王太亮,王子秦

(1.河北省唐山市食品藥品檢驗中心，河北 唐山 063000；2.上海師范大學(xué)，上海 200235)

HPLC-ELSD法測定氨糖美辛腸溶膠囊中鹽酸氨基葡萄糖及相關(guān)物質(zhì)

王太亮1Δ,王子秦2

(1.河北省唐山市食品藥品檢驗中心，河北 唐山 063000；2.上海師范大學(xué)，上海 200235)

目的 建立高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD)法測定氨糖美辛腸溶膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的含量及其有關(guān)物質(zhì)。方法 采用Inertsil C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(70:30)為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃。結(jié)果 在選定的色譜條件下, 鹽酸氨基葡萄糖進樣量在25～312.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好r=0.9991(n=6)。加樣回收率為98.0%,RSD為1.3%(n=5)；鹽酸氨基葡萄糖對酸穩(wěn)定，堿、熱、光不穩(wěn)定。結(jié)論 方法準(zhǔn)確、快捷、重復(fù)性好,可用于含量的測定及其有關(guān)物質(zhì)的檢查。

鹽酸氨基葡萄糖；HPLC-ELSD；含量測定；有關(guān)物質(zhì)

鹽酸氨基葡萄糖(分子式C6H13NO5·HCl)是甲殼素降解產(chǎn)物[1]。臨床上，鹽酸氨基葡萄糖具有多種生物活性，是預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎疾病的特異性生化藥物。

目前常用的檢測方法有：紫外-可見分光光度法[2-3]、高效液相色譜-紫外檢測法[4-5]、柱前衍生化-高效液相色譜法[6]和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[7-9]。國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH07802008中鹽酸氨基葡萄糖的含量采用Elson-Morgan比色法測定，樣品處理需衍生化反應(yīng)，操作繁瑣，且樣品溶液不穩(wěn)定，溶液顏色隨時間變化而變化，定量重復(fù)性較差。高效液相色譜-紫外檢測法所用測定波長為195 nm，恰處于乙腈的末端吸收，影響測定結(jié)果。柱前衍生化-高效液相色譜法操作復(fù)雜，檢測周期長，衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定，衍生化試劑產(chǎn)生的信噪比較大。

采用HPLC-ELSD法測定，專屬性較強，出峰快，縮短分析時間，降低成本，靈敏度高、準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：氨糖美辛腸溶膠囊(葵花藥業(yè)集團衡水得菲爾有限公司，批號：20150805、20150806、20150807、201508011、201508012、20150801、20150912及20151103)，鹽酸氨基葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院, 批號: 140649-201505，供含量測定，105 ℃干燥至恒重)；乙腈為色譜純(美國)。

1.1.2 儀器：Waters e2695高效液相色譜儀(美國)，在線脫氣、自動進樣、奧泰蒸發(fā)光散射檢測器(美國)、Empower工作站，KQ-250E超聲波清洗儀(江蘇昆山)，Sartorius BP211電子天平(德國)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：規(guī)格型號：Inertsil C8柱(250 mm×4.6 mm , 5 μm) ；流動相:乙腈:水(70:30);流速:1.0 mL/min；柱溫: 25 ℃；漂移管溫度90 ℃，霧化器空氣流速3.0 L/min。

1.2.2 溶液的制備

① 對照品溶液制備：精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對照品12.50 mg,置100 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為0.125 mg/mL。

② 樣品溶液制備：取本品20粒，內(nèi)容物精密稱定，計算平均裝量?；靹蜓屑?xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

③ 陰性樣品溶液的制備：處方中不含鹽酸氨基葡萄糖，其余同樣品，溶液的制備按“②”項下樣品溶液制備。

1.2.3 方法學(xué)驗證

① 專屬性：在上述色譜條件下,將陰性對照溶液、鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液、供試品溶液分別經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后,取10 μL進樣觀察色譜圖。

② 線性：精密量取“1.2.2①”項下鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液，分別進樣2、5、10、15、20、25 μL。峰面積(y)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量濃度(x, μg/mL)的對數(shù)為橫坐標(biāo)作線性回歸。

③ 檢測限： 取“1.2.2①”項下對照品溶液，加水逐步稀釋至所得到色譜圖中鹽酸氨基葡萄糖峰高為噪音的3倍，為最低檢測限。

④ 精密度：精密吸取“1.2.2①”項下鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液10 μL進樣 ,連續(xù)重復(fù)6次，測得峰面積。取同批樣品6份，照“1.2.2②”項方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，分別進樣10 μL，計算含量。

⑤ 加樣回收：稱取陰性樣品細(xì)粉適量，共9份，分置25 mL量瓶中，分為3組，每組分別精密加入“1.2.2①”項下鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液12、15、18 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后取20 μL注入液相色譜儀測定，計算回收率。

⑥ 穩(wěn)定性試驗：在室溫下取樣品溶液于 0, 3, 6, 9, 12, 18 h分別進樣分析。

⑦ 樣品含量測定：取5批樣品按“1.2.2②”項下制備并測定。

1.3 相關(guān)物質(zhì)[10-13]

1.3.1 破壞性實驗

① 酸破壞：取“1.2.2②”項下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，加2 mol/L鹽酸溶液1 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

② 堿破壞：取“1.2.2②”項下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，加2 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至中性，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

③ 加熱破壞：取“1.2.2②”項下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，水浴加熱15 min，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

④ 光破壞：取“1.2.2②”項下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，用強光(4500 LX)照射12 h以上，搖勻，濾過，即得。

1.3.2 自身對照：取“1.2.2②”項下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液；精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對照溶液。

按“1.2.1”項下色譜條件，精密量取上述溶液(經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過)各10 μL，分別注入液相色譜儀。

另取樣品3批，批號：20150801、20150912、20151103，分別檢測相關(guān)物質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 專屬性：陰性圖譜中未出現(xiàn)色譜峰，樣品圖譜中鹽酸氨基葡萄糖色譜峰保留時間與對照品色譜峰保留時間一致，并且與相鄰色譜峰分離度符合要求。說明處方中其他成分對鹽酸氨基葡萄糖檢測無干擾。見圖1。

圖1 各組分色譜圖Fig.1 Chromatogram of each substance

2.1.2 線性：回歸方程為: lgy=1.846lgx+2.119，相關(guān)系數(shù)r=0.9991(n=6),表明鹽酸氨基葡萄糖在25～312.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 檢測限與精密度：鹽酸氨基葡萄糖的檢測限為2.5 μg/mL。對照品溶液連續(xù)重復(fù)6次測得峰面積，RSD為0.6%，儀器精密度良好。同批樣品6份計算含量，RSD為0.9%，重現(xiàn)性良好。

2.1.4 加樣回收：回收率結(jié)果見表1。

表1 回收率(n=9)

2.1.5 穩(wěn)定性試驗：結(jié)果顯示樣品溶液在0, 3, 6, 9, 12, 18 h進樣得到的色譜圖，峰面積無明顯改變 , RSD為 0.9%，表明樣品溶液室溫放置18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 樣品含量測定：結(jié)果見表2。

表2 含量測定(n=5)

2.2 相關(guān)物質(zhì)檢測試驗結(jié)果 酸破壞在11.5 min出現(xiàn)新的雜質(zhì)峰，但峰型小，堿破壞在0.3和9 min產(chǎn)生了較大的新的雜質(zhì)峰，加熱破壞在5.8 min出現(xiàn)較大的新的雜質(zhì)峰，強光破壞在0.4 min和9 min產(chǎn)生了較大的新的雜質(zhì)峰，說明樣品對酸較穩(wěn)定，對堿、加熱、強光破壞不穩(wěn)定，且各破壞條件下，降解產(chǎn)物均能與鹽酸氨基葡萄糖峰呈良好分離。

另取樣品3批，批號：20150801、20150912、20151103，分別測定，均未檢出雜質(zhì)。

3 討論

流動相：試用甲醇-水、乙腈-水流動相系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-水易平衡，且噪音低，比較不同配比的乙腈-水(70:30)，峰型良好，故選用乙腈-水(70:30)為流動相。

色譜柱：流動相確定后，比較了離子交換色譜柱、C18譜柱、C8色譜柱。離子交換色譜柱，產(chǎn)生的噪音大，基限漂移。C18和C8柱在相同色譜條件下，C8柱峰型更優(yōu)，且重復(fù)性強，故選用C8柱。

柱溫：Rune Slimestad[14]對柱溫進行研究，發(fā)現(xiàn)溫度對葡萄糖測定含量影響較大較，一般控制在20 ℃～30 ℃為宜，故選擇柱溫25 ℃。

制備樣品溶劑：用流動相為溶劑，樣品出現(xiàn)2個成分峰，且分離度不理想。通過驗證，后1個色譜峰為吲哚美辛峰，嘗試調(diào)整流動相比例，始終不能分開?？疾爝胚崦佬恋娜芙庑?，水中幾乎不溶[15]，而鹽酸氨基葡萄糖易溶于水，故選用水為溶劑。

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[15] 國家藥典編委會 .中華人民共和國藥典.二部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:478-479.

(編校：王儼儼)

Determination of glucosamine hydrochloride and related substances in glucosamine and indometacin enteric-coated capsules by HPLC-ELSD

WANG Tai-liang1Δ, WANG Zi-qin2

(1.Tangshan Institute for Food and Drug Control, Tangshan 063000, China; 2.Shanghai Normal University, Shanghai 200235, China)

ObjectiveTo establish an high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD) method for determination of glucosamine hydrochloride and its related substances in glucosamine and indometacin enteric-coated capsules.MethodsSeparation was carried out on a Inertsil C8Column (250 mm×4.6 mm,5 μm) with a mobile phase composed of acetonitrile-water(70:30) at a flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature was 25 ℃.ResultsThe linear ranges of calibration curve was 25-312.5 μg/mL(r=0.9991,n=6).The average recovery was 98.0%, and the relative standard deviation was 1.3%(n=5).The glucosamine hydrochloride was stable with acid destruction, but unstable with alkali, heat and strong light destruction.ConclusionThe method is simple, accurate and reproducible for determination of glucosamine hydrochloride and related substances.

glucosamine hydrochloride; HPLC-ELSD; content determination; related substances

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.59

唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目(09130244b)

王太亮，通信作者，男，本科，副主任藥師，研究方向：藥物分析與檢驗，E-mail：wangtailiang2006@163.com。

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