屈　洋，周　瑜，王　釗，王鵬科，高金鋒，高小麗，馮佰利

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西岐山 722400）

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苦蕎產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

屈洋1,2，周瑜1，王釗2，王鵬科1，高金鋒1，高小麗1，馮佰利1

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西岐山 722400）

摘要：【目的】了解苦蕎產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為苦蕎資源的有效利用提供參考?！痉椒ā坎捎孟嚓P(guān)性分析、主成分分析方法對(duì)苦蕎8個(gè)植株性狀進(jìn)行分析；溫室內(nèi)培養(yǎng)苦蕎資源，于3葉期，每個(gè)資源選取10株新鮮葉片，采用CTAB方法提取苦蕎基因組DNA，結(jié)合SSR分子標(biāo)記方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并照相保存，根據(jù)SSR檢測(cè)位點(diǎn)構(gòu)建［0，1］矩陣，最后利用PowerMarker3.25和Structure2.3.4軟件對(duì)83份苦蕎種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析?！窘Y(jié)果】8個(gè)植株性狀分布較分散，大部分植株性狀間呈現(xiàn)顯著相關(guān)，植株性狀的前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.22％，基本可以顯示苦蕎種質(zhì)資源植株性狀的相關(guān)性關(guān)系；不同植株性狀間株高和主莖粗變異系數(shù)最大，遺傳變異最豐富。不同省份的資源表現(xiàn)出不同的遺傳多樣性，西藏資源的表型遺傳多樣指數(shù)H′均值最高，為1.82，其次為四川，遺傳多樣性指數(shù)H′均值為1.78；不同省份資源植株性狀的遺傳多樣性存在差異，四川生育期、株高、主莖分枝的遺傳多樣性指數(shù)H′最高，陜西葉寬的遺傳多樣性指數(shù)H′最高，云南千粒重的遺傳多樣性指數(shù)H′最高；植株性狀的主成分分析表明相似產(chǎn)區(qū)的植株性狀具有一定的相關(guān)性。13條核心引物共檢測(cè)出208條清晰的條帶，其中200條（96.15％）具有多態(tài)性，平均每條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)分別為16個(gè)和15.4個(gè)；不同引物等位基因變化范圍為4—58個(gè)，重要的基因頻率變化范圍為0.02—0.86，多樣性指數(shù)變化范圍為0.38—0.98，多態(tài)信息量（PIC）變化范圍為0.35—0.98；不同地理來(lái)源苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性表明，北方產(chǎn)區(qū)親緣關(guān)系較近，西南產(chǎn)區(qū)親緣關(guān)系較近，說(shuō)明不同地理來(lái)源的群體類別與產(chǎn)區(qū)存在一定的關(guān)系；來(lái)自陜西群體的等位基因數(shù)量最多、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息量最高，分別為12.0769、0.8365和0.8265；基于模型的遺傳結(jié)構(gòu)分析將苦蕎資源劃分為3個(gè)類群，基于遺傳距離的聚類顯示苦蕎種質(zhì)資源穿插分布，資源的地理來(lái)源地分化不明顯，但是同一產(chǎn)區(qū)的資源遺傳距離較近，資源之間具有一定的產(chǎn)區(qū)分化?！窘Y(jié)論】苦蕎產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源PIC較高，遺傳多樣性豐富，2大產(chǎn)區(qū)具有一定的資源交流和遺傳物質(zhì)交換。

關(guān)鍵詞：苦蕎；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；主成分分析法；相關(guān)性分析；聚類分析

聯(lián)系方式：屈洋，E-mail：man2019@163.com。周瑜，E-mail：254885036@qq.com。屈洋和周瑜為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者馮佰利，E-mail：7012766@163.com

0 引言

【研究意義】苦蕎（Fagopyrum tataricum （L.）Gaerth）屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），是蕎麥屬中僅有的2個(gè)栽培種之一。苦蕎起源于中國(guó)［1-2］，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富［3］，廣泛分布于北方農(nóng)牧交錯(cuò)地區(qū)、西南地區(qū)和高海拔地區(qū)?？嗍w是谷類作物中唯一集7大營(yíng)養(yǎng)素于一身的健康食品，具有獨(dú)特的活性成分生物類黃酮，可清熱解毒、活血化瘀、抗栓塞、降血脂和改善微循環(huán)［4］，有效降低微血管脆性和滲透性［5］，預(yù)防大腦微血管出血和維護(hù)眼循環(huán)?？嗍w屬早熟作物，生育期短、耐旱、耐瘠薄，是中國(guó)干旱和半干旱地區(qū)主要糧食作物之一，了解中國(guó)苦蕎主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，從分子水平進(jìn)一步挖掘苦蕎植株性狀與分子標(biāo)記的關(guān)系，對(duì)于充分了解和挖掘苦蕎資源的有效利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】苦蕎的遺傳多樣性研究起步較晚，且研究?jī)?nèi)容多集中在農(nóng)藝性狀的調(diào)查和分類［6］。李瑞國(guó)等［7］利用因子和聚類分析將苦蕎資源分為寬粒類、抗倒類、糧用類、大粒非抗倒類以及厚殼類；高金鋒等［8］經(jīng)過(guò)聚類分析將西藏苦蕎資源分為株高較矮大粒型、株高中等小粒型、植株矮小大粒型和植株高大莖桿粗壯型；李春花等［9］進(jìn)一步用主成分分析和聚類分析對(duì)云南苦蕎進(jìn)行了分類，主要類型為生育期較長(zhǎng)型、生育期中等和生育期較短類型?；谵r(nóng)藝性狀的苦蕎遺傳多樣性分析受環(huán)境變化因素影響較大，在不同的生態(tài)區(qū)和種植水平下可能出現(xiàn)不同的結(jié)果，而建立在DNA水平上的分子標(biāo)記技術(shù)不會(huì)受到環(huán)境影響［10］，可以在基因組水平上評(píng)估種質(zhì)資源遺傳多樣性［11］，前人已利用多種分子標(biāo)記方法研究蕎麥的遺傳多樣性。王莉花等［12］利用RAPD（random amplified polymorphic DNA）對(duì)云南野生蕎麥進(jìn)行了研究，表明野生蕎麥種間多樣性更豐富；候雅君等［13］利用AFLP（amplified fragment length polymorphism）進(jìn)行了苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，表明苦蕎類群間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性與地理分布有一定的關(guān)系；趙麗娟［2］等采用ISSR（inter-simple sequence repeat）對(duì)來(lái)自9個(gè)省（市）的66份苦蕎種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，表明苦蕎遺傳多樣性豐富，ISSR可以應(yīng)用進(jìn)行苦蕎的遺傳多樣性分析；TSUJI等［14］利用RAPD標(biāo)記方法對(duì)來(lái)自中國(guó)的野生蕎麥和栽培蕎麥進(jìn)行多樣性分析，表明栽培蕎麥可能來(lái)源于云南西北部地區(qū)；BOJKA等［15］利用RAPD標(biāo)記方法研究栽培苦蕎和野生苦蕎的遺傳多樣性，表明野生苦蕎的遺傳基礎(chǔ)更為復(fù)雜。與其他的分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR （simple sequence repeat）分子標(biāo)記技術(shù)因其多態(tài)性好、穩(wěn)定性可靠和經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥［16］、水稻［17］、大豆［18］等作物的遺傳多樣性研究，同時(shí)該技術(shù)也引入到苦蕎的遺傳多樣性研究中，并且擴(kuò)增的條帶具有較高的多態(tài)性［19］，在實(shí)際研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用［20-21］。高帆等［22］構(gòu)建了中國(guó)苦蕎SSR分子標(biāo)記體系，并篩選了苦蕎SSR分子標(biāo)記的核心引物；楊學(xué)文等［23］利用SSR標(biāo)記方法對(duì)苦蕎進(jìn)行了遺傳多樣性分析獲得了較高的多態(tài)性；徐笑宇等［24-25］利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了苦蕎的遺傳多樣性，并構(gòu)建了核心種質(zhì)。【本研究切入點(diǎn)】目前，苦蕎資源的遺傳多樣性研究多集中在植株性狀或者分子水平的遺傳多樣性研究，針對(duì)苦蕎植株性狀、分子標(biāo)記和遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性研究尚比較缺乏。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究選擇北方苦蕎產(chǎn)區(qū)（陜西、甘肅、寧夏）和西南苦蕎產(chǎn)區(qū)（西藏、四川、貴州、云南）搜集的 83份苦蕎種質(zhì)資源，較好地代表中國(guó)苦蕎種質(zhì)資源分布的主要區(qū)域，并利用分子標(biāo)記和植株性狀的相關(guān)鑒定方法對(duì)遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，揭示中國(guó)苦蕎種質(zhì)資源遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)苦蕎種質(zhì)資源有效利用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料共83份苦蕎種質(zhì)資源見表1。植株性狀鑒定試驗(yàn)于2010年進(jìn)行，分子標(biāo)記試驗(yàn)于2010—2011年進(jìn)行。

1.2 苦蕎植株性狀鑒定

苦蕎植株性狀鑒定在西北農(nóng)林科技大學(xué)小宗糧豆研究中心榆林原種場(chǎng)試驗(yàn)基地進(jìn)行，2行區(qū)，行長(zhǎng)2.5 m。按照《蕎麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［26］對(duì)生育期、千粒重、株高、主莖節(jié)數(shù)、主莖分枝、主莖粗、葉長(zhǎng)和葉寬等8個(gè)植株性狀進(jìn)行調(diào)查分析。

表1　苦蕎資源材料表Table 1 The tartary buckwheat germplasm resources

1.3 DNA提取

各材料在溫室中栽培，3葉期時(shí)，每個(gè)材料選取10株采摘新鮮葉片，洗凈，采用CTAB法提取苦蕎基因組DNA。每個(gè)材料樣品在盛有混合溶液（液氮200 μL、2 mol·L-1MET和20 mL CTAB）的研缽中研磨均勻，后在 55℃條件輕微震蕩 20 min，然后加入24∶1的氯仿和異戊醇的混合溶液15 mL，后在10℃，5 000 r/min的離心機(jī)上離心20 min，再用70％的乙醇溶解DNA沉淀物，干燥1 h，最后用2 mL的TE buffer （10 mmol·L-1Tris-HCl和1 mmol·L-1EDTA）溶解。

1.4 SSR引物

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳條件下條帶有無(wú)、條數(shù)多少和重復(fù)性確定擴(kuò)增效果較好的引物，篩選出13條引物對(duì)苦蕎種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，其中引物fes1394、fes1816、fes1475、fes2743、fes2644和fes1286由KONISHI等［27］開發(fā)。引物 hyb-16、hyb-15、hyb-49、se13-gt11、th26-ca49、th3a-gt16和th3a-ca7由SHI［28］開發(fā)。

1.5 PCR擴(kuò)增

引物fes1394、fes1816、fes1475、fes2743、fes2644 和fes1286的PCR反應(yīng)體系（20 μL）為10×PCR buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、25 mmol·L-1MgCl21.4 μL、20 μmol·L-1上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、Taq聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL、ddH2O 11.8 μL和DNA模板1.0 μL。

引物hyb-16、hyb-15、hyb-49、se13-gt11、th26-ca49、th3a-gt16和 th3a-ca7的 20 μL的 PCR反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、25 mmol·L-1MgCl21.4 μL、20 μmol·L-1引物1.0 μL、Taq聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL、ddH2O 12.8 μL和DNA模板1.0 μL。

反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)在朗基（long Gene）PCR儀上進(jìn)行。

1.6 電泳檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物采用 8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）方法恒壓分離。電泳緩沖體系為1×TBE溶液（Tris-HCL100 Mn，硼酸100，EDTA2Mn），170 V電泳2.2 h，最后采用硝酸銀法進(jìn)行染色，利用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

1.7 數(shù)據(jù)分析

1.7.1 植株性狀分析 利用DPSv6.55軟件進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)、主成分分析和相關(guān)性分析［29］。利用 Shannon Weanver遺傳多樣性指數(shù)來(lái)衡量群體遺傳多樣性大小，計(jì)算公式為：H′=-ΣPi×lnPi［30］。其中Pi為某一性狀第i級(jí)別內(nèi)材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比，ln為自然對(duì)數(shù)。

1.7.2 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)分析 每一對(duì) SSR引物檢測(cè) 1個(gè)位點(diǎn)，每一條多

態(tài)性條帶視為1個(gè)等位基因，構(gòu)建［0，1］距陣。應(yīng)用PowerMaker3.25［31］計(jì)算每條引物的等位基因數(shù)（number of alleles，NA）、重要等位基因頻率（major allele frequency，MAF）、基因多樣性指數(shù)（gene diversity，GD）和多態(tài)性信息含量指數(shù)（polymorphism information content，PIC），同時(shí)用Nei′s方法計(jì)算遺傳距離，用UPGMA方法進(jìn)行聚類，聚類結(jié)果用Figtree v1.3.1進(jìn)行編輯；用Structure2.3.4軟件［32］分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)，基本原理是假設(shè)樣本存在K個(gè)（K值未知）等位變異頻率特征類型數(shù)，將供試材料歸到K個(gè)群體，使得該群體位點(diǎn)頻率都遵循同一個(gè)Hardy-Weinberg平衡［33］。假定材料的群體數(shù)（K）為2—8，并假定各位點(diǎn)相互獨(dú)立進(jìn)行分析，將MCMC （markov chain monte carlo）開始時(shí)的不作數(shù)迭代（length of burnin period）設(shè)為30 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000，運(yùn)行10次，K值取平均值，然后根據(jù)似然值最大原則選擇合適群體（K）值。

2 結(jié)果

2.1 植株性狀的相關(guān)和主成分分析

由表2可知，葉長(zhǎng)和葉寬呈極高程度正相關(guān)，相關(guān)性達(dá)極顯著水平（r=0.98，P＜0.01）。主莖節(jié)數(shù)和主莖粗呈較高的正相關(guān)性，且相關(guān)性達(dá)極顯著水平（r=0.71，P＜0.01）。株高與主莖粗、葉長(zhǎng)和葉寬，主莖分枝和主莖粗的相關(guān)系數(shù)r均大于0.5，在極顯著水平（P＜0.01）上呈中等程度的正相關(guān)。運(yùn)用主成分分析對(duì)83個(gè)苦蕎資源的8個(gè)植株性狀進(jìn)行分析，其中前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.22％，包含了所有植株性狀的大部分遺傳信息，而有14.8％的信息丟失（表3），所以前4個(gè)主成分基本可以顯示苦蕎種質(zhì)資源植株性狀的相關(guān)性關(guān)系。每個(gè)特征向量對(duì)應(yīng)每個(gè)表型植株性狀的分量是該性狀對(duì)此主成分負(fù)荷相對(duì)大小和作用方向的反應(yīng)。其中，PV（1）貢獻(xiàn)率39.38％，主莖粗、葉長(zhǎng)、株高和葉寬的絕對(duì)值較大，說(shuō)明主莖粗、葉長(zhǎng)、株高和葉寬對(duì)PV（1）的貢獻(xiàn)率最大；PV（2）的貢獻(xiàn)率為21.37％，主莖節(jié)數(shù)、生育期和葉寬的絕對(duì)值較大，說(shuō)明主莖節(jié)數(shù)、生育期和葉寬對(duì)PV（2）貢獻(xiàn)率較大；PV（3）的貢獻(xiàn)率為12.67％，千粒重的絕對(duì)值大于其他性狀，說(shuō)明千粒重對(duì)PV（3）的貢獻(xiàn)率較大；PV（4）的貢獻(xiàn)率為11.81％，生育期的絕對(duì)值大于其他性狀，說(shuō)明生育期對(duì)PV（4）得貢獻(xiàn)率最大。

表2　8個(gè)植株性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of 8 phenotypic traits

2.2 植株性狀的遺傳多樣性分析

2.2.1 83份種質(zhì)資源植株性狀分布頻次 各資源的平均生育期為67 d，主要集中在3—8級(jí)，占種質(zhì)的88.0％；千粒重平均為21.5 g，集中在1—4級(jí)，占種質(zhì)的91.6％；平均株高為84.9 cm，主要集中在2—8級(jí)，占種質(zhì)的 88.0％，各資源之間差異較大；平均主莖節(jié)數(shù)為19節(jié)，主要集中在1—6級(jí)，占種質(zhì)的90.4％，差異較大；平均主莖分枝為6個(gè)，集中在1—7級(jí)，占種質(zhì)的96.4％，差異較大；平均主莖粗6.06 mm，集中在1—7級(jí)，占種質(zhì)的94％，差異較大；平均旗葉長(zhǎng)5.99 cm，集中在2—8級(jí)，占種質(zhì)的89.2％，差異較大；平均旗葉寬5.4 mm，集中在2—8級(jí)，占種質(zhì)的84.3％，差異較大（圖1）。

表3　8個(gè)植株性狀中前4個(gè)主成分的特征向量、主成分值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 3 Power vector （PV）， eigen values （E）， contribution rate （CR）， and cumulative contribution rate （CCR） of the first four principal components based on 8 phenotypic traits

GS：生育期；TSW：千粒重；PH：株高；NMS：主莖節(jié)數(shù)；BMS：主莖分枝；DMS：主莖粗；LL：葉長(zhǎng)；LW：葉寬。下同GS： Growth stage； TSW： Thousand seeds weight； PH： Plant height； NMS： Node No.of main stem； BMS： Branches No.of main stem； DMS： Diameter of main stem； LL： Leaf length； LW： Leaf width. The same as below圖1　8個(gè)植株性狀的頻次值分布Fig. 1 Distribution diagram of eight phenotypic traits based on frequence

2.2.2 不同地理來(lái)源的遺傳多樣性分析 由表 4可知，83份苦蕎種質(zhì)資源的單株株高、主莖粗變異系數(shù)最大，遺傳變異最豐富。不同來(lái)源地種質(zhì)資源植株性狀差異較大，其中，寧夏苦蕎的平均千粒重最大，云南苦蕎的平均生育期最長(zhǎng)，貴州苦蕎的平均葉長(zhǎng)最長(zhǎng)，西藏苦蕎的平均主莖節(jié)數(shù)、主莖分枝、主莖粗最高，四川苦蕎的平均株高、葉寬最大。甘肅資源的變異系數(shù)平均值最大，達(dá)18.84％，其次為西藏，變異系數(shù)平均值為18.78％，表明甘肅和西藏種質(zhì)資源具有更豐富的遺傳變異。西藏植株性狀的遺傳多樣指數(shù)H′均值最高，達(dá)1.82，其次為四川，遺傳多樣性指數(shù)H′均值達(dá)1.78，說(shuō)明西藏和四川的苦蕎種質(zhì)資源的表型遺傳多樣性較豐富且分布均衡。四川生育期、株高、主莖分枝的遺傳多樣性指數(shù)H′最高；陜西葉寬的遺傳多樣性指數(shù)H′最高；云南千粒重的遺傳多樣性指數(shù)H′最高；西藏主莖節(jié)數(shù)、葉長(zhǎng)的遺傳多樣性指數(shù)H′最高；貴州主莖粗的遺傳多樣性指數(shù)H′最高。

表4　不同來(lái)源地的苦蕎種質(zhì)資源植株性狀的比較Table 4 Comparison of tartary buckwheat phenotypic traits in different regions

進(jìn)一步對(duì)不同地理來(lái)源的苦蕎資源進(jìn)行主成分分析，第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為 99.2％，是最重要的主成分，前兩個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率99.92％，因此前兩個(gè)主成分基本可以顯示各地理來(lái)源苦蕎群體的相似性關(guān)系。以第一個(gè)主成分（PC1）為橫坐標(biāo)，第二個(gè)主成分（PC2）為縱坐標(biāo)，得到苦蕎7個(gè)來(lái)源地區(qū)分布的散點(diǎn)圖（圖 2）。陜西、甘肅和寧夏位于圖中的下半?yún)^(qū)，云南、西藏、貴州和四川位于圖中的上半?yún)^(qū)，其中陜西、甘肅和寧夏群體，四川、西藏和貴州群體分布集中。

2.3 SSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析

2.3.1 SSR引物擴(kuò)增的多態(tài)性 13條SSR核心引物在 83份苦蕎種質(zhì)資源中平均檢測(cè)到等位基因數(shù)量35.8個(gè)，平均基因頻率0.27，平均基因多樣性0.85，平均多態(tài)信息量0.84（表5）。其中引物th3a-ca7擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最多（28），th26-ca49檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多（58），th3a-ca7重要等位基因頻率最高（0.86），se13-gt11、fes1286和th26-ca49基因多樣性和多態(tài)信息含量均最高，均為0.98。

圖2　7個(gè)苦蕎來(lái)源地區(qū)植株性狀主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of 7 different geographical populations based on plant traits

表5　13條引物的序列和基本參數(shù)Table 5 General traits of the 13 primers in tartary buckwheat

2.3.2 基于 SSR分析的苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性83份苦蕎種質(zhì)資源按地理來(lái)源劃分7個(gè)組群，各組群的遺傳多樣性見表6。其中，寧夏重要基因頻率最高；陜西等位基因數(shù)量最多、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息量最高。不同地理來(lái)源的遺傳多樣性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)資源份數(shù)與4個(gè)多態(tài)性指標(biāo)呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），4個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)也呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）（表7）。不同地理來(lái)源的苦蕎資源遺傳距離利用Nei′s1983方法計(jì)算（表8），陜西的苦蕎資源群體與寧夏、甘肅群體的遺傳距離接近，與云貴川藏群體的遺傳距離較遠(yuǎn)。進(jìn)一步利用UPGMA方法對(duì)不同地理來(lái)源地苦蕎群體進(jìn)行聚類（圖 3），表明陜甘寧苦蕎種質(zhì)資源的遺傳距離較近，云貴川藏的苦蕎種質(zhì)資源遺傳距離較近，北方產(chǎn)區(qū)（陜西、甘肅和寧夏）與西南產(chǎn)區(qū)（云南、貴州、四川和西藏）的遺傳距離較遠(yuǎn)，可能是不同地理來(lái)源的苦蕎種質(zhì)資源存在一定的地理隔離，這種地理隔離造就了相似產(chǎn)區(qū)苦蕎種質(zhì)資源的相似性。

表6　不同地理來(lái)源苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性Table 6 Genetic diversity of tartary buckwheat in different geographical origins

表7　MAF、NA、GD和PIC相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis of MAF， NA， GD and PIC

表8　不同地區(qū)苦蕎資源的遺傳距離Table 8 Genetic distance of tartary buckwheat resources in different regions

2.3.3 基于數(shù)學(xué)模型的遺傳結(jié)構(gòu)分析 基于模型的群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn) 83份苦蕎種質(zhì)資源的等位變異頻率特征類型數(shù)K=3時(shí)，出現(xiàn)拐點(diǎn)（圖4），能夠獲得最大的lnP（D）值，即苦蕎種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)分為 3大類（圖5），這3類種質(zhì)共同構(gòu)成83份苦蕎種質(zhì)的核心遺傳結(jié)構(gòu)組成。根據(jù)群體遺傳結(jié)構(gòu)將苦蕎資源劃分為3個(gè)類群（表9），其中，紅色類群包括31份材料，來(lái)自西南產(chǎn)區(qū) 26份，占 83.9％；綠色類群包括12份材料，來(lái)自北方產(chǎn)區(qū)10份，占83.3％；藍(lán)色類群包括40份材料，來(lái)自西南產(chǎn)區(qū)30份，占75.0％。

圖3　不同地理來(lái)源苦蕎群體的UPGMA樹Fig. 3 The tree of tartary buckwheat populations in different regions

圖4　K值與lnP（D）折線圖Fig. 4 Lin graph of K value with lnP（D）

2.3.4 基于Nei′s遺傳距離的聚類分析 將83份苦蕎種質(zhì)資源通過(guò) Nei′s方法計(jì)算遺傳距離，利用UPGMA方法聚類，然后用Figtree V1.3.1對(duì)樹形圖進(jìn)行編輯（圖 6），發(fā)現(xiàn)不同地理來(lái)源的苦蕎資源在群體中穿插分布，沒(méi)有明顯的地理來(lái)源地分化。各個(gè)地理來(lái)源的個(gè)體在聚類群中大部分呈分散分布，例如來(lái)自陜西的1—16號(hào)材料等，但同一來(lái)源地的材料也具有一定的相似性，聚在一個(gè)亞類群，例如來(lái)自寧夏的80號(hào)、82號(hào)和83號(hào)材料，來(lái)自甘肅的75號(hào)、76號(hào)、77號(hào)和78號(hào)材料，來(lái)自貴州的48號(hào)、51號(hào)、52號(hào)和53號(hào)材料等。從苦蕎產(chǎn)區(qū)看，來(lái)自同一產(chǎn)區(qū)的苦蕎遺傳距離較近，聚在同一亞類群，例如來(lái)自西南產(chǎn)區(qū)的材料19號(hào)、20號(hào)、27號(hào)、50號(hào)、54號(hào)和59號(hào)聚在同一亞類群，材料30號(hào)、31號(hào)、55號(hào)和57號(hào)聚在同一亞類群，來(lái)自北方產(chǎn)區(qū)的材料 1號(hào)、10號(hào)、79號(hào)和81號(hào)聚在同一亞類群等。

圖5　苦蕎種質(zhì)資源群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig. 5 Population genetic structure diagram of tartary buckwheat gerplasms

圖6　苦蕎種質(zhì)資源UPGMA樹Fig. 6 The tree of tartary buckwheat gerplasms

表9　基于模型群體結(jié)構(gòu)分析的苦蕎資源分類Table 9 Cluster of tartary buckwheat gerplasm based on populations genetic structure

3 討論

3.1 苦蕎資源表型性狀遺傳多樣性

作物資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)可以利用表型性狀和分子標(biāo)記進(jìn)行，而不同資源表型性狀的綜合評(píng)價(jià)［29，34-35］和遺傳多樣性分析［36］是進(jìn)行育種研究的重要基礎(chǔ)。目前，苦蕎表型性狀的遺傳多樣性研究多集中在資源的農(nóng)藝特性方面進(jìn)行，通過(guò)對(duì)農(nóng)藝性狀的標(biāo)準(zhǔn)化處理來(lái)進(jìn)行主成分分析和聚類分析，得到不同的資源類群劃分［37］。為了進(jìn)一步理解中國(guó)苦蕎產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源植株性狀的遺傳多樣性，采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和主成分分析方法對(duì)苦蕎產(chǎn)區(qū)資源的表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析。本研究表明，陜西資源的葉寬遺傳多樣性指數(shù) H′最高；云南資源的千粒重遺傳多樣性H′最高；貴州資源的主莖粗遺傳多樣性H′最高；西藏資源的主莖節(jié)數(shù)和株高遺傳多樣性H′最高；四川資源的生育期、株高、主莖分枝的遺傳多樣性H′最高，說(shuō)明中國(guó)不同的苦蕎產(chǎn)地種質(zhì)資源表型遺傳多樣性豐富，可以為育種研究、基礎(chǔ)研究和復(fù)雜性狀的機(jī)理解析提供豐富的材料［38］。同時(shí)，不同來(lái)源地群體的主成分分析表明北方產(chǎn)區(qū)（陜西、甘肅和寧夏）的植株性狀具有一定的相似性，西南產(chǎn)區(qū)（云南、貴州、四川和西藏）的植株性狀具有一定的相似性，這些結(jié)果說(shuō)明中國(guó)苦蕎種質(zhì)資源的植株性狀存在一定的地區(qū)差異，相似產(chǎn)區(qū)的植株性狀具有一定的相似性，不同產(chǎn)區(qū)植株性狀差異較大，這一結(jié)果與李瑞國(guó)等［7］和高金鋒等［8］的研究結(jié)果相似，原因可能是不同產(chǎn)區(qū)苦蕎的生長(zhǎng)環(huán)境造就了不同產(chǎn)區(qū)苦蕎資源植株性狀的差異，例如北方產(chǎn)區(qū)干旱少雨和西南產(chǎn)區(qū)濕潤(rùn)冷涼等條件［39］。

3.2 苦蕎種質(zhì)資源的遺傳多樣性

從分子水平上看，PIC越高，物種遺傳差異越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景越復(fù)雜。當(dāng)PIC＞0.5時(shí)該基因座位高度多態(tài)性；當(dāng)0.25＞PIC＞0.5時(shí)，為中度多態(tài)性；PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)性［40］。本研究采用13條引物擴(kuò)增得到的PIC平均為0.84，擴(kuò)增結(jié)果顯示中國(guó)苦蕎種質(zhì)資源具有高度的多態(tài)性。張曉麗等［41］研究發(fā)現(xiàn)選育品種的PIC和基因多樣性均低于地方品種，可能是品種改良過(guò)程中導(dǎo)致等位基因數(shù)下降多態(tài)性降低。中國(guó)苦蕎育種還處于初級(jí)水平，不同資源之間的遺傳物質(zhì)交換程度還比較低，而中國(guó)苦蕎資源的PIC較高，遺傳多樣性豐富，可以為品種選育提供豐富的材料。不同產(chǎn)區(qū)的群體結(jié)構(gòu)分析顯示，北方苦蕎產(chǎn)區(qū)的多樣性水平要低于西南苦蕎產(chǎn)區(qū)的，這與苦蕎的起源和優(yōu)生環(huán)境存在一定的關(guān)系［42-44］。對(duì)北方苦蕎產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地的分析顯示，陜西群體的多態(tài)性最高、遺傳多樣性豐富，可能是陜西群體在苦蕎外源基因?qū)?、新品種選育、遺傳群體構(gòu)建和異地資源引進(jìn)等方面不同導(dǎo)致該群體的多態(tài)性豐富；甘肅和寧夏群體的多態(tài)性較低，可能是近些年苦蕎種植面積銳減，一些地方種質(zhì)資源消失有關(guān)。西南苦蕎產(chǎn)區(qū)不同地區(qū)的PIC差異不大，可能是因?yàn)槲髂峡嗍w產(chǎn)區(qū)苦蕎資源大多是當(dāng)?shù)氐牡胤饺后w，地理起源一致，經(jīng)過(guò)不同的階段發(fā)展成不同的群體，遺傳多樣性差異不大。

3.3 苦蕎種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)

WRIGHT［45］研究表明群體的遺傳結(jié)構(gòu)是遺傳變異在群體內(nèi)、群體間的分布以及在時(shí)間上的變化，遺傳變異是遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)?；诓煌乩韥?lái)源的遺傳距離的聚類分析發(fā)現(xiàn)苦蕎群體大體上分為3個(gè)類群，西藏、貴州、四川為1類，云南1類，陜甘寧為1類，說(shuō)明相似的產(chǎn)區(qū)遺傳距離比較接近；基于不同材料的遺傳距離的聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的苦蕎種質(zhì)資源分布穿插于聚類圖中，沒(méi)有明顯的地理來(lái)源地分化，但相同產(chǎn)區(qū)的資源遺傳背景具有一定的相似性，親緣關(guān)系較近。通過(guò)群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析將83份苦蕎種質(zhì)資源分為3個(gè)類群，并了解單個(gè)資源趨向群體的比例，獲得每個(gè)樣本的遺傳組成信息，進(jìn)一步的表現(xiàn)資源之間的親緣關(guān)系，其中遺傳結(jié)構(gòu)充分證明了不同產(chǎn)區(qū)之間種質(zhì)資源的相似性，2個(gè)重要的遺傳結(jié)構(gòu)中大部分材料均來(lái)自西南苦蕎產(chǎn)區(qū)（83.9％和75.0％）說(shuō)明中國(guó)西南產(chǎn)區(qū)的苦蕎種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性；另外一個(gè)重要的遺傳結(jié)構(gòu)材料來(lái)自北方產(chǎn)區(qū)（83.3％），說(shuō)明北方產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源區(qū)別于西南產(chǎn)區(qū)，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳結(jié)構(gòu)。遺傳距離較近的個(gè)體可能是親緣關(guān)系較近的資源，例如來(lái)自云南中甸73號(hào)資源和來(lái)自陜西太白12號(hào)資源，雖然地理來(lái)源存在差異，但是它們遺傳距離接近，同時(shí)相似的適生環(huán)境［46］、遺傳漂變、交配系統(tǒng)和基因流［47］，也可能改變了原有的遺傳物質(zhì)組成，進(jìn)而聚類到一起；來(lái)自寧夏鹽池81號(hào)和固原79號(hào)，來(lái)自甘肅通渭75和鎮(zhèn)原77號(hào)，這些資源遺傳組成相似但來(lái)源地不同，這可能是地區(qū)相互引種、人工選擇過(guò)程中對(duì)同一資源賦予了不同的名稱［10］。

4 結(jié)論

不同來(lái)源地的苦蕎資源遺傳多樣性在植株性狀和分子水平具有一致性，西南產(chǎn)區(qū)（云南、貴州、四川和西藏）的遺傳多樣性高于北方產(chǎn)區(qū)（陜西、寧夏和甘肅），且不同來(lái)源地的苦蕎種質(zhì)資源具有明顯的產(chǎn)區(qū)分化。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Analysis of Genetic Diversity and Structure of Tartary Buckwheat Resources from Production Regions

QU Yang1，2， ZHOU Yu1， WANG Zhao2， WANG Peng-ke1， GAO Jin-feng1， GAO Xiao-li1， FENG Bai-li1
（1College of Agronomy， Northwest A & F University /State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas， Yangling 712100，Shaanxi；2Baoji Institute of Agricultural Science， Qishan 722400， Shaanxi）

Abstract：【Objective】The objective of this study was to understand the genetic diversity and population structure of tartary buckwheat resources from different production regions and to provide theoretical foundation of functional gene and resources use. 【Method】 Eight phenotypic traits were evaluated by correlation and principal component analyses. Plants were cultivated in the greenhouse， and 10 fresh leaves were selected in the three leaf stage. DNA of tartary buckwheat was extracted using the CTABmethod， and then they were amplified based on the SSR marker， detected by the electrophoresis， and took photos and saved. 0， 1 matrix was structured based on the detection of SSR， and eighty-three materials were used to analyze genetic diversity and genetic structure by PowerMarker3.25 and Structure2.3.4 software.【Result】Distribution of the eight phenotypic traits were scattered with most apparently interrelated. The cumulative contribution rate of four principal components formerly reached up to 85.2％， which may show the relative relationships of the plant traits. The variation coefficient and genetic diversity of plant height and main stem diameter contributed the most to this metrics between all plant traits. Among the distinct geographical regions， the mean H′ （1.82） of Tibet population was the richest， and in Sichuan population was the second with a mean H′ of 1.78， just slightly lower. Genetic diversity of plant traits from the distinct regions showed that the H′ of growth stage， plant height， and main stem branch number in Sichuan population were the highest， while the H′ of leaf width was the richest trait in the Shaanxi population， and of 1000-seeds weight H′ in Yunnan population was the richest trait for plants of that region. Principal component analysis of 7 different geographical populations showed plant traits of similar production regions may have a close relation. Genetic diversity of 83 individuals of tartary buckwheat germplasm resources was detected by 13 pairs of SSR primes. A total of 208 loci were detected，among which 200 （96.2％） were polymorphous. The number of amplified fragments and polymorphous fragments per primer combination were 16 and 15.4； the number of alleles varied from 4 to 58， and the frequencies of major alleles varied from 0.02 to 0.86； gene diversity was between 0.38 and 0.98， and polymorphic information index was 0.35-0.98. Genetic diversity of different production regions showed that genetic structure of the northerly populations showed close relationship， and genetic structure of southwesterly population was also so， which showed the relationship between population cluster and production regions. The number of alleles （12.1）， genetic diversity index （0.84）， and polymorphic information content （0.83） in Shaanxi were the highest among the regions. All resources were divided into three clusters based on modules by genetic structure analysis， and cluster analysis based on genetic distance showed dispersive resources and no regionalization. Genetic distances were close from plant materials of the same production regions among different resources.【Conclusion】Polymorphic information contents of tartary buckwheat from main production regions were high， and the genetic diversity among them was rich. Resource interflow and genetic material exchange were observed in northerly and southwesterly production regions.

Key words：tartary buckwheat； genetic diversity； genetic structure； principal component analysis （PCA）； correlation analysis；clustering analysis

收稿日期：2016-01-06；接受日期：2016-04-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31071472）、國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31501365）、陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012K01-09）、陜西省小雜糧產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系