王建昌，姜彥芬，王 珅，王金鳳（河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊 050051）

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奶牛疣狀毛癬菌的分離鑒定及其耐藥性分析

王建昌，姜彥芬，王 珅，王金鳳
（河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊 050051）

摘 要：為了解奶牛皮膚真菌病的病原及其對(duì)常見抗真菌藥物的敏感性，給臨床治療提供依據(jù)，從具有皮膚真菌病癥狀奶牛病灶處的皮屑樣品中，使用沙氏培養(yǎng)基分離病原真菌，通過核糖體rDNA ITS序列對(duì)其分析鑒定。使用ATB FUNGUS 3真菌藥敏試紙條測(cè)定5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑及伏立康唑?qū)λ蛛x病原真菌的最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果表明，在沙氏培養(yǎng)基上分離到的10株中心蠟狀成堆、邊緣“杉樹狀”的真菌，經(jīng)ITS序列分析，鑒定為人獸共患性致病真菌——疣狀毛癬菌；所分離的疣狀毛癬菌對(duì)伏立康唑、伊曲康唑均為敏感，對(duì)氟康唑均為中介，而對(duì)兩性霉素 B及 5氟胞嘧啶均為耐藥；ITS序列分析可實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌的快速、準(zhǔn)確鑒定；伏立康唑、伊曲康唑?qū)Ρ狙芯恐蟹蛛x的疣狀毛癬菌具有良好的體外抗菌活性。

關(guān)鍵詞：皮膚真菌病；疣狀毛癬菌；ITS序列；耐藥性；人獸共患；分離鑒定

動(dòng)物皮膚真菌?。―ermatophytosis），又稱為皮癬（Tinea）或癬病（Ringworm），是一種人獸共患病，主要是由毛癬菌、小孢子菌和表皮癬菌屬等多種皮膚真菌引起毛發(fā)和皮膚角質(zhì)層的感染。牛癬病主要是由疣狀毛癬菌（Trichophyton verrucosum）引起的一種高度傳染性皮膚?。?-2］，多見于頭部、頸部和軀干側(cè)面，呈現(xiàn)直徑為10～50 mm的環(huán)狀區(qū)，被毛脫落，初期為紅色，結(jié)痂后呈現(xiàn)灰色，同周圍界限明顯［3］。牛癬病在世界范圍內(nèi)廣泛存在。在意大利中部20個(gè)農(nóng)場(chǎng)的294頭牛中，100%農(nóng)場(chǎng)存在癬病感染，87.7%的?？煞蛛x出疣狀毛癬菌［2］。癬病在日本牛群中也廣泛存在，疣狀毛癬菌的分離率為58.6%［4］。德國(guó)Kielstein等從14個(gè)牛群中分離到27株疣狀毛癬菌［5］。疣狀毛癬菌在伊朗中牛群的分離率為31.8%，是反芻動(dòng)物癬病的主要

目前隨著真菌感染率逐漸增高，大量新型抗真菌藥物不斷涌現(xiàn)，因此臨床耐藥菌株的出現(xiàn)，以及抗真菌藥物合理有效的使用已越來越被人們重視。評(píng)價(jià)抗真菌藥物敏感性的最基本方法之一是測(cè)定其最低抑菌濃度（MIC值）。抗真菌藥物的藥敏試驗(yàn)方法一般分為液體培養(yǎng)基稀釋法（常量法和微量法）、瓊脂培養(yǎng)基法（瓊脂稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法）以及由此改進(jìn)的E-test法和藥敏紙片法，還有比色法、流式細(xì)胞儀法、葡萄糖消耗法等其他方法。

疣狀毛癬菌是一種人獸共患性真菌，可以引起人的感染［10］。在伊朗［7］、中國(guó)［8］、美國(guó)［11-12］、加拿大［13］、澳大利亞［14］等國(guó)家均有因接觸癬病發(fā)病牛而導(dǎo)致人感染的病例，其具有明顯的職業(yè)性和十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究通過分析疣狀毛癬菌的核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）核苷酸序列，準(zhǔn)確鑒定了10株臨床分離的疣狀毛癬菌，并使用法國(guó)梅里埃ATB FUNGUS 3真菌藥敏試劑條測(cè)定其最小抑菌濃度MIC值（mg/L），為研究真菌感染情況，開展有效臨床治療，預(yù)防從業(yè)者感染提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病料來源

病料均來自河北2013—2014年具有不同程度皮膚真菌病癥狀的奶牛，共計(jì)34份。使用酒精棉球擦拭病灶的病健交界處，清除皮膚表面污垢，然后用手術(shù)刀片與皮膚呈45度角順毛輕輕刮取毛發(fā)、皮膚至滅菌的25%甘油中，直至輕微出血。取樣完畢后用碘酒處理取樣部位以防繼發(fā)感染。

1.2主要試劑與設(shè)備

沙氏培養(yǎng)基、氯霉素、放線菌酮、乳酸酚棉藍(lán)染色液均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；ATB FUNGUS 3真菌藥敏試劑條購(gòu)自生物梅里埃中國(guó)有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD 19-T Simple Vector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR儀（T Professional，Biometra）和凝膠成像系統(tǒng)（Fusion FX5-826，VIBER LOURMAT）。

1.3病原分離培養(yǎng)

將采集的樣本渦旋振蕩1 min，吸取0.1 mL上清液分別涂布于添加抗生素（含終濃度100 mg/L氯霉素、終濃度500 mg/L放線菌酮）的沙氏瓊脂平板（SDA）上，分別于37 ℃培養(yǎng)7 d。將SDA上出現(xiàn)的菌落分離純化。

1.4rDNA ITS序列分析

按照文獻(xiàn)［15］合成真菌ITS擴(kuò)增通用引物ITS5 （5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），提取分離培養(yǎng)后48 h的真菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS序列。反應(yīng)體系為：2× Taq PCR MasterMix，12.5 μL ；ITS 4 （10 μmol/L），0.5 μL；ITS 5（10 μmol/L），0.5 μL；模板DNA（100～300 ng），2 μL；ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物回收后連接pMD19- T Simple Vector，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并挑取克隆進(jìn)行測(cè)序。通過NCBI（www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序?qū)TS測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索和比對(duì)，并通過MEGA 5.0軟件使用鄰近法（NJ法）對(duì)分離真菌ITS序列和參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5真菌藥敏試驗(yàn)

使用 ATB FUNGUS 3 真菌藥敏試劑條測(cè)定分離真菌的最小抑菌濃度 MIC值（mg/L），包括5-氟胞嘧啶（5-FC，濃度為4～16 mg/L）、兩性霉素B （AMB，濃度為0.5～16 mg/L）、氟康唑（FCA，濃度為1～128 mg/L）、伊曲康唑（ITR，濃度為0.125～4 mg/L）和伏立康唑（VRC，濃度為0.06～8 mg/L）。

按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作：選擇沙氏培養(yǎng)基對(duì)疣狀毛癬菌進(jìn)行培養(yǎng)72 h，使用0.85%的生理鹽水制備相當(dāng)于2個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊膽腋∫骸?0 μL懸浮液轉(zhuǎn)移到含有ATB F2培養(yǎng)基的安培瓶中并混勻，將混勻后菌液按135 μL/孔接種至ATB試劑條，37℃培養(yǎng)72 h。將試劑條放在黑暗的背景下，肉眼讀取藥敏結(jié)果。以對(duì)照孔生長(zhǎng)良好，而含藥最高稀釋孔不生長(zhǎng)者為最小抑菌濃度的終點(diǎn)，即MIC值。參照文獻(xiàn)［16］中的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1真菌的分離與鑒定

在SDA平板上分離純化得到的10株真菌，均呈現(xiàn)中心蠟狀成堆，邊緣“杉樹狀”。對(duì)所有分離真菌進(jìn)行rDNA ITS片段擴(kuò)增，均得到約600 bp的單一清晰條帶。根據(jù)分離真菌ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果，及結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中疣狀毛癬菌（NCBI登錄號(hào)：AB443930、AF168126、KP455492、LN614523、KJ606084、Z98002）ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，分離真菌序列與疣狀毛癬菌參考序列明顯聚為一支（圖1），確定所分離真菌為疣狀毛癬菌。

圖1　NJ法構(gòu)建的分離真菌系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap值為1000）

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果

所分離的疣狀毛癬菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，均對(duì)5-氟胞嘧啶、兩性霉素B耐藥，對(duì)氟康唑?yàn)橹薪?，而?duì)伊曲康唑和伏立康唑均為敏感（表1）。

表1　10株疣狀毛癬菌ATB FUNGUS3藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

真菌核糖體DNA由核糖體基因及與之相鄰的間隔區(qū)組成。rDNA序列中內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）作為非編碼區(qū)變化相對(duì)較大，同時(shí)ITS片段大小適中，引物通用性強(qiáng)，擴(kuò)增成功率高，便于進(jìn)行高通量測(cè)序與分析，并能夠提供詳盡的系統(tǒng)學(xué)分析所需要的可遺傳性狀。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，真菌核糖體的rDNA ITS序列分析，可以實(shí)現(xiàn)真菌種屬的快速鑒定［17-18］。本研究通過對(duì)臨床分離真菌的ITS序列分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其種屬的準(zhǔn)確、快速鑒定。相對(duì)于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，基于ITS序列分析的真菌種屬鑒定技術(shù)所需時(shí)間更短，并能實(shí)現(xiàn)“非專家鑒定”。本研究從具有皮膚癬病的奶牛臨床樣品中分離得到10株疣狀毛癬菌，這與Papini［2］、Takatori［4］、Khosravi［6］、Aghamirian［7］、Ming［8］等國(guó)內(nèi)外學(xué)者的分離結(jié)果一致。

發(fā)生真菌感染后，及時(shí)進(jìn)行真菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)、明確病原學(xué)診斷和對(duì)抗菌藥物的敏感性、正確選用抗真菌藥物是真菌感染治療成功的關(guān)鍵。ATB FUNGUS 法由于其具有便利性、結(jié)果判讀客觀、易于標(biāo)準(zhǔn)化、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，在真菌體外藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用越來越廣泛［19-20］。本研究采用ATB FUNGUS3法，使用法國(guó)梅里埃公司試劑盒進(jìn)行疣狀毛癬菌體外藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)伊曲康唑和付立康唑均敏感，其中伊曲康唑的MIC為0.125 mg/L。崔鵬博采用NCCLS的M38-A方案對(duì)其分離的疣狀毛癬菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果是伊曲康唑的MIC在0.625～2.5 mg/L之間，是本研究結(jié)果的5 ～20倍，這可能是由于所分離的菌株不同，以及藥敏試驗(yàn)方法不同造成的。

疣狀毛癬菌是一種重要的人獸共患性真菌，其感染具有明顯的職業(yè)性。本研究基于真菌核糖體ITS序列分析實(shí)現(xiàn)了對(duì)疣狀毛癬菌的快速準(zhǔn)確鑒定，并通過ATB FUNGUS 3法確定了本研究中分離的疣狀毛癬菌的體外敏感性藥物-伊曲康唑和伏立康唑，為疣狀毛癬菌的鑒定治療和預(yù)防提供了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

中圖分類號(hào)：S852.661

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）01-0026-04

基金項(xiàng)目：河北出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（HE2013K032）病原菌［6-7］。我國(guó)新疆地區(qū)一處荷斯坦奶牛場(chǎng)的癬病發(fā)病率為20%［8］；崔云鵬從28例具有癬病癥狀的臨床樣品中分離到17株疣狀毛癬菌［9］。

Isolation and Identifi cation of Trichophyton Verrucosum in Cows and Analysis on Vitro Drug Resistance

Wang Jianchang，Jiang Yanfen，Wang Shen，Wang Jinfeng
（Technical Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shijiazhuang，Hebei 050051）

Abstract：In order to explore the dermatophyte situation of the dairy cows and the antifungal susceptibility，the hair and skin specimens were collected from the skin lesions of Holstein cows with the typical ringworm symptoms. The pathogens were isolated and identifi ed through ribosome DNA ITS sequence analysis. The MIC of 5-fl uorocytosine（5-FC），amphotericin B（AMB），fl uconazole （FCA），itraconazole （ITR）and voriconazole（VRC）were determined by ATB FUNGUS 3. The results showed that the isolated fungi all showed waxy raised center，fi rtree periphery. The fungi were identifi ed to be the zoonotic dermatophyte-Trichophyton verrucosum by ITS sequence analysis. The isolated Trichophyton verrucosum was sensitive to ITR and VRC，intermediate to FCA，and resistant to 5-FC and AMB. Trichophyton verrucosum could be identifi ed quickly and accurately by rDNA ITS sequence analysis. ITR and VRC demonstrated it had higher vitro antifungal activity.

Key words：dermatophytosis；Trichophyton verrucosum；ITS sequence；drug resistance；Zoonosis；isolation and identifi cation