宋躍君，譚 丹，，鄧國(guó)華，王昌建，朱春霞，張朝陽(yáng)，劉道新，黃建龍（.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙4004；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱5000）

?

湖南省洞庭湖區(qū)5株H6N6亞型禽流感毒株HA、NA基因的遺傳進(jìn)化分析

宋躍君1，譚 丹1，2，鄧國(guó)華2，王昌建1，朱春霞1，張朝陽(yáng)1，劉道新1，黃建龍1
（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙410014；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001）

摘 要：為了從分子生物學(xué)角度了解H6N6亞型禽流感病毒在湖南省洞庭湖區(qū)的變異特點(diǎn)和進(jìn)化規(guī)律，為該地區(qū)H6N6亞型禽流感的防控提供一些理論依據(jù)，對(duì)2012年在洞庭湖區(qū)分離的H6N6亞型禽流感毒株的HA、NA基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，并對(duì)所得序列進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)分離到的5株H6N6亞型禽流感毒株HA裂解位點(diǎn)為PQIETR↓GLF，均沒(méi)有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入，屬于低致病性病毒；5株病毒的HA和NA潛在的糖基化位點(diǎn)有一些差別，這些差別是否會(huì)引起其毒力和致病力上的差異還有待研究；從基因遺傳進(jìn)化關(guān)系來(lái)看，這些毒株與我國(guó)汕頭、廣西分離的毒株同源性較高。

關(guān)鍵詞：H6N6亞型禽流感；同源性；遺傳進(jìn)化

禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）傳染?。?］，禽流感病毒（AIV）根據(jù)致病力的不同可以分為高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和無(wú)致病性禽流感病毒。 H6亞型AIV最早分離于鴨，后來(lái)發(fā)現(xiàn)也能夠傳播給雞和鵝，可在不同宿主之間跨種傳播。近年來(lái)，H6亞型AIV在我國(guó)和其他一些國(guó)家及地區(qū)的野鳥(niǎo)和家禽中廣泛存在，其流行和傳播呈上升趨勢(shì)。2000年以來(lái)，H6亞型低致病性禽流感

1　材料

1.1毒株

5株H6N6亞型AIV均來(lái)自湖南省洞庭湖區(qū)活禽市場(chǎng)及鴨場(chǎng)的正常監(jiān)測(cè)樣品，由哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離保存，病毒命名為：A/DK/HuN/S1661/2012（H6N6）、A/DK/HuN/ S12223/2012（H6N6）、A/DK/HuN/S12236/2012 （H6N6）、A/DK/HuN/S12320/2012（H6N6）、A/EN/ HuN/S12267/2012（H6N6）。

1.2SPF雞胚

9～11日齡SPF雞胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2　方法

2.1病毒的增殖

將供試AIV按104～109梯度稀釋度接種10日齡SPF雞胚，48 h后取有血凝價(jià)（HA-HI試驗(yàn)）且病毒稀釋度最高的雞胚尿囊液作為下一次純化種毒，如此純化3次后，以最適合的稀釋度接種9～11日齡SPF雞胚，48 h后收取雞胚尿囊液，經(jīng)過(guò)HA-HI試驗(yàn)驗(yàn)證及無(wú)菌檢測(cè)后分裝，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的回收

根據(jù)GenBank中H3N8亞型AIV各基因片段序列選擇同源性最高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析鑒定結(jié)果，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。

2.3HA和NA基因組序列的測(cè)定

利用紫外透射儀測(cè)定PCR產(chǎn)物的濃度并按測(cè)序要求計(jì)算所需DNA量，PCR反應(yīng)結(jié)束后加入2.0μL的終止液。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物在終止反應(yīng)后加入95%冰乙醇60μL，混勻，于-20℃放置15min后，4℃下12000r/min離心20 min，小心棄去上清，加70μL70%冰乙醇，4℃下12000 r/min離心10min洗脫殘留的鹽，之后再重復(fù)操作一次，倒于紙上，室溫晾干，加入15μL甲酰胺，使DNA沉淀充分溶解，最后全部加入到測(cè)序板內(nèi)，并進(jìn)行高溫變性，采用ABI測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

2.4序列的拼接和分析

病毒各基因片段序列采用DNAStar軟件中Seqman程序?qū)y(cè)定的各個(gè)基因原始序列進(jìn)行拼接，采用MegAlign程序?qū)Ω鱾€(gè)基因片段進(jìn)行核苷酸以及氨基酸的同源性比較；應(yīng)用Mega 5軟件包對(duì)病毒各個(gè)基因進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的繪制與分析。

3　結(jié)果

3.1HA基因序列分析及遺傳進(jìn)化分析

在洞庭湖區(qū)市場(chǎng)和鴨場(chǎng)監(jiān)測(cè)樣品中分離的5株H6N6亞型毒株的HA開(kāi)放閱讀框?yàn)?701，編碼566個(gè)氨基酸。HA蛋白的裂解位點(diǎn)為PQIETR↓GLF，無(wú)多個(gè)連續(xù)堿性氨基酸的插入，屬于低致病性病毒。5株病毒的糖基化位點(diǎn)除A/DK/HuN/S12223/2012（H6N6）、A/DK/HuN/ S/2320/2012（H6N6）兩株毒沒(méi)有182（NNT）位點(diǎn)之外，其余三株均有8個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為26、27、39、182、306、311、498和557。對(duì)5株病毒可能的受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有的位點(diǎn)均保守，未發(fā)生突變（表1）。

將這5株病毒的HA基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，同源性在93.8%～99.6%之間。與2005年以后在我國(guó)汕頭、廣西分離的毒株及同期在越南鴨中分離的H6毒株均處于同一進(jìn)化分支。5株毒與該分支中參考序列核苷酸的同源性在93.4%～98.5%之間，該分離的毒株與2003年在汕頭野鳥(niǎo)中分離的病毒株A/Wild bird/Shantou/2853（H6N2）序列核苷酸同源性在93.8%～97.2%之間，與1997年在香港分離到的A/Teal/HongKong/W312/97（H6N1）毒株核苷酸的同源性在85.0%～87.2 %之間。從進(jìn)化示意圖1可以看出，2003年在汕頭野鳥(niǎo)中分離的A/ Wild bird/Shantou/2853（H6N2）毒株比該分支其他毒株進(jìn)化的更原始，可作為該分支的共同來(lái)源。

3.2NA基因序列分析及遺傳進(jìn)化分析

表1　H6N6亞型禽流感病毒HA基因特征位點(diǎn)氨基酸序列分析

圖1　H6N6亞型禽流感病毒的HA基因進(jìn)化樹(shù)

對(duì)這5株H6N6亞型禽流感毒株的NV基因序列分析，發(fā)現(xiàn)其NA基因并沒(méi)有頸部的缺失，但潛在的糖基化位點(diǎn)有一些差別，NA基因沒(méi)有62 （NHT）、67（NFT）位點(diǎn)，其中有2株沒(méi)有54 （NPT）位點(diǎn)（表2）。對(duì)其進(jìn)行遺傳演化分析，結(jié)果顯示，5株H6N6亞型毒株與以往在我國(guó)其他地區(qū)分離的H6N6毒株處于同一分支，核苷酸同源性在93.3%～99.7%之間，說(shuō)明本研究中的H6N6亞型毒株并沒(méi)有NA基因的重組。從進(jìn)化關(guān)系上看，分支中2005年從汕頭野鳥(niǎo)中分離的H6N6毒株比其他毒株的進(jìn)化關(guān)系更原始（圖2）。

4　討論

4.1HA是病毒毒力和宿主特異性的主要決定因素［7-8］，大多數(shù)高致病力毒株的HA在其裂解位點(diǎn)附近有多個(gè)堿性氨基酸插入，在無(wú)類胰蛋白酶的情況下就能發(fā)生裂解，造成感染禽全身系統(tǒng)衰竭死亡。分離的5株H6N6亞型禽流感毒株的HA裂解位點(diǎn)為PQIETR↓GLF，均沒(méi)有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入，屬于低致病性病毒。HA上潛在的糖基化位點(diǎn)是影響AIV毒力的因素之一［9］，A/DK/HuN/S12320/2012（H6N6）、A/DK/HuN/ S12223/2012（H6N6）兩株毒沒(méi)有182（NNT）糖基化位點(diǎn)。在對(duì)SPF雞致病性研究中發(fā)現(xiàn)，A/ DK/HuN/S12320/2012毒株不引起雞泄殖腔排毒，是否是由于該糖基化位點(diǎn)的缺失而引起該毒株的毒力減弱還需進(jìn)一步研究。

表2　H6N6亞型禽流感病毒NA基因特征位點(diǎn)氨基酸序列分析

圖2　H6N6亞型禽流感病毒的NA基因進(jìn)化樹(shù)

4.2對(duì)HA、NA基因序列進(jìn)行遺傳演化分析，發(fā)現(xiàn)其與我國(guó)汕頭、廣西分離的毒株同源性較高。湖南洞庭湖地區(qū)是“東亞-澳大利亞遷徙線”候鳥(niǎo)和我國(guó)候鳥(niǎo)遷徙的主要停歇地，汕頭、廣西等地也處在“東亞-澳大利亞遷徙線”上。張玉穩(wěn)［10］等人研究認(rèn)為，H6亞型AIV主要宿主是野鳥(niǎo)，野鳥(niǎo)的遷徙對(duì)H6亞型禽流感的散播起到很大作用。羅維玉［4］等人認(rèn)為H6亞型禽流感病毒為H5亞型禽流感病毒內(nèi)部基因供體，其內(nèi)部基因不停地在H6與H5兩亞型之間傳遞和進(jìn)化，造成對(duì)禽流感疫情的控制更加困難，因此對(duì)該地區(qū)進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)研究，了解禽流感病毒的變異情況顯得非常重要。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）01-0009-04

通訊作者：黃建龍?jiān)诿绹?guó)多次暴發(fā)，從散養(yǎng)的家禽和商品雞中均可分離出AIV［2-3］。H6亞型也是我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查過(guò)程中分離數(shù)量最多的AIV之一，占所有AIV亞型的17.8%［4］。有報(bào)道稱H6亞型AIV不僅可以向H5亞型高致病性AIV和H9N2亞型AIV提供內(nèi)部基因片段，而且還可以感染鼠、水貂和人［5-6］。AIV基因組中變異最頻繁的是HA、NA基因，HA是決定病毒致病性、毒力強(qiáng)弱和宿主特異等方面的關(guān)鍵因素之一。禽流感毒株HA、NA基因的頻繁變異給禽流感的防控帶來(lái)非常大的難度。本研究對(duì)2012年湖南省洞庭湖區(qū)活禽市場(chǎng)及鴨場(chǎng)的正常監(jiān)測(cè)樣品中分離到的5株H6N6亞型禽流感毒株進(jìn)行HA、NA基因遺傳進(jìn)化分析，旨在從分子生物學(xué)角度了解H6N6亞型AIV在湖南省洞庭湖區(qū)的變異特點(diǎn)和進(jìn)化規(guī)律，為該地區(qū)H6N6亞型禽流感的防控提供一些理論依據(jù)，從而有效預(yù)防和控制禽流感，保護(hù)人體健康和公共衛(wèi)生安全。

Genetic Evolution of HA and NA Genes of Five Isolates of H6N6 Subtype AIV in Dongting Lake Area

Song Yuejun1，Tan Dan1，2，Deng Guohua2，Wang Changjian1，Zhu Chunxia1，Zhang Chaoyang1，Liu Daoxin1，Huang Jianlong1
（1.Hunan Provincial Animal Disease Prevention and Control Center，Changsha，Hunan 410014；2.Animal Infl uenza Laboratory of the Ministry of Agricultural，State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150001）

Abstract：In order to explore the genetic variation characteristics and evolution of H6N6 subtype AIV，and provide some theories about prevention and control of H6N6 subtype AIV in Dongting Lake area of Hunan province，fi ve isolates of H6N6 subtype AIV were isolated in the region in 2012，then HA and NA genes were sequenced，and their homology and genetic evolution were analyzed . The result showed that the fi ve strains of H6N6 subtype AIV belonged to low pathogenic avian infl uenza virus，because their cracking sites all were not inserted by some continuous alkaline amino acid. There were some differences about HA and NA potential glycosylation sites which may cause the difference of its virulence and pathogenicity，but this still needs to be studied. From phylogenetic tree of gene，the fi ve strains has high homology with some strains isolated from Shantou and Guangxi.

Key words：H6N6 AIV；homology；evolution