC group and the HFDC group were intraperitoneal injected with 0.9% sodium chloride with EDTA at the same amount.Rats′ whole period of colorectum was taken and stool samples were collected.Tissues of colorectum was examined by athologist.Genomic DNA was extracted using the QIAamp DNA Mini Kit according to the manufacturer′s instructions.Afterwards,the determination of genomic DNA,PCR amplification of 16S rRNA V3 region and the pyrosequencing and bioinformatic analysis were performed in order to compare the differences of intestinal flora structure under high-fat diet and normal diet and the correlation between intestinal flora structure and CRC.ResultsThe average tumor numbers was higher in HFDT group than in SDT group 〔(3.0±0.4) and(2.0±0.4),t=2.143,P=0.038〕.Moreover,the result of pyrosequencing showed that the differences of Shannon diversity index among four groups were significant(P<0.05).The Shannon diversity index was higher in SDC group and SDT group than in HFDT group(P<0.05).In SDC group,1 407 bacteriophyta and 134 581 genuses were detected;In SDT group,808 bacteriophyta and 128 582 genuses were detected;In HFDT group,896 bacteriophyta and 91 957 genuses were detected,and in HFDC group 1 519 bacteriophyta and 125 197 genuses were detected.According to the result of OTU classification analysis,relative abundance of firmicutes，actinobacteria，and spirochaetes in SDT group were lower than in SDC group，relative abundance of bacteroides and fusobacterium in SDT group were higher than in SDC group(P<0.05).The relative abundance of firmicutes in HFDT group was lower than in HFDC group，relative abundance of bacteriodetes，fusobacteria and proteobacteria in HFDT group were higher than in HFDC group(P<0.05).Relative abundance of actinobacteria in HFDT group was lower than in SDT group,relative abundance of fusobacteria in HFDT group was higher than in SDT group(P<0.05).ConclusionHigh-fat diet increases the risk of CRC for rats in this study.The structure of intestinal flora changes through taking high fat diet and the relative abundance of multiple potential pathogenic bacteria also increases,especially for fusobacteria.High-fat diet may cause intestinal flora disorder which plays a certain role in the occurrence and development of CRC.

【Key words】Colorectal neoplasms；Diet,high-fat；Microbial dysbiosis

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81230057)

通信作者：錢海鑫，215006江蘇省蘇州市，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科；E-mail:qianhaixin1@hotmail.com

【中圖分類號(hào)】R 735.37

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.20.024

(收稿日期：2016-02-16；修回日期：2016-05-10)

·膳食與營養(yǎng)·