王翠瑤，張小玉，田苗苗，張秀梅

(錦州醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

丙酮酸激酶在大腸癌組織中的表達(dá)水平研究

王翠瑤，張小玉，田苗苗，張秀梅Δ

(錦州醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

目的 研究丙酮酸激酶M1型(PKM1)和丙酮酸激酶M2型(PKM2)在大腸癌臨床樣本中的表達(dá)水平，探討其與大腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。方法 分別采用Western blot法檢測(cè)大腸癌臨床標(biāo)本和新鮮大腸癌組織及癌旁組織中PKM1 和 PKM2蛋白表達(dá)水平；分析PKM1、PKM2蛋白表達(dá)與大腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。結(jié)果 Western blot和免疫組化結(jié)果均顯示：與癌旁組織相比，癌組織中PKM1的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，PKM2的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明，PKM1與大腸癌患者年齡，性別，分期均無(wú)相關(guān)性，PKM2與病理分期密切相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 大腸癌組織中PKM1呈現(xiàn)低表達(dá)，PKM2高表達(dá)。且PKM2與大腸癌患者的病理分期成正相關(guān)。

丙酮酸激酶M1型 ；丙酮酸激酶M2型；大腸癌

惡性腫瘤由于其生長(zhǎng)迅速，常常消耗大量的葡萄糖，即使在有氧的條件下也常常利用糖酵解來(lái)供能，這種代謝特征是70年前由Otto Warburg發(fā)現(xiàn)并首次報(bào)道，稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[1]。糖酵解水平提高幾乎是所有腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程中的一個(gè)限速酶，其主要功能是催化磷酸烯醇式轉(zhuǎn)變成丙酮酸。丙酮酸激酶已知具有L，R，M1，M2 4種同工酶，其表達(dá)差異取決于細(xì)胞和組織的代謝情況。L型丙酮酸激酶主要表達(dá)在糖異生旺盛的組織，如肝臟和腎臟；R型丙酮酸激酶主要表達(dá)在紅細(xì)胞中；M1型丙酮酸激酶表達(dá)于能量消耗快速耗氧量大的組織，如肌肉和腦；M2型丙酮酸激酶表達(dá)在核酸合成旺盛的組織，比如胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[2-4]。本研究旨在檢測(cè)大腸癌臨床樣本中PKM1和PKM2的表達(dá)水平，以期為大腸癌的臨床早期診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源：選取遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院經(jīng)大腸癌手術(shù)切除、并經(jīng)病理確診的大腸癌標(biāo)本95例，標(biāo)本對(duì)應(yīng)的患者手術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及生物治療。另取遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院26例大腸癌患者行手術(shù)切除的新鮮大腸癌組織和癌旁組織。

1.1.2 主要試劑：兔抗人的PKM1、PKM2的多克隆抗體購(gòu)自Cell signal公司，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，免疫組化二抗試劑盒，DAB染色試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司。

1.1.3 儀器：Lumat LB 9507化學(xué)發(fā)光儀(德國(guó)Berthold technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測(cè)PKM1、PKM2蛋白表達(dá)水平：取臨床新鮮癌組織和癌旁組織，加蛋白裂解液冰上裂解15 min，提取組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩ｋ娪厩?，加入SDS樣品緩沖液，100 ℃煮沸5 min，離心后上樣，每孔蛋白含量30 μg，10%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%BSA的TBST(pH7.4)室溫?fù)u動(dòng)溫育1 h進(jìn)行封閉，封閉后的膜再分別與PKM1抗體、PKM2抗體(稀釋比為1:1000)4 ℃溫育過(guò)夜。經(jīng)TBST洗滌后，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1:5 000)室溫溫育2 h，洗膜后，ECL發(fā)光，Western blot成像系統(tǒng)采集圖像，計(jì)算灰度值。

1.2.2 免疫組化方法檢測(cè)PKM1、PKM2蛋白表達(dá)水平：脫蠟和水化：將大腸癌標(biāo)本置于二甲苯中浸泡20 min，更換二甲苯后再浸泡20 min；無(wú)水乙醇中浸泡10 min；95%乙醇中浸泡5 min；90%乙醇中浸泡5 min；80%乙醇中浸泡5 min；再放入水中5 min。

抗原修復(fù)：采用高壓熱修復(fù)，在高壓鍋里加熱0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至噴氣后150 ℃ 2 min。

免疫組織化學(xué)染色：自然涼卻后，滴加3%H2O2，室溫靜置10 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫15 min。甩去多余液體。滴加一抗30 μL，室溫靜置1 h再4 ℃過(guò)夜。PBS洗3次，每次10 min；滴加二抗，37 ℃ 1 h；PBS洗3次，每次10 min；滴加試劑C，室溫靜置1 h；PBS洗3次，每次10 min；DAB顯色1～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來(lái)水沖洗10 min；蘇木精復(fù)染30 s，鹽酸酒精分化；自來(lái)水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測(cè)26例腸癌樣本的PKM1及PKM2的蛋白表達(dá)水平 26例腸癌樣本中有17例PKM1的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，比例高達(dá)65.38%(P<0.05)。與癌組織相比，26例腸癌樣本中有16例PKM2的表達(dá)水平明顯升高，比例高達(dá)61.53%(P<0.05)。結(jié)果提示：在正常組織中，通常是表達(dá)PKM1；而在癌組織中，PKM2的表達(dá)水平明顯升高；說(shuō)明PKM1和PKM2的異常表達(dá)與腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。見圖1、表1、圖2、表2。

圖1 26例大腸癌組織和癌旁組織的PKM1蛋白表達(dá)水平比較N：癌旁組織；C：大腸癌組織Fig.1 Comparison of PKM1 protein levels between colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma in 26 patientsN:adjacent tissues to carcinoma;C:colorectal cancer tissue

序號(hào)病例癌旁PKM1/β-actin癌序號(hào)病例癌旁PKM1/β-actin癌11.938±0.0541.234±0.074*140.417±0.0730.122±0.086*21.838±0.0980.334±0.028*150.923±0.0860.234±0.073*30.964±0.0721.024±0.035161.118±0.0431.235±0.08740.252±0.0570.862±0.068171.725±0.0321.078±0.056*51.138±0.0380.326±0.072*180.925±0.0540.568±0.064*60.414±0.0611.264±0.058191.434±0.0870.456±0.039*70.538±0.0650.144±0.056*200.916±0.0620.434±0.018*80.326±0.0730.156±0.053*210.837±0.0470.564±0.059*90.236±0.0350.342±0.073220.846±0.0290.478±0.051*100.236±0.0560.136±0.023230.346±0.0450.152±0.056*111.224±0.0231.028±0.043*240.175±0.0430.844±0.026120.535±0.0780.341±0.039*250.134±0.0542.348±0.076130.444±0.0760.878±0.057260.534±0.0660.321±0.039*

*P<0.05，與同組癌旁組織相比，compared with adjacent tissues to carcinoma

圖2 26例大腸癌組織和癌旁組織的PKM2蛋白表達(dá)水平比較N：癌旁組織；C：大腸癌組織Fig.2 Comparison of PKM2 protein levels between colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma in 26 patientsN:adjacent tissues to carcinoma;C:colorectal cancer tissue

序號(hào)病例癌旁PKM2/β-actin癌序號(hào)病例癌旁PKM2/β-actin癌10.128±0.0530.115±0.042140.634±0.0710.221±0.04620.243±0.0560.247±0.072150.134±0.0431.230±0.047*30.474±0.0720.324±0.051161.218±0.0562.135±0.035*40.134±0.0430.562±0.058*171.325±0.0532.878±0.056*51.038±0.0781.436±0.072*180.325±0.0281.568±0.056*60.114±0.0320.574±0.078*191.134±0.0360.534±0.04570.136±0.0660.446±0.022*200.906±0.0620.434±0.03480.114±0.0680.354±0.058*210.537±0.0460.364±0.05990.154±0.0710.236±0.024220.136±0.0250.436±0.032*100.236±0.0660.456±0.016230.134±0.0252.232±0.068*110.116±0.0760.358±0.023*240.365±0.0530.264±0.076120.134±0.0520.537±0.048*250.138±0.0660.518±0.085*130.534±0.0460.834±0.023*260.234±0.0580.621±0.068*

*P<0.05，與同組癌旁組織相比，compared with adjacent tissues to carcinoma

2.2 免疫組化方法檢測(cè)PKM1及PKM2的蛋白表達(dá)水平 免疫組化染色結(jié)果顯示，PKM1(棕黃色顆粒)分布于胞漿，靠近核的區(qū)域，癌旁組織染色明顯深于癌組織。PKM2(棕黃色)分布在胞質(zhì)或胞核，癌組織染色明顯深于癌旁組織。見圖3。

圖3 PKM1 和PKM2的蛋白表達(dá)水平(×200)Fig.3 The expression level of PKM1 and PKM2 protein(×200)

2.3 PKM1和PKM2與大腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性 根據(jù)樣本的組化得分將樣本分為2組，弱(組化賦分小于3分的為弱)和強(qiáng)(組化賦分大于3小于7為強(qiáng))，數(shù)據(jù)顯示：高表達(dá)的PKM2與pTNM分期(P=0.015)顯著相關(guān)，而與年齡、性別、大小、侵潤(rùn)深度等無(wú)關(guān)。PKM1的表達(dá)水平與pTNM分期等均無(wú)關(guān)，見表3、表4。

表3 PKM2在大腸癌組織的表達(dá)

表4 PKM1在大腸癌組織的表達(dá)

3 討論

大多數(shù)正常組織在有氧條件下都是通過(guò)葡萄糖的有氧氧化獲取能量，只有在缺氧時(shí)才進(jìn)行無(wú)氧糖酵解。腫瘤組織即使在氧供應(yīng)充足時(shí)也主要是以無(wú)氧糖酵解獲取能量。腫瘤細(xì)胞發(fā)生這種代謝重編程與惡性腫瘤所處缺氧微環(huán)境和糖代謝酶譜變化，特別是糖酵解關(guān)鍵酶活性的改變密切相關(guān)[5-8]。PKM是糖酵解途徑中最后一個(gè)限速酶。有研究[9-10]表明：生長(zhǎng)迅速的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞比較，其PKM2活力明顯升高。

本研究采用Western blot方法檢測(cè)了26例大腸癌樣本PKM1及PKM2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：PKM1的表達(dá)水平在癌旁組織中明顯高于癌組織，而PKM2的表達(dá)水平在癌組織中明顯高于癌旁組織。該結(jié)果表明：PKM2的表達(dá)水平在大腸癌中表達(dá)水平明顯升高，而PKM1的蛋白表達(dá)水平在大腸癌中則明顯降低，說(shuō)明2者的表達(dá)可能與大腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[11]。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)了95例大腸癌組織的PKM1及PKM2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，PKM2的蛋白表達(dá)水平明顯升高，其表達(dá)水平與大腸癌的病理分期密切相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤大小等無(wú)關(guān)；PKM1的蛋白表達(dá)水平在癌旁組織略高于癌組織，但其表達(dá)水平與性別、年齡、病理分期均無(wú)關(guān)。綜上所述，大腸癌組織中PKM1和PKM2的的表達(dá)水平與大腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

[1] Warburg,Wind F,Negalein E.The metabolism of tumor in the body [J].J Gen Physiol,1927,8(6):519-530.

[2] Zhou CF,Li XB,Sun H,et al.Pyruvate kinase type M2 is upregulated in colorectal cancerand promotes proliferation and migration of colon cancer cells[J].IUBMB Life,2012,64(9):775-782.

[3] Siegel R,Desantis C,Jemal A.Colorectal cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(2):104-117.

[4] Wong N,De Melo J,Tang D.PKM2,a central point of regulation in cancer metabolism[J].Int Cell Biol,2013:242513.

[5] Marie J,Levin MJ,Simon MP,et al.Genetic and epigenetic control of the pyruvate kinase isoenzymes in mammals.Isozymes[J].Curr Top Biol Med Res,1983(7):221-240.

[6] Mazurek S,Boschek CB,Hugo F,et al.Pyruvate kinase type M2 aits role in tumor growth and spreading[J].Semin Cancer Biol,2005,15(4):300-308.

[7] Yang W,Xia Y,Ji H,et al.Nuclear PKM2regulates β-catenin transactivation upon EGFR activation[J].Nature,2011,480(7375):118-122.

[8] Anastasiou D,Yu Y,Israelsen WJ,et al.Pyruvate kinase M2 activators promote tetramer formation and suppress tumorigenesis[J].Nature Chemical Biology,2012,8(10):839-847.

[9] Liu WR,Tian MX,Yang LX,et al.PKM2 promotes metastasis by recruiting myeloid-derived suppressor cells and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2015,6(2):846-861.

[10] 孫倩.M型丙酮酸激酶(PKM2)在腫瘤代謝和發(fā)生中的作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32(5)：462-467.

[11] 林萍，鄧濤，葉彥，等.人結(jié)直腸癌組織中mT0R、HIF-la、PKM2的表達(dá)及臨床意義[J].疑難病雜志，2015，14(4)：380-383.

(編校：吳茜)

Study on the expression of PKM levels in colorectal cancer

WANG Cui-yao, ZHANG Xiao-yu, TIAN Miao-miao, ZHANG Xiu-meiΔ

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo study the expression level of PKM1 and PKM2 in colorectal cancer tissue and explore the relationship between colorectal cancer progression and their expression level.MethodsThe PKM1 and PKM2 protein expression levels in colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma were determined by Western blot and Immunohistochemisty method, and the relationship with colorectal cancer were discussed.ResultsWestern blot and Immunohistochemisty results all showed that, compared with adjacent noncancerous，the protein level of PKM1 decreases significantly in cancer tissues (P<0.05), while the protein level of PKM2 increases significantly in cancer tissues (P<0.05).The protein level of PKM1 is not relative with age，sex and stage of patients, but the protein level of PKM2 is relative with pTNM(P<0.05).ConclusionColorectal cancer tissues with low level of PKM1 and high level of PKM2, and PKM2 was related with TNM of patients.

PKM1; PKM2; colon cancer

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.12

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新課題(201410160012)

王翠瑤：女，本科，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail：1140379451@qq.com；張秀梅，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail：zhangxiumei9879@sina.com。

R736.1

A