徐晨希，王夢琦，朱小瑞，張玉鋒，夏海磊，劉賢慧，王小龍，張慧敏，楊章平，毛永江

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

?

中國荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP突變對乳中脂肪酸組成的影響

徐晨希，王夢琦，朱小瑞，張玉鋒，夏海磊，劉賢慧，王小龍，張慧敏，楊章平，毛永江

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

摘要：【目的】FADS2是多不飽和脂肪酸合成中關鍵的限速酶之一，可催化食物中亞油酸（LNA, C18：2n6）合成γ-亞麻酸（GLA, C18：3n6）、二十碳五烯酸（EPA, C20：5n3）、二十二碳六烯酸（DHA, C22：6n3）等長鏈脂肪酸。試驗旨在探討中國荷斯坦牛FADS2基因3′端非編碼區(qū)SNP突變對乳中脂肪酸含量的影響。【方法】隨機選擇20頭無親緣關系的中國荷斯坦牛樣本，用直接測序列法檢測FADS2基因3′端非編碼區(qū)SNP突變位點。再以江蘇某大型奶牛場551頭中國荷斯坦牛為材料，用飛行時間質譜法對前期發(fā)現的2個SNP位點進行檢測，同時利用最小二乘模型分析了SNP突變及其單倍型對乳中脂肪酸含量及其不飽和指數的影響?！窘Y果】 中國荷斯坦牛FADS2基因3′端非編碼區(qū)存在3個SNP突變位點：c.1571 A＞G、c.2743 A＞G、c.2776 A＞G。c.1571 A＞G位點GG型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.800，G為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.887。c.2776 A＞G位點AA為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為 0.673，A為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為 0.819。Χ2檢驗表明：c.2776 A＞G位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05） ，而c.1571 A＞G位點基因型分布均偏離Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.05）。FADS2基因c.1571 A＞G位點與c.2776 A＞G位點間連鎖不平衡系數r2為0.028，未達到顯著水平（P＞0.05）。c.1571 A＞G位點與c.2776 A＞G位點有3種單倍型，GA、GG和AA頻率分別為0.705、0.181和0.114。多因素方差分析表明：FADS2-1571對C14：1含量、C14和C18不飽和指數的影響達到極顯著水平（P＜0.01），對C18：0、SFA和MUFA含量的影響達到顯著水平（P＜0.05）。GG型個體乳中C14：1含量、C14和C18不飽和指數顯著高于AG型（P ＜0.05）。FADS2-2776位點對C16：1含量、 C16和C20不飽和指數的影響達到極顯著水平（P＜0.01），對C14：1含量的影響達到顯著水平（P＜0.05），GG型個體乳中C16：1含量、C16和C20不飽和指數顯著高于AG型和AA型（P＜0.05）。同時，FDAS2-1571-2776單倍型對C16：1含量和C20不飽和指數的影響達到顯著水平（P＜0.05），單倍型GG型個體乳中C16：1含量和C20不飽和指數顯著高于GA型和AA型（P＜0.05）?！窘Y論】FADS2基因3′端非編碼區(qū)SNP突變對中國荷斯坦牛乳中脂肪酸組成有重要影響。在進一步驗證其功能情況下，可作為影響中國荷斯坦奶牛乳脂肪酸組成的主效基因加以利用。

關鍵詞：中國荷斯坦牛；FADS2；SNPs；脂肪酸組成

聯系方式：徐晨希， E-mail：chouchouxcx@163.com。王夢琦，E-mail：770406499@qq.com。徐晨希和王夢琦為同等貢獻作者。通信作者毛永江，E-mail：cattle@yzu.edu.cn

0 引言

【研究意義】乳脂是牛奶重要的組成部分，乳脂的營養(yǎng)價值主要決定于乳中脂肪酸（fatty acid，FA）的構成。脂肪酸按其飽和程度可分為飽和脂肪酸（saturated fatty acid， SFA）、單不飽和脂肪酸（mono unsaturated fatty acid，MUFA）和多不飽和脂肪酸（poly unsaturated fatty acid，PUFA），按其鏈長度可分為長鏈脂肪酸（long chain fatty acids， LCFA， 13碳以上）、中鏈脂肪酸（middle chain fatty acids， MCFA，含6-12碳）和短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA， 5碳以下）［1］。研究發(fā)現普通牛奶中 SFA、MUFA和PUFA的比值通常在70：25：5［2］。牛奶中不飽和脂肪酸以十八碳系列為主，主要有油酸（C18：1），亞油酸（C18：2），亞麻酸（C18：3）。當然，多不飽和脂肪酸中還含有對人體很有益的花生四烯酸（C20：4）和二十二碳六烯酸（C22：6，簡稱DHA）［2］。隨著對乳脂的深入研究， 乳中PUFA的營養(yǎng)保健作用及其對乳制品組織結構和風味的影響作用開始受到人們普遍關注。【前人研究進展】最近的研究表明：PUFA具有促進動物生長發(fā)育、調控編碼脂類代謝相關基因的表達、抑制炎癥反應及促進免疫機能、提高動物繁殖性能等功能［3］。牛奶中FA的組成不僅受到環(huán)境因素的影響，更多的受內在因素影響，如物種、品種、基因、泌乳階段、胎次、擠奶頻率等［4-7］。脂肪酸脫氫酶（fatty acid desaturases，FADS）是一類能催化脂肪酸生成PUFAs的關鍵酶。其中FADS2是FADS基因家族中最重要的成員之一，是多不飽和脂肪酸合成代謝途徑中關鍵的限速酶，可催化 2種必需脂肪酸亞油酸（（LA， C18：2）和α-亞麻酸（ALA， C18：3）轉化為γ-亞麻酸（GLA， C18：3）和十八碳四烯酸（18：4），并進一步脫氫形成長鏈多不飽和脂肪酸（long chain- poly unsaturated fatty acids， LCPUFAS），包括花生四烯酸（ARA，20：4n-6）、二十碳五烯酸（EPA， 20：5n-3） 和二十二碳六烯酸（DHA， 22：6n-3）等［8-11］。NWANKWO等［12］、NAKAYAMA等［13］的研究表明：人 FADS2基因SNP突變影響人體脂肪組織及血漿中 PUFA的含量，從而影響人類健康。最近人類全基因組關聯分析（genome-wide association studies，GWAS）也證實了FADS2基因對脂類代謝疾病的作用［14-16］。另外，FADS2基因啟動子區(qū)的甲基化對人類肝臟FADS2基因的表達活性也有較大影響［17］。在家畜方面也有部分有關 FADS2基因與生產性能，特別是脂肪產量和脂肪酸組成有關的報道。RENAVILLE 等［18］研究表明：FADS2基因多態(tài)性顯著影響意大利豬肉中花生四烯酸和亞油酸含量及 γ-亞麻酸與亞油酸的比值；BOSCHETTI 等［19］發(fā)現慢速和中等速度生長的肉雞胸肌中 FADS2基因表達量較高，也具有較高含量的長鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA），同時FADS2基因SNP突變對胸肌中FADS2基因表達量和LCPUFA也有顯著影響；da COSTA等［20］發(fā)現肉牛FADS2基因表達量對其肝臟中脂肪酸組成有顯著影響。奶牛FADS2基因研究方面，IBEAGHA-AWEMU等［21］對加拿大荷斯坦牛FADS2基因SNP多態(tài)性及其與乳中FA含量進行了關聯分析。結果發(fā)現FADS2基因共24個SNP突變，位于內含子、編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)（3′un-transcript region， 3′UTR）的 SNP數量分別為16、1和7個。其中FADS2基因3'UTR 1571 A/G和2776 A/G突變對乳中PUFA有顯著影響。生物信息學分析表明，FADS2基因1571 A/G為miRNA-744結合位點。故推測miRNA-744可通過與FADS2基因結合，從而調控FADS2基因的表達，進而調節(jié)乳中 PUFA含量?！颈狙芯壳腥朦c】在國內，梅秀麗［22］比較了不同飼養(yǎng)方式下優(yōu)質雞 FADS2基因的表達及其對脂肪酸組成的影響，朱世康等［23-26］對雞FADS2基因5′端和3′端SNP多態(tài)及其與部分經濟性狀的相關性進行了研究，但未見其他畜種（包括奶牛）FADS2基因突變及其乳中FA組成方面的研究?！緮M解決的關鍵問題】檢測中國荷斯坦牛FADS2基因3′UTR SNP突變，同時分析SNP突變對乳中脂肪酸組成的影響，以期為中國荷斯坦牛乳中脂肪酸含量的分子育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2011年3—4月于江蘇省揚州市某大型奶牛場采集中國荷斯坦牛血樣共 551頭。采用尾靜脈采血 10 mL/頭，ACD抗凝劑，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。采樣時，同時選擇體況相近（BCS=3.0±0.5）、無臨床乳房炎、胎次在2—3胎、處于泌乳中后期（產奶100—300 d）的中國荷斯坦牛共300頭，在進行DHI測定時，取全天混合奶樣（早∶中∶晚=4∶3∶3）100 mL，其中50 mL送上海光明 DHI中心進行乳中體細胞數測定，另外50 mL用于實驗室脂肪酸測定。牧場基本情況如下：全場共有奶牛1 000余頭，其中成年泌乳奶牛近500頭，散欄飼養(yǎng)，魚骨式擠奶大廳進行擠奶，日擠奶 3次，采用全混合日糧（total mixed ration， TMR）飼喂。

1.2 DNA提取及FADS2基因3′端SNP突變檢測

奶牛血液基因組DNA采用常規(guī)酚氯仿提取法，TE溶解，取部分DNA樣品稀釋至100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據GenBank公布的牛的FADS2基因DNA序列（BC123735.1）， 參考IBEAGHA-AWEMU等［21］對加拿大荷斯坦牛FADS2基因3′檢測到的SNP位點信息（c.1571 A＞G、c.2743 A＞G和c.2776 A＞G），用Primer5.0 軟件設計2對引物，用于擴增3′端包括上述3個突變位點在內的DNA片段。PCR引物信息及擴增條件見表1。

表1　FADS2基因3'端PCR引物序列及擴增條件Table 1 The primers and PCR condition for amplification of 3' UTR of FADS2 gene

從所采551個樣本中隨機選擇20個DNA樣品，經PCR 擴增、測序，所得序列用DNAMAN（Ver 5.2）與GenBank中FADS2參考序列（BC123735.1）進行比對，確認中國荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP突變位點。經對 20個樣本的初步分析，c.2743 A＞G和c.2776 A＞G由于距離較近，連鎖程度較高，連鎖不平衡系數r2達0.7以上。故在接下來的SNP分型過程中，只對c.1571 A＞G和c.2776 A＞G進行分析。對大樣本 FADS2 SNP突變檢測采用飛行時間質譜法（MassARRAY? MALDI-TOF System，Sequenom，Inc.，USA）。同時，為保證SNP分析結果可靠性，其中40個樣本重復測定2次（測試員并不知道這個40個是重復樣本）。結果表明該方法SNP分型結果準確性為100％。

1.3 脂肪酸測定

脂肪酸測定在采樣后3個月內完成。根據食品安全國家標準-嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定（GB 5413.27-2010）并加以改進（食品安全國家標準）［27］，用氣相色譜儀進行測定（美國Agilent7890A，色譜柱為DB-23， 30 m×0.25 mm×0.25 μm），氣相色譜儀使用程序升溫進行檢測［28］。使用Sigma公司的37種脂肪酸甲酯的混標作為標準品，用氣相色譜儀對樣品中所有脂肪酸進行測定。詳細方法介紹見文獻［29］。

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 遺傳學分析 用遺傳學軟件 Shesis進行常規(guī)群體遺傳學統(tǒng)計分析（包括基因頻率、基因型頻率、Hardy-Weinberg平衡檢測等），同時進行連鎖不平衡和單倍型分析［30］。

1.4.2 關聯分析 利用多因素方差分析法分析FADS2基因多態(tài)性及其單倍型對乳中脂肪酸組成的影響，模型如下：

式中：Yijk為原料乳脂肪酸的測定值；μ為總體均值；Mi為泌乳階段的固定效應（i =1，2），泌乳階段按100 d間隔劃為一個階段，即泌乳后101—200 d為泌乳中期，201—300 d為泌乳后期；Pj為胎次固定效應（j=1，2）；Gk為FADS2基因SNP位點基因型或單倍型的固定效應，eijk為隨機殘差。不同基因型或單倍型間的多重比較用Duncan法。分析單倍型對乳中FA組成的影響時，只選擇在2個位點均是純合子的個體進行分析。另外，由于部分牛只乳中體細胞數大于5.0×105·mL-1，初步認定患有隱性乳房炎，在最后進行關聯分析時刪除了這部分樣品的數據。最后用于FADS2基因 SNP多態(tài)與脂肪酸含量分析的樣品量為275頭。

以上統(tǒng)計分析由 SPSS軟件（Ver 16.0）GLM （General Linear Model）過程完成。

2 結果

2.1 FADS2基因多態(tài)性檢測

對FADS2基因3′端2對引物擴增的PCR產物進行測序和比對分析，發(fā)現中國荷斯坦牛FADS2基因3′端SNP存在3個SNP突變位點：c.1571 A＞G、c.2743 A＞G、c.2776 A＞G。結果與IBEAGHA-AWEMU等［21］對加拿大荷斯坦牛FADS2基因3′檢測到的SNP位點信息完全一致，沒有發(fā)現新的突變位點。另外，由于c.2743 A＞G和c.2776 A＞G由于距離較近，連鎖程度較高，連鎖不平衡系數r2達0.7以上， 因此在隨后的飛行時間質譜法中，只選擇c.2776 A＞G進行檢測。

表2　FADS2基因 3′UTR等位基因、基因型頻率、單倍型頻率及H-W平衡檢驗Table 2 The frequencies of genotypic， allelic and haplotypes， value of X2test significance for 3′UTR of FADS2 gene

2.2 等位基因、基因型頻率分布及連鎖不平衡分析

如表2表示，c.1571 A＞G位點GG型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.800，G為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.887。c.2776 A＞G位點AA為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.673，A為優(yōu)勢等位基因，基因頻率為0.819。經X2檢驗，c.2776 A＞G位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，而c.1571 A＞G位點基因型分布偏離Hardy-Weinberg平衡。

連鎖不平衡分析表明：c.1571 A＞G位點與c.2776 A＞G位點間連鎖不平衡系數r2為0.028。經檢驗，該連鎖不平衡系數未達到顯著水平（P＞0.05），說明兩位點間不連鎖。單倍型分析表明：c.1571 A＞G位點與c.2776 A＞G位點有3種單倍型，GA、GG和AA頻率分別為0.705、0.181和0.114，AG型在群體中未出現。

2.3 脂肪酸測定

在本研究中，用氣相色譜儀在原料乳中共檢出23種脂肪酸（表3）。其中棕櫚酸（C16：0）所占比例最大（29.56％），油酸（C18：1）次之（24.32％），豆蔻酸（C14：0）、硬脂酸（C18：0）和亞油酸（C18：2）都占有較高比例，而長鏈多不飽和脂肪酸（C20：3、C20：4和C22：6等）含量相對較少。就不飽和指數而言，C20的不飽和指數最高（88.18±1.06），其次為C18（70.13±0.41），最低為C16（4.66±0.21）；SFA、MUFA和PUFA的比例分別為66.68∶27.43∶5.89，SCFA∶MCFA∶LCFA的比例分別為3.30∶17.12∶79.58。

表3　原料乳脂肪酸所占比例Table 3 The proportion of each milk fatty acids in raw milk （M±SD）

2.4 FADS2基因對乳中脂肪酸類型及脂肪酸飽和指數的影響

FADS2基因1571位點不同基因型乳中不同類型脂肪酸含量及方差分析見表4。由表4可知：FADS2 1571位點對C14：1含量、C14和C18不飽和指數的影響達到極顯著水平（P＜0.01），對 C18：0、SFA和MUFA含量的影響達到顯著水平（P＜0.05），對C4：0含量和短鏈FA的影響接近顯著水平（0.1＞P＞0.05），對其它不同類型脂肪酸含量及FA不飽和指數無顯著影響（P＞0.05）。多重比較表明：GG型個體乳中C14：1含量、C14和C18不飽和指數顯著高于AG型（P＜0.05），C18：0和SFA含量顯著低于AG型（P＜0.05）；AA型個體乳中 MUFA含量顯著高于 AG型（P＜0.05）。

FADS2基因2776位點不同基因型乳中不同類型脂肪酸含量及方差分析見表5。由表5可知：FADS2 2776位點對C16：1含量、 C16和C20不飽和指數的影響達到極顯著水平（P＜0.01），對C14：1含量的影響達到顯著水平（P＜0.05），對C14：0 和C20：0含量的影響接近顯著水平（0.1＞P＞0.05），對其他不同類型脂肪酸含量及 FA不飽和指數無顯著影響（P＞0.05）。多重比較表明：GG型個體乳中C16：1含量、C16和C20不飽和指數顯著高于AG型和AA型（P ＜0.05），AG型個體乳中C14：1含量顯著高于AA型和GG型（P＜0.05）。

FDAS2-1571-2776不同單倍型對乳中不同類型脂肪酸含量及方差分析見表 6。由表 6可知：FDAS2-1571-2776單倍型對C16：1含量和C20不飽和指數的影響達到顯著水平（P＜0.05），對C4：0 含量和C16不飽和指數的影響接近顯著水平（0.1＞P＞0.05），對其他不同類型脂肪酸含量及FA不飽和指數無顯著影響（P＞0.05）。多重比較表明：單倍型GG型個體乳中C16：1含量和C20不飽和指數顯著高于GA型和AA型（P＜0.05）。

表4　 FADS2基因1571位點對不同類型脂肪酸含量的影響Table 4 The effect of FADS2-1571 on the relative content of different kinds of milk fatty acids （％， M±SE）

表5　 FADS2基因2776位點對不同類型脂肪酸含量的影響Table 5 The effect of FADS2-2776 on the relative content of different kinds of milk fatty acids （％， M±SE）

表6　FADS2基因1571-2776不同單倍型對脂肪酸含量的影響Table 6 The effects of haplotypes of FADS2-1571-2776 on the relative content of different kinds of milk fatty acids （％， M±SE）

3 討論

3.1 FADS2基因遺傳多態(tài)性分析

本研究首次對中國荷斯坦牛FADS2基因3′UTR區(qū)部分序列進行測定，發(fā)現 3個 SNP位點，與IBEAGHA-AWEMU等［21］對加拿大荷斯坦牛FADS2基因3′UTR區(qū)檢測到的SNP位點信息進行對比，沒有發(fā)現新的SNP，隨后對其中2個SNP在大群體中進行了檢測。經比較表明：c.1571 A＞G 位點A基因頻率低于加拿大荷斯坦牛相應基因頻率， c.-2776 A＞G位點A基因頻率與加拿大荷斯坦牛相應基因頻率基本一致，這種差異可能是由于所用種公牛不一致造成，同時也說明FADS2基因3′UTR區(qū)c.1571 A＞G與c.-2776 A＞G間連鎖程度很低。另外，由于其他牛種或品種 FADS2基因序列沒有被報道，今后有必要加強這一領域的研究，特別是乳脂率含量較高的品種（如娟姍牛、更賽牛、牦牛、水牛等）。

3.2 FADS2基因多態(tài)與乳脂肪酸組成及不飽和指數的關系

FADS2是PUFA合成代謝途徑中關鍵的限速酶，其基因序列SNP突變對基因表達活性及血液和乳汁等體液中PUFA含量有較大影響，這已得到大量有關人類相關研究的證實［12-13，31-32］。本研究結果表明：FADS2基因 3′ UTR c.1571 A＞G對 C14：1含量、MUFA含量、C14和C18不飽和指數的影響均達到顯著水平（P＜0.05），GG型個體乳中C14：1含量、C14 和 C18不飽和指數顯著高于 AG型（P＜0.05）。IBEAGHA-AWEMU等［21］對加拿大荷斯坦牛 FADS2基因與乳中FA含量的研究也得出類似結論。這說明FADS2基因3′UTR區(qū)c.1571 A＞G對乳中UFA的含量有顯著影響。生物信息學分析表明（Target Scan 7.0，http：//www.targetscan.org/）：該位點是bta-miR-744結合位點，可能是該位點的突變改變了microRNA與基因的結合，從而改變相關基因表達量的變化，最終導致乳中UFA含量的改變，但這一假設需要進一步用試驗來驗證。

在本研究中，FADS2 2776位點對C16：1含量、C16和C20不飽和指數的影響達到極顯著水平（P＜0.01），對C14：1含量的影響達到顯著水平（P＜0.05），GG型個體乳中C16：1含量、C16和C20不飽和指數顯著高于AG型和AA型（P＜0.05）。而IBEAGHAAWEMU等［21］的研究表明：FADS2-2776 G基因顯著增加在乳中 omega-6 FAs（C20：3n6 和 C20：4n6）含量，而A基因顯著降低乳中omega-6 FAs含量。本研究中雖未發(fā)現FADS2 2776位點對C20：3n6和C20：4n6含量的影響，但對C20不飽和指數有顯著影響，且G基因對增加乳中C20：3n6和C20：4n6含量也是有利的。

最后，雖然本研究初步發(fā)現FADS2基因3′UTR區(qū)部分 SNP突變及其單倍型對乳中脂肪酸（特別是PUFA含量）和部分不飽和指數有顯著影響。也應看到，由于各方面原因，本研究原料乳中FA測定的樣本量相對較少，有必要對大樣本奶牛群體進行每月一次的跟蹤測定。如能改進乳中測定方法，在進行奶牛群生產性能測定（dairy herd improvement， DHI）時同時分析乳中FA含量，這對準確估計原料乳中FA含量的遺傳參數和把乳中FA含量納入奶牛的育種目標將大有幫助。

4 結論

在中國荷斯坦牛FADS2基因3′UTR區(qū)檢測到3 個SNP突變，該突變對中國荷斯坦牛乳中脂肪酸組成有重要影響。在進一步驗證其功能情況下，可作為影響中國荷斯坦奶牛乳脂肪酸組成的主效基因加以利用。

References

［1］ HARVATINE K J， BOISCLAIR Y R， BAUMAN D E. Recent advances in the regulation of milk fat synthesis. Animal， 2009（3）：40-54.

［2］ WOODS V B， FEARON A M. Dietary sources of unsaturated fatty acids for animals and their transfer into meat， milk and eggs： a review. Livestock Science， 2009， 126： 1-20.

［3］ LEE H， PARK W J. Unsaturated fatty acids， desaturases， and human health. Journal of Medicinal Food， 2014， 17（2）： 189-197.

［4］ TALPUR F N， BHANGER M I， KHOOHARO A A， MENON G Z. Seasonal variation in fatty acid composition of milk from ruminants reared under the traditional feeding system of Sindh， Pakistan. Livestock Science， 2008， 118： 166-172.

［5］ TALPUR F N， BHANGER M I， KHUHAWAR M Y. Comparison of fatty acid and cholesterol content in the milk of Pakistani cow breeds. Journal of Food Composition and Analysis， 2006， 19： 698-703.

［6］ HADDAD I， MOZZON M， STRABIOLI R， FREGA N C. Stereospecific analysis of triacylglycerols in camel （Camelus dromedarius） milk fat. International Dairy Journal， 2010， 20：863-867.

［7］ WIKING L， NIELSEN J H， B?VIUS A K， EDVARDSSON A，SVENNERSTEN-SJAUNJA K. Impact of milking frequencies on the level of free fatty acids in milk， fat globule size， and fatty acid composition. Journal of Dairy Science， 2006， 89： 1004-1009.

［8］ GUILLOU H， RIOUX V， CATHELINE D， THIBAULT J N，BOURIEL M， JAN S， D'ANDREA S， LEGRAND P. Conversion of hexadecanoicacid to hexadecenoic acid by rat Delta 6-desaturase. The Journal of Lipid Research， 2003， 44（3）： 450-454.

［9］ DANDREA S， GUILLOU H， JAN S， CATHELINE D， THIBAULT J N， BOURIEL M， RIOUX V， LEGRAND P. The same rat Delta6-desaturase not only acts on 18- but also on 24-carbon fatty acids invery-long-chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis. Biochemical Journal， 2002， 361（1）： 49-55

［10］ MARTINELLI N， GIRELLI D， MALERBA C， GUARINI P， ILLIG T，TRABETTI E， SANDRI M， FRISO S， PIZZOLO F， SCHAEFFER L，HEINRICH J， PIGNATTI P F， CORROCHER R， OLIVIERI O. FADS genotypes and desaturase activity estimated by the ratio of arachidonic acid to linoleic acid are associated with inflammation and coronary artery disease. The American Journal of Clinical Nutrition， 2008， 88：941-949.

［11］ KOHAMA T， OLIVERA A， EDSALL L， NAGIEC M M， DICKSON R， SPIEGEL S. Molecular cloning and functional characterization of marine sphingosine kinase. The Journal of Biological Chemistry， 1998，273（37）： 23722-23728.

［12］ NWANKWO J O， SPECTOR A A， DOMANN F E. A nucleotide insertion in the transcriptional regulatory region of FADS2 gives rise to human fatty acid delta-6-desaturase deficiency. The Journal of Lipid Research， 2003， 44（12）： 2311-2319.

［13］ NAKAYAMA K， BAYASGALAN T， TAZOE F， YANAGISAWA Y，GOTOH T， YAMANAKA K， OGAWA A， MUNKHTULGA L，CHIMEDREGZE U， KAGAWA Y， ISHIBASHI S， IWAMOTO S. A single nucleotide polymorphism in the FADS1/FADS2 gene is associated with plasma lipid profiles in two genetically similar Asian ethnic groups with distinctive differences in lifestyle. Human Genetics，2010， 127： 685-690.

［14］ ILLIG T， GIEGER C， ZHAI G， ROMISCH-MARGL W，WANG-SATTLER R， PREHN C， ALTMAIER E， KASTENMULLER G， KATO B S， MEWES H W， MEITINGER T， DE ANGELIS M H，KRONENBERG F， SORANZO N， WICHMANN H E， SPECTOR T D， ADAMSKI J， SUHRE K. A genome-wide perspective of genetic variation in human metabolism. Nature Genetics， 2010， 42（2）：137-141.

［15］ KATHIRESAN S， MELANDER O， GUIDUCCI C， SURTI A，BURTT N P， RIEDER M J， COOPER G M， ROOS C， VOIGHT B F，HAVULINNA A S， WAHLSTRAND B， HEDNER T， CORELLA D，TAI E S， ORDOVAS J M， BERGLUND G， VARTIAINEN E，JOUSILAHTI P， HEDBLAD B， TASKINEN M R， CHEH C N，SALOMAA V， PELTONEN L， GROOP L， ALTSHULER D M，ORHO-MELANDER M. Six new loci associated with blood lowdensity lipoprotein cholesterol， high-density lipoprotein cholesterol or triglycerides in humans. Nature Genetics， 2008， 40（2）： 189-197.

［16］ TANAKA T， SHEN J， ABECASIS G R， KISIALIOU A， ORDOVAS J M， GURALNIK J M， SINGLETON A， BANDINELLI S， CHERUBINI A， ARNETT D， TSAI M Y， FERRUCCI L. Genome-wide association study of plasma polyunsaturated fatty acids in the InCHIANTI study. PLoS Genetics， 2009， 5（1）： e1000338.

［17］ HOWARD T D， MATHIAS R A， SEEDS M C， HERRINGTON D M，HIXSON J E， SHIMMIN L C， HAWKINS G A， SELLERS M，AINSWORTH H C， SERGEANT S， MILLER L R， CHILTON F H. DNA methylation in an enhancer region of the FADS cluster is associated with FADS activity in human liver. PLoS ONE， 2014， 9（5）：e97510.

［18］ RENAVILLE B， PRANDI A， FANB B， SEPULCRI A， ROTHSCHILD M F ， PIASENTIER E. Candidate gene marker associations with fatty acid profiles in heavy pigs. Meat Science ， 2013， 93： 495-500.

［19］ BOSCHETTI E， BORDON A， MELUZZI A， CASTELLINI C， DAL BOSCO A， SIRRI F. Fatty acid composition of chicken breast meat is dependent on genotype-related variation of FADS1 and FADS2 gene expression and desaturating activity. Animal， 2015， 16： 1-9.

［20］ DA COSTA A S H， BESSA R J B， PIRES V M R， ROLO E A，PINTO R M A， FONTES C M G A， PRATES J A M. Is hepatic lipid metabolism of beef cattle influenced by breed and dietary silage level？. BMC Veterinary Research， 2014， 10： 65-78.

［21］ IBEAGHA-AWEMU E M， AKWANJI K A， BEAUDOIN F， ZHAO X. Associations between variants of FADS genes and omega-3 and omega-6 milk fatty acids of Canadian Holstein cows. BMC Genetics，2014， 15： 25

［22］ 梅秀麗. 優(yōu)質雞不同飼養(yǎng)方式下 FADS1-FADS2基因的表達及其對脂肪酸組成的影響［D］. 雅安： 四川農業(yè)大學， 2012. MEI X L. Fatty acid desaturase （FADS1） and fatty acid desaturase 2（FADS2） gene expression and the effects on fatty acids content of high-quality chicken in different housing systems［D］. Ya'an： Sichuan Agricultural University， 2012. （in Chinese）

［23］ 朱世康. 雞FADS2基因5'_端SNP鑒定及啟動子功能分析［D］. 鄭州： 河南農業(yè)大學， 2013. ZHU S K. Polymorphisms in the 5' region of chicken FADS2 gene and the promoter function analysis［D］. Zhengzhou： Henan Agricultural University， 2013. （in Chinese）

［24］ 洪雪瑩. 雞FADS2基因3_UTR區(qū)多態(tài)性檢測及其與經濟性狀關聯性分析［D］. 鄭州： 河南農業(yè)大學， 2012. HONG X Y. Polymorphisns in the 3'UTR region of chicken FADS2 Gene and their association with economic traits［D］. Zhengzhou：Henan Agricultural University， 2012. （in Chinese）

［25］ 盧冉. 雞Δ6脂肪酸脫氫酶基因啟動子區(qū)域多態(tài)性及基因時空表達的研究［D］. 鄭州： 河南農業(yè)大學， 2011. LU R. Study of chickenΔ6 fatty acid desaturase gene's promotor region polymorphism and gene expression［D］. Zhengzhou： HenanAgricultural University， 2011. （in Chinese）

［26］ ZHU S K， TIAN Y D， ZHANG S， CHEN Q X， WANG Q Y， HAN R L，KANG X T. Adjacent SNPs in the transcriptional regulatory region of the FADS2 gene associated with fatty acid and growth traits in chickens. Genetics Molecular Research， 2014， 13（2）： 3329-3336.

［27］ 中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品安全國家標準-嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定： GB 5413.27—2010［S/OL］. 北京： 中國標準出版社，2010. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. National Food Safety Standard-Determination of Fatty Acids in Foods for Infants and Young Children， Milk and Milk Products： GB 5413.27—2010［S/OL］. Beijing： Standards Press of China， 2010. （in Chinese）

［28］ 林秋萍， 李瑾， 馮書惠. 氣相色譜法快速測定牛奶中脂肪酸. 食品科學， 2005， 26（8）： 346-348. LIN L P， LI J， FENG S H. Fast quantitative determination of fatty acid in milk. Food Science. 2005， 26（8）： 346-348. （in Chinese）

［29］ 毛永江， 常玲玲， 楊章平， 吳海濤， 陳瑩， 施雪奎， 李云龍， 梁祥煥，尹召華. 中國荷斯坦牛乳中體細胞評分與脂肪酸含量和組成的相關分析. 中國農業(yè)科學. 2011， 44（24）： 5073-5082. MAO Y J， CHANG L L， YANG Z P， WU H T， CHEN Y， SHI Y K， LI Y L， LIANG X H， YIN Z H. Correlation between the SCS and the amount and composition of fatty acids in milk of Chinese Holstein. Scientia Agricultura Sinica， 2011， 44（24）： 5073-5082. （in Chinese）

［30］ SHI Y Y， HE L. SHEsis， a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium， haplotype construction， and genetic association at polymorphism loci. Cell Research， 2005， 15（2）： 97-98.

［31］ SOLAKIVI T， KUNNAS T， JAAKKOLA O， RENKO J， LEHTIM?KI T，NIKKARI S T. Delta-6-desaturase gene polymorphism is associated with lipoprotein oxidation in vitro. Lipids in Health and Disease， 2013，12： 80.

［32］ SONG Z K， CAO H Y， QIN L， JIANG Y F. A case-control study between gene polymorphisms of polyunsaturated fatty acid metabolic rate-limiting enzymes and acute coronary syndrome in Chinese Han Population. BioMed Research International， 2013， ID： 928178. http：ldx.doi.org/10.1155/2013/928178.

（責任編輯 林鑒非）

Effects of SNPs in the 3' Untranslated Regions of FADS2 on the Composition of Fatty Acids in Milk of Chinese Holstein

XU Chen-xi， WANG Meng-qi， ZHU Xiao-rui， ZHANG Yu-feng， XIA Hai-lei， LIU Xian-hui， WANG Xiao-long，ZHANG Hui-min， YANG Zhang-ping， MAO Yong-jiang
（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， Jiangsu）

Abstract：【Objective】D-6-fatty acid desaturase 2 （FADS2） is one of the key limiting enzymes in the conversion of dietaryessential 18 carbon PUFAs （18C-PUFAs） such as linoleic acid （LNA，C18：2n-6） to γ-linolenic acid （GLA， 18：3n6）， eicosapentaenoic acid （EPA， C20：5n3） and docosahexaenoic acid （DHA， C22：6n3）. The objective of this study was to investigate the effects of SNPs in the 3' untranslated regions of FADS2 gene on the compositions of fatty acids in milk of Chinese Holstein.【Method】In this study，20 Chinese Holstein cows were selected randomly for PCR amplification and sequencing of the 3' untranslated regions of FADS2 gene used for SNP discovery. Then the Chinese Holstein cows （n =551） were genotyped using Sequenom MassARRAY （Sequenom Inc.， San Diego， CA） based on the previous SNP information in this study， and the associations between SNPs or haplotypes and compositions of fatty acids， unsaturated indexes of fatty acids in milk were analyzed by the least squares method in the GLM procedure of SPSS.【Result】Three SNPs （c.1571 A＞G， c.2743 A＞G and c.2776 A＞G） were identified in the 3' untranslated regions of FADS2 gene. The genotype GG was the dominant genotype， which the frequencies were 0.800 for c.1571 A＞G， allele G was dominant allele with the frequency of 0.887. The genotype AA was the dominant genotype， which the frequencies were 0.673 for c. 2776 A＞G. The allele A was dominant allele with the frequency of 0.819. The coefficient of disequilibrium was 0.028 between c.1571 A＞G and c.2776 A＞G， which was not significant at P＜0.05. There were 3 haplotypes for FADS2 c.1571 A＞G and c.2776 A＞G， which the frequencies were 0.705， 0.181 and 0.114 for GA， GG and AA， respectively. Χ2test indicated that the c.2776 A＞G fitted with Hardy-Weinberg equilibrium in the population （P＞0.05）， and the c.1571 A＞G deviated from Hardy-Weinberg equilibrium （P＜0.05）. The SNP c.1571 A＞G showed a very significant association with C14：1， unsaturated indexes of C14 and C18 （P＜0.01）， and significant association with C18：0， SFA and MUFA （P＜0.05）. The individuals with genotype GG had higher C14：1， unsaturated indexes of C14 and C18 than genotypes AG （P＜0.05）. The SNP c.2776 A＞G showed a very significant association with C16：1， unsaturated indexes of C16 and C20 （P＜0.01）， and significant association with C14：1 （P＜0.05）. The individuals with genotype GG had higher C16：1， unsaturated indexes of C16 and C20 than genotypes AG and AA （P＜0.05）. In the meantime， the haplotype of FADS2 1571-2776 showed a significant association with C16：1， unsaturated indexes of C20 （P＜0.05）. The individuals with genotype GG had higher C16：1， unsaturated indexes of C20 than genotypes GA and AA （P＜0.05）. 【Conclusion】The SNPs in the 3' untranslated regions of FADS2 gene have significant genetic effects on composition of fatty acids in milk， but further investigation will be required to elucidate the biological and practical relevance of these SNPs.

Key words：Chinese Holstein； FADS2； SNPs； composition of fatty acids

收稿日期：2015-10-28；接受日期：2016-03-18

基金項目：國家自然科學基金（31272407， 31372286，31472067）、江蘇省優(yōu)勢學科（PAPD）、國家級大學生創(chuàng)新訓練計劃（201411117031）、江蘇省大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃（201411117031Z）