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摘要：用AFLP分子標(biāo)記手段對(duì)我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究，為綜合評(píng)價(jià)我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源提供依據(jù)。以50份苦蕎核心種質(zhì)為試驗(yàn)材料，優(yōu)化篩選出19對(duì)AFLP標(biāo)記分析引物，經(jīng)AFLP-PCR擴(kuò)增、PAGE檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析AFLP圖譜，運(yùn)行Popgene Ver.1.31和NTSYSpc Ver.2.2軟件對(duì)苦蕎種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，共檢測(cè)到211個(gè)AFLP特異性標(biāo)記，平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生11.11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（PIC），遺傳相似系數(shù)（GS）分布區(qū)間均較大，變幅為0.515～0.954，辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)計(jì)算結(jié)果表明來自四川的苦蕎種質(zhì)資源多樣性最為豐富；Popgene Ver.1.31運(yùn)行結(jié)果表明，當(dāng)GS為0.790時(shí)，50份苦蕎材料被分為5個(gè)組群，聚類結(jié)果與苦蕎種質(zhì)的地理分布有一定的相關(guān)性。說明AFLP是一種有效的分子標(biāo)記方式，適合于苦蕎種質(zhì)遺傳多樣性分析；我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源多樣性豐富，須要在保護(hù)、利用現(xiàn)有種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上繼續(xù)加強(qiáng)區(qū)域間引種、育種，為我國(guó)蕎麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供幫助。

關(guān)鍵詞：苦蕎；AFLP；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S517.024文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0122-05

苦蕎（Fagopyrum tataricum）屬廖科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill），尼泊爾、我國(guó)西藏東部和云南西北部是苦蕎的分布中心和起源地[1]。我國(guó)是苦蕎的主產(chǎn)區(qū)，栽培面積超過30萬hm2，產(chǎn)量水平達(dá)900 kg/hm2，總產(chǎn)量達(dá)3億kg[2]?？嗍w糧藥兼用，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且具有降糖脂、降膽固醇、抗氧化和消炎等功效，被譽(yù)為21世紀(jì)重要的綠色食品資源[3]。我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源豐富，利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析對(duì)我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源的保護(hù)、品種的改良、分子育種及優(yōu)良基因的挖掘具有重要的意義。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者已采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記[4]、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記[5]、種子蛋白標(biāo)記[6]和同功酶標(biāo)記[7]等手段對(duì)蕎麥的遺傳多樣性進(jìn)行分析，但分子標(biāo)記技術(shù)仍然是目前最主要的遺傳多樣性分析手段，國(guó)內(nèi)外已采用RAPD[8]、SSR[9]、ISSR[10]和SRAP[11]等分子標(biāo)記方式對(duì)苦蕎遺傳多樣性進(jìn)行了研究。AFLP是一種可靠性高、適用性強(qiáng)、多態(tài)性水平高的分子標(biāo)記方式，非常適合于對(duì)研究背景模糊、材料來源廣泛的作物進(jìn)行標(biāo)記分析。Tsuji等利用AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生苦蕎和栽培苦蕎進(jìn)行了系統(tǒng)研究[12]；Yasui等利用AFLP標(biāo)記，構(gòu)建了野生蕎（F. homotropicum）和甜蕎的8個(gè)連鎖群的遺傳圖譜[13]；Konishi等利用AFLP標(biāo)記揭示了野生甜蕎和栽培甜蕎間的起源關(guān)系[14]；侯雅君等對(duì)百余份苦蕎材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析[15]。以上研究雖利用不同的標(biāo)記方式對(duì)苦蕎進(jìn)行了遺傳多樣性分析，但利用AFLP標(biāo)記分析我國(guó)極具代表性的苦蕎核心種質(zhì)（精準(zhǔn)鑒定品種）的研究幾乎沒有。盡管到目前為止國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于苦蕎AFLP標(biāo)記方面的報(bào)道，但大多數(shù)分析范圍或是過于狹窄或是過于寬泛，分析材料多數(shù)不具有典型的地域代表性。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，從國(guó)家種質(zhì)庫(kù)中精心挑選出50份極具代表性的苦蕎精準(zhǔn)鑒定材料為研究對(duì)象，從40對(duì)引物組合中篩選出19對(duì)信息量豐富、多態(tài)性好的AFLP引物，對(duì)我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在揭示我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系，為苦蕎種質(zhì)資源的收集、保護(hù)、利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

我國(guó)苦蕎精準(zhǔn)鑒定材料50份，分別來自12個(gè)?。▍^(qū)），具體情況見表1，供試材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)保存中心提供。

1.2DNA提取與酶切

取0.5 g嫩葉，用CTAB法[16]提取總DNA，稀釋100倍后表1苦蕎品種名稱及來源

編號(hào)品種名稱來源編號(hào)品種名稱來源1黑豐1號(hào)山西26苦蕎陜西2六蕎2號(hào)貴州27苦蕎陜西3苦蕎陜西28刺蕎四川4苦蕎麥安徽29苦蕎貴州5苦蕎陜西30苦蕎寧夏6苦蕎陜西31蕎麥山西782-8-1安徽32蕎麥甘肅8苦蕎陜西33遼蕎75（苦）遼寧9苦蕎四川34黑苦蕎青海10苦蕎陜西35湖南2-2湖南11苦蕎山西36塘彎苦蕎湖南12威寧3號(hào)貴州37六蕎1號(hào)貴州13苦蕎湖北38湖南1-2湖南14額洛木爾惹四川39苦蕎青海15湖南3-1湖南40湖南6-2湖南16海源苦蕎寧夏41晉蕎麥2號(hào)山西17鳳凰苦蕎湖南42苦蕎青海18湖南5-2湖南43苦蕎麥安徽19苦蕎陜西44苦蕎麥甘肅20苦蕎湖北45苦蕎湖北21西農(nóng)9909陜西46鎮(zhèn)巴苦蕎Ⅱ陜西22彭澤苦蕎江西47老鴉苦蕎四川23洗馬苦蕎湖南48麻苦蕎甘肅24苦蕎湖北49新邵苦蕎湖南25麻苦蕎甘肅50湖南3-2湖南

參考閆龍等的試驗(yàn)方法[17]，37 ℃條件下用MseⅠ和EcoRⅠ對(duì)總DNA酶切8h，檢測(cè)酶切效果。

1.3加接頭與預(yù)擴(kuò)增

將酶切產(chǎn)物分別加上EcoRⅠ和MseⅠ接頭。在T4連接酶的作用下，16 ℃過夜連接后獲得連接產(chǎn)物，稀釋5倍后用預(yù)擴(kuò)增引物M（5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′）和E（5′-GACTGCGTACCAATTC-3′）進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：連接產(chǎn)物4.0 μL，M引物1.0 μL，E引物1.0 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP 0.4 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20μL。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增效果后，稀釋20倍備用。

1.4引物篩選與選擇性擴(kuò)增

選用遺傳差異較大的7份苦蕎材料對(duì)40對(duì)AFLP引物組合進(jìn)行篩選，篩選出擴(kuò)增條帶數(shù)量多、多態(tài)性好、清晰度高、分布均勻的19對(duì)引物組合：E-AA/M-CAG、E-AA/M-CTG、E-AC/M-CCC、E-AG/M-GCA、E-GA/M-CGT、E-GC/M-ACG、E-GC/M-CCT、E-GG/M-GAT、E-GG/M-GCA、E-TG/M-ACG、E-CTG/M-AC、E-CTG/M-CG、E-CTG/M-TT、E-GCT/M-CG、E-GCT/M-CT、E-GTC/M-CC、E-ACA/M-GT、E-ACT/M-CAG、E-ACT/M-CTG。獲取有效的AFLP引物組合后，進(jìn)行選擇性擴(kuò)增反應(yīng)。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系為：預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 μL，AFLP引物組各0.8 μL，10×PCR buffer 1.5 μL，dNTP 0.3 μL，Taq酶 0.15 μL，ddH2O補(bǔ)齊至15 μL。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 35 s（每個(gè)循環(huán)降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，12個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后加入5 μL Loading buffer，94 ℃ 變性3 min后立即置于冰上冷卻備用。

1.5PAGE檢測(cè)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

參考趙麗娟的方法[18]進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測(cè)，固定、銀染、顯影后用拍照計(jì)數(shù)。在電泳圖譜上，清晰條帶記為“1”， 同一位置上無條帶記為“0”。用Popgene Ver.1.31 軟件[19]計(jì)算多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）、多態(tài)性性息位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)（PPB）、辛普森指數(shù)（Simpson index）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon-Weaver index）、遺傳相似系數(shù)（GS）。根據(jù)GS， 采用UPGMA法，利用NTSYSpc Ver.2.2軟件[20]進(jìn)行苦蕎品種聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1酶切與預(yù)擴(kuò)增檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)苦蕎基因組DNA酶切和預(yù)擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1-A和圖1-B結(jié)果可知，DNA酶切片段均勻，預(yù)擴(kuò)增片段豐富，基本位于100～750 bp之間，適宜進(jìn)行選擇性擴(kuò)增[21]。

2.2選擇性擴(kuò)增檢測(cè)

本研究從40對(duì)AFLP引物組合中篩選出適宜的選擇性擴(kuò)增引物19對(duì)，篩選率為47.5%。19對(duì)引物在50份苦蕎材料上共擴(kuò)增出清晰條帶890條（圖2），平均每對(duì)引物可擴(kuò)增出條帶46.84條，長(zhǎng)度分布在45～570 bp之間。如表2所示，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶211條，平均每對(duì)引物的多態(tài)性條帶有11.11條，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）為24.05%，PIC最大值為0.1918（引物組合為E-CTG/M-CG），最小值為 0.024 1（引物組合為E-AA/M-CAG），PIC平均值為 0.123 2。

2.3苦蕎種質(zhì)遺傳多樣性分析

鑒于有些地區(qū)有代表性的苦蕎核心種質(zhì)材料太少，將少于4份材料的省份劃分至與其毗鄰或種植環(huán)境相似的省份，計(jì)算各組群苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性參數(shù)。由表3可知，AFLP標(biāo)記的苦蕎品種，辛普森指數(shù)為0.892～0.989，平均 0.940；香農(nóng)指數(shù)為0.095～0.194，平均0.153。四川是我國(guó)苦蕎遺傳多樣性最為豐富的地區(qū)，無論辛普森指數(shù)（0.989），還是香農(nóng)指數(shù)（0.194）均為最大。雖然湖南和陜西的供試材料最多（均為10份），但遺傳多樣性并不豐富，這從分子水平上證明資源量與遺傳多樣性并非正相關(guān)的觀點(diǎn)。安徽/江西、寧夏/青海2個(gè)組群的辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均較低，說明該地區(qū)的苦蕎種質(zhì)資源多樣性不夠豐富，需要在保護(hù)其遺傳穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)區(qū)域間引種。部分省份的核心種質(zhì)抽樣材料太少（如江西和遼寧各僅有1份），這也可能對(duì)遺傳多樣性參數(shù)值的計(jì)算造成一定的誤差[22]，不能完全反映該區(qū)域內(nèi)的種質(zhì)資源多樣性情況。

2.4苦蕎種質(zhì)遺傳關(guān)系分析

用NTSYSpc Ver.2.2軟件計(jì)算50份苦蕎種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)（GS）。AFLP標(biāo)記結(jié)果（表4）表明，50份苦蕎種質(zhì)的GS值在0.515～0.954之間，分布區(qū)間較大，說明苦蕎種質(zhì)多態(tài)性較為豐富，同時(shí)也表明AFLP標(biāo)記適宜于我國(guó)苦蕎種質(zhì)遺傳多樣性分析。

采用UPGMA法進(jìn)行聚類，當(dāng)GS為0.790時(shí)，大部分苦蕎材料可被分成五大組群。第Ⅰ組群可分為2個(gè)小組，第1小組包括來自山西（1）、陜西（5、6）、湖南（17、18、40）、甘肅（32）和青海（39）的8份材料，其中山西和陜西的材料聚為一類，湖南、青海和甘肅的材料聚為一類；第2小組包括來自安徽（7）、陜西（21、10、19）和湖北（13、20、24）的7份材料，其中安徽（7）、陜西（21、10、19）和湖北（13）的材料聚為一類，而另2份湖北材料（20、24）聚為另一類。第Ⅱ組群可分為2個(gè)小組，第1小組又可分為2個(gè)亞組，第1亞組包括來自陜西（3、27、26）、安徽（4）、甘肅（25）、湖南（35、36、38）和山西（41）的9份材料，第2亞組包括來自安徽（43）、甘肅（44）、湖北（45）、陜西（46）和湖南（49，50）共6份材料；第2小組包括山西（11）和遼寧（33）的2份材料。第Ⅲ組群包括來自山西（31）、青海（42）、四川（47）和湖南（23）的4份材料。第Ⅳ組群包括來自貴州（2、12、29、37）、四川（9、28）和寧夏（16）的7份材料，其中來自貴州（29）和四川（28）的2份材料遺傳相似度最近， 為0.954。第Ⅴ組群包括來自江西（22）、寧夏（30）和湖南（15）的3份材料。剩余的來自四川（14）、青海（34）、陜西（8）和甘肅（48）的4份材料與以上5個(gè)組群的遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一類特殊的類型（圖3）。

由聚類圖（圖3）可知，來自四川和貴州的刺蕎和苦蕎GS值最高（0.954），原因可能是四川的刺蕎屬于當(dāng)?shù)氐胤狡贩N有翅苦蕎的一類，而來自貴州的苦蕎也是當(dāng)?shù)氐囊粋€(gè)地方品種，兩者同屬于苦蕎的栽培品種，兩地也同屬我國(guó)栽培蕎麥的主產(chǎn)區(qū)—西南地區(qū)，地理位置接近及品種交流頻繁等因素導(dǎo)致兩者遺傳相似性較高。來自四川的額洛木爾惹和來自甘肅的麻苦蕎GS值最低（0.515），原因可能是甘肅的麻苦蕎為當(dāng)?shù)氐囊粋€(gè)栽培品種，四川的額洛木爾惹來自于川西南部的涼山彝族自治州，該地區(qū)地貌復(fù)雜，具有獨(dú)特的生態(tài)氣候，是我國(guó)苦蕎麥主要的生產(chǎn)和次生起源地之一，蕎麥種質(zhì)資源豐富[23]，而該品種也很可能是當(dāng)?shù)匾吧w麥的一個(gè)近緣種，豐富的蕎麥遺傳資源背景造成四川的額洛木爾惹與甘肅的麻苦蕎遺傳差異度較大。

3結(jié)論與討論

3.1AFLP標(biāo)記技術(shù)的有效性和適用性

自AFLP標(biāo)記技術(shù)被發(fā)明以來，該技術(shù)以其特殊的標(biāo)記特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于作物分子標(biāo)記分析和遺傳多樣性研究中。國(guó)內(nèi)外專家均認(rèn)為，AFLP是一種有效的分子標(biāo)記系統(tǒng)[24-25]。本研究的苦蕎種質(zhì)資源AFLP標(biāo)記結(jié)果表明，AFLP標(biāo)記豐富度高（19對(duì)引物組擴(kuò)增出890個(gè)條帶）、靈敏度強(qiáng)（平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶46.84個(gè)）。AFLP標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性豐富（平均多態(tài)性比率為25.7%），有效性強(qiáng)（平均每對(duì)引物可擴(kuò)增 11.11 個(gè)多態(tài)性條帶，高于RAPD標(biāo)記苦蕎所得的6.90個(gè)多態(tài)性條帶[8]）。有效的AFLP引物組合篩選率較高（引物篩選率47.5%，高于SSR[9]和ISSR[10]的引物篩選率）。以上結(jié)果表明，AFLP是一種十分適合于苦蕎種質(zhì)資源多樣性分析的標(biāo)記方式。進(jìn)一步擴(kuò)大引物遴選范圍，篩選出更多的AFLP擴(kuò)增引物，建立苦蕎AFLP引物擴(kuò)增庫(kù)是下一步的工作重點(diǎn)。

3.2苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性

從不同來源苦蕎種質(zhì)的遺傳關(guān)系發(fā)現(xiàn)，我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源遺傳多樣性十分豐富[26]；從不同組群苦蕎品種的遺傳參數(shù)值發(fā)現(xiàn)，四川地區(qū)的種質(zhì)資源遺傳多樣性最為豐富，是我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源的重點(diǎn)保護(hù)地區(qū)；從UPGMA聚類圖發(fā)現(xiàn)，處于相近地理范圍內(nèi)的苦蕎品種可聚在一起，這體現(xiàn)了我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的地緣性特征。因此，需要在加強(qiáng)區(qū)域內(nèi)苦蕎種質(zhì)資源保護(hù)的基礎(chǔ)上，不斷加強(qiáng)區(qū)域間的引種、育種，尤其是針對(duì)某些特殊珍貴品種（如四川的額洛木爾惹）的保護(hù)與開發(fā)，這將不斷豐富我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性。本研究結(jié)果為我國(guó)苦蕎種質(zhì)資源的保護(hù)和利用、品種的開發(fā)以及蕎麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供必要的參考依據(jù)。

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