鮑建軍,蘇　銳,王慶增,呂曉陽,高　雯,于嘉瑞,王利宏,陳　玲,吳文忠,盛水興,周　洪,孫　偉,戴國俊

（1揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇蘇州215200；3徐州市睢寧縣林牧漁業(yè)局，江蘇睢寧221200）

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Smads與Hippo通道中YAP1基因在湖羊肌肉組織中時(shí)空表達(dá)研究及關(guān)聯(lián)分析

鮑建軍1,蘇銳1,王慶增1,呂曉陽1,高雯1,于嘉瑞1,王利宏1,陳玲2,吳文忠2,盛水興2,周洪3,孫偉1,戴國俊1

（1揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇蘇州215200；3徐州市睢寧縣林牧漁業(yè)局，江蘇睢寧221200）

摘要：【目的】通過在mRNA表達(dá)水平檢測TGF-β/smad信號(hào)通路基因在湖羊肌肉組織中時(shí)空表達(dá)，來探究各基因的表達(dá)規(guī)律及內(nèi)在聯(lián)系。【方法】利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)湖羊Smads基因在出生后不同生長階段（2日齡，2月齡和6月齡）不同性別的兩種不同骨骼?。枘c肌、趾長伸?。┑南鄬?duì)表達(dá)進(jìn)行分析，以及對(duì)湖羊 Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）基因、YAP1基因的表達(dá)相關(guān)性分析?！窘Y(jié)果】湖羊肌肉TGF-β/smad信號(hào)通路中Smads基因時(shí)空表達(dá)規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)：Smads在不同肌肉組織的表達(dá)分析中，Smads在腓腸肌中的表達(dá)高于趾長伸肌，可能與這兩種骨骼肌分屬不同部位有關(guān)；Smads在不同月齡的表達(dá)分析中，Smad2、Smad3、Smad4在2日齡的表達(dá)量均高于其它月齡，而Smad7在2日齡的表達(dá)量低于6月齡，2月齡時(shí)表達(dá)量最低；在不同性別的表達(dá)分析中，Smads在 2日齡公羊中的表達(dá)量高于母羊，Smad2、Smad4、Smad7 在2月齡和6月齡則低于母羊；Smad3在不同生長階段中公羊表達(dá)量高于母羊。湖羊肌肉TGF-β/smad信號(hào)通路中Smads、YAP1基因表達(dá)相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)：在2日齡腓腸肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）；在2月齡腓腸肌中，Smad2的表達(dá)與YAP1存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）；在6月齡腓腸肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）；在腓腸肌的不同生長階段中，Smad3的表達(dá)YAP1存在極顯著負(fù)相關(guān)（P ＜0.01），Smad2、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）。在2日齡趾長伸肌中，Smad3的表達(dá)與YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01），Smad2、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1存在顯著正相關(guān)（P＜0.05）；在2月齡趾長伸肌中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）；在6月齡趾長伸肌中， Smad7與YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P ＞0.05）；在趾長伸肌的不同生長階段中，Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1存在極顯著正相關(guān)（P ＜0.01）?！窘Y(jié)論】由此推斷不同組織、生長階段以及性別等因素均可影響Smads在肌肉中的表達(dá)；在湖羊這兩種不同肌肉組織中，Hippo通道中YAP1基因可通過參與調(diào)控TGF-β/smad信號(hào)通路而參與肌肉的增殖和分化過程。

關(guān)鍵詞：湖羊；Smads；YAP1；Hippo通路；TGF-β通路

聯(lián)系方式：鮑建軍，E-mail：imaple14@163.com。蘇銳，E-mail：99114074@qq.com。鮑建軍和蘇銳為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者孫偉，E-mail：dkxmsunwei@163.com

0 引言

【研究意義】湖羊是世界著名的綿羊品種之一，不僅具有高繁殖率等特點(diǎn)，而且肉質(zhì)細(xì)嫩、多汁。通過檢測影響湖羊骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況是分析湖羊肌肉生長分子機(jī)制的基礎(chǔ)，從而可以發(fā)現(xiàn)與肌肉質(zhì)量性狀相關(guān)的候選基因?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】YAP1（Yes-associated protein 1）也被稱為YAP65、YAP等，已被定位于人類染色體11q22［1］，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物機(jī)體各組織中，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，YAP1作為Hippo信號(hào)通路的中樞調(diào)控劑之一，在細(xì)胞增殖和凋亡動(dòng)態(tài)平衡的維持、細(xì)胞接觸性抑制的調(diào)控、器官大小的控制，以及腫瘤的形成等過程中具有重要作用［2-7］。Smad基因家族分為3類：第一類是受體活化型Smad （R-Smad），包括Smad1-3， Smad5， Smad8；第二類是共同調(diào)節(jié)型Smad（Co-Smad），主要為Smad4；第三類是抑制型Smad（I-Smad），由Smad6、Smad7組成［8］。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一個(gè)由33種結(jié)構(gòu)相似多肽組成的超級(jí)家族，包括 TGF-β、活化素、抑制素和骨形成蛋白（BMPs）等［9-10］，其家族細(xì)胞因子可廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞增殖分化、凋亡、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞外基質(zhì)重排以及血管生成等［11-13］，可通過胞內(nèi)信號(hào)分子Smads 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，具有抑制生長、促進(jìn)細(xì)胞分化等多種功能［14］。FERRIGNO［15］在研究TGF-β通道與 YAP1過程中，運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)人類胎盤cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)用鼠全長 Smad7作探針時(shí)，YAP1基因可以被其識(shí)別。在COS-7細(xì)胞中YAP1與 Smad7的相互結(jié)合被證明使用了共同表達(dá)的標(biāo)記蛋白，而移除PY基序［16］后，這種關(guān)聯(lián)依然存在，由此可以看出，YAP1與Smad7相互作用的結(jié)構(gòu)域不僅僅只有PY基序?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】課題組前期利用芯片研究綿羊雙肌臀性狀的遺傳機(jī)理，篩選出美臀綿羊和正常表型羊肌肉組織差異表達(dá)基因YAP1［17］，目前關(guān)于Hippo通道中YAP1影響肌肉生長發(fā)育的研究較少，TGF-β通道在肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，而Smads家族基因是TGF-β通道中重要的成員，因此推斷YAP1可能通過與Smad蛋白家族結(jié)合，促進(jìn)或抑制 TGF-β等通道的活性，進(jìn)而對(duì)肌肉的生長發(fā)育發(fā)揮著重要的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)通過分析湖羊YAP1基因以及與肌肉形成發(fā)育相關(guān)的Smad家族基因（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）在湖羊不同性別、不同月齡、不同肌肉組織的時(shí)空表達(dá)趨勢，以及 YAP1基因與此 4個(gè)基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，探討YAP1是否通過Smad蛋白家族來影響湖羊的肌肉生長發(fā)育。

1 材料與方法

2015年2—11月在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——?jiǎng)游镞z傳繁育與分子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如下試驗(yàn)。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用羊于2015年2月購自蘇州市種羊場。湖羊選擇2日齡（初生）、2月齡（斷奶）、6月齡三個(gè)階段，每階段3公3母總共18只。選擇生長發(fā)育良好、日齡體重相近的羊進(jìn)行屠宰，采集腓腸肌、趾長伸肌后于液氮罐保存。

1.2 主要試劑

PrimerScript RT reagent Kit、SYBR? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）、Trizol、rTaq酶等試劑購自TaKaRa公司。

1.3 總RNA的提取

用Trizol法提取總RNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

綿羊Smads和18S rRNA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物信息見表1。

表1　綿羊Smads和18S rRNA基因q-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of Smads and 18S rRNA genes of sheep for RT-PCR

1.5 cDNA第一鏈的合成

參照PrimeSYBR? RT Reagent Kit Perfect Real Time試劑盒說明書對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為 10 μL，包括：總 RNA 0.5 μL（100 ng·μL-1），PrimerScript Buffer 2 μL，Oligo dT 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RNase free H2O 補(bǔ)至10 μL。37℃反應(yīng)15 min后，85℃變性5 s。

1.6 Q-PCR檢測

將合成的cDNA產(chǎn)物做10倍濃度梯度稀釋，使用ABI7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。用18S（真核）作為內(nèi)參基因。按照 SYBR GreenI 試劑盒（TaKaRa公司）推薦的體系，在其他條件相同的情況下，對(duì)退火溫度（53—63℃）和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，然后以優(yōu)化的退火溫度、引物濃度進(jìn)行試驗(yàn)。20 μL反應(yīng)體系包括：上、下游引物各0.8 μL（10 mmol·L-1），ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，H2O 7 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，模板1 μL，混勻。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3管平行試驗(yàn)。根據(jù)電腦自動(dòng)分析熒光信號(hào)將其轉(zhuǎn)換為Smad2、 Smad3、Smad4、Smad7、YAP1基因的起始拷貝數(shù)Ct值，根據(jù)各樣品的Ct值，計(jì)算其起始模板拷貝數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

湖羊同月齡同組織不同性別、同性別同月齡不同組織以及同組織同性別不同月齡間的比較，均采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析。數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt方法處理計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，分析基因相對(duì)表達(dá)差異量。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；湖羊同月齡同組織不同性別比較中ΔΔCt=ΔCt（公）-ΔCt（母）；湖羊同性別同組織不同月齡比較中ΔΔCt=ΔCt（其他月齡）-ΔCt（2日齡）；同月齡同性別不同組織比較中 ΔΔCt=ΔCt（趾長伸?。?ΔCt（腓腸?。?；2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量分析

提取總RNA通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示清晰的28S和18S條帶，核酸蛋白分析儀檢測，A260/ A280≥1.8，提示RNA完整性和質(zhì)量較好（圖1）。

圖1　總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoresis figure of total RNA

2.2 Smads基因在綿羊肌肉中的時(shí)空表達(dá)分析

2.2.1 Smads基因在湖羊同月齡、同性別、不同肌肉組織中的時(shí)空表達(dá)分析 由圖2可以看出，Smads在湖羊趾長伸肌中的表達(dá)量低于腓腸肌。由圖2-Ⅰ可以看出，各月齡公、母羊中Smad2在肌肉組織中的表達(dá)量之間差異不顯著（P＞0.05）；由圖2-Ⅱ可以看出，2日齡、2月齡公母羊中Smad3的表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。6月齡的母羊中，Smad3在腓腸肌和趾長伸肌中表達(dá)量存在顯著差異（P＜0.05）；由圖 2-Ⅲ可以看出，各月齡公、母羊中Smad4在肌肉組織中的表達(dá)量之間無顯著性差異（P＞0.05）；由圖2-Ⅳ可以看出，2月齡公母羊中Smad7的表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05）。2日齡的母羊和6月齡的公羊中，Smad7在腓腸肌和趾長伸肌中表達(dá)量存在極顯著差異（P＜0.01）。

2.2.2 Smads基因在湖羊同組織、同性別、不同生長階段的時(shí)空表達(dá)分析 由圖3可以看出，隨著月齡的增加，Smad2的表達(dá)總體上呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。由圖 3-Ⅰ可以看出，Smad2表達(dá)量除在公羊腓腸肌中不同生長階段間的差異極顯著外（P＜0.01），在公、母羊其他肌肉組織中均無顯著差異（P＞0.05）；由圖3-Ⅱ可以看出，公、母羊肌肉組織Smad3的表達(dá)量在 2日齡與 2月齡間均存在顯著或極顯著差異（P＜0.05）；由圖3-Ⅲ可以看出，公、母羊肌肉組織中Smad4的表達(dá)量在2月齡與6月齡間差異均不顯著（P＞0.05）；由圖3-Ⅳ可以看出，Smad7在 6月齡的表達(dá)量高于其他生長階段。公、母羊肌肉組織中Smad7的表達(dá)量在2日齡和2月齡的差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 Smads基因在湖羊同組織、同月齡、不同性別的時(shí)空表達(dá)分析 由圖4-Ⅰ可以看出，各生長階段肌肉組織中 Smad2表達(dá)量在公、母羊間的差異不顯著（P＞0.05）；由圖4-Ⅱ可以看出，Smad3表達(dá)量除在2月齡趾長伸肌中存在顯著差異外（P＜0.05），在其他生長階段肌肉組織中的差異不顯著（P＞0.05）；由圖4-Ⅲ可以看出，6月齡腓腸肌中Smad4在公、母羊間存在極顯著差異（P＜0.01）；其他生長階段肌肉組織中，Smad4表達(dá)量在公、母羊間無顯著差異（P＞0.05）；由圖 4-Ⅳ可以看出，各生長階段肌肉組織中 Smad7的表達(dá)量在公、母羊間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 Smads與YAP1基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析

由表2可以看出，在2日齡腓腸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3、Smad4、Smad7存在極顯著正相關(guān)（P ＜0.01）；Smad3的表達(dá)與Smad4、Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad4的表達(dá)與Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4 、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）。

Ⅰ-Smad2；Ⅱ- Smad3；Ⅲ-Smad4；Ⅳ-Smad7。A、B、C、a、b、c系列的字母表示多重比較結(jié)果；相同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。下同Ⅰ-Smad2； Ⅱ- Smad3； Ⅲ-Smad4； Ⅳ-Smad7. A， B， C， a， b， c show the results of multiple comparison. The same letters are no significant different （P＞0.05），the values with different letters are significant different （0.01＜P＜0.05）， the values with different capitals are extremely significant different （P＜0.01）. The same as below圖2　湖羊Smads基因在不同肌肉組織中表達(dá)的差異比較Fig. 2 The comparison of sheep Smads different expressions in different muscles

由表3可以看出，在2月齡腓腸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3、Smad7、YAP1存在顯著正相關(guān)（P＜0.05）；Smad3的表達(dá)與Smad7存在極顯著正相關(guān)（P ＜0.01）；Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）。

由表4可以看出，在6月齡腓腸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad3的表達(dá)與Smad4存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）。

圖3　湖羊Smads基因在不同生長階段表達(dá)的差異比較Fig. 3 The comparison of sheep Smads different expressions at different growth stages

表2　Smads與YAP1基因在2日齡腓腸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 2 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius muscle of 2-day-old

圖4　湖羊Smads基因在不同性別表達(dá)的差異比較Fig. 4 The comparison of sheep Smads different expression in different sex

表3　Smads與YAP1基因在2月齡腓腸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 3 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius muscles of 2-month-old

表4　Smads與YAP1基因在6月齡腓腸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 4 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius dorsi muscles of 6-month-old

由表5可以看出，在腓腸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3、Smad4、Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad3的表達(dá)與Smad4、Smad7存在極顯著正相關(guān)（P ＜0.01），與 YAP1存在極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；Smad4與Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01），Smad2、 Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）。

由表6可以看出，在2日齡趾長伸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3、Smad4、Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad3的表達(dá)與Smad4、Smad7、YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad4與Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad2、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1存在顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表5　Smads與YAP1基因在腓腸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 5 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in gastrocnemius muscle

表6　Smads與YAP1基因在2日齡趾長伸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 6 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus of 2-day-old

由表7可以看出，在2月齡趾長伸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3、Smad4 、Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad3的表達(dá)與Smad7存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）。

由表8可以看出，在6月齡趾長伸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3、Smad4存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad3的表達(dá)與Smad4存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad7與YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad2、Smad3、Smad4的表達(dá)與YAP1相關(guān)不顯著（P＞0.05）。

由表9可以看出，在趾長伸肌中，Smad2的表達(dá)與Smad3、Smad4 、Smad7、YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad3的表達(dá)與Smad4、Smad7、YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad4與 Smad7、YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Smad7與YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表7　Smads與YAP1基因在2月齡趾長伸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 7 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus of 2-month-old

表8　Smads與YAP1基因在6月齡趾長伸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 8 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus of 6-month-old

表9　Smads與YAP1基因在趾長伸肌中表達(dá)的相關(guān)分析Table 9 Correlation of Smads and YAP1 genes expression in extensor digitorum longus

3 討論

轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）通過胞內(nèi)信號(hào)分子Smads 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，調(diào)節(jié)著骨骼肌的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn) TGF-β/myostatin信號(hào)通路調(diào)節(jié)著羊、牛等所有哺乳動(dòng)物體骨骼肌的生長發(fā)育、損傷再生以及運(yùn)動(dòng)生理等［18-19］。Hippo-YAP1信號(hào)通路中 YAP1作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，可以與Smad7結(jié)合，參與SMADs蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)TGF-β參與的信號(hào)通路產(chǎn)生影響［20-22］。

TGF-β受體及受體底物 SMADs蛋白家族構(gòu)成了 TGF-β/Smad通路。TGF-β與受體TGF-β-RⅡ結(jié)合后激活TGF-β-RⅠ受體，使Smad2、Smad3蛋白發(fā)生磷酸化；磷酸化Smad2和Smad3蛋白與Smad4形成異源復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，通過與轉(zhuǎn)錄因子、共同抑制或激活因子相互作用調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄；Smad7是Ⅰ型受體的拮抗蛋白，可以與TGF-β-RⅠ牢固結(jié)合，阻止Smad2、Smad3磷酸化的發(fā)生，使TGF-β對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用［21，23］，該通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、黏附、遷移及凋亡而在生物整體及各種器官的發(fā)育過程中起重要的作用［24］。

本研究通過對(duì)Smads家族部分基因在湖羊不同骨骼肌組織中的表達(dá)趨勢及其與肌肉生長候選基因YAP1的表達(dá)關(guān)聯(lián)分析，探索YAP1在調(diào)節(jié)湖羊肌肉發(fā)育中所起的作用。

3.1 湖羊肌肉TGF-β/smad信號(hào)通路中Smads基因時(shí)空表達(dá)規(guī)律

Nakao等研究發(fā)現(xiàn)Smad2、Smad3、Smad4能夠有效參與TGF-β通道的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Smad7 在 TGF-β通路中起一定的拮抗作用［21，25］。徐業(yè)芬［26］研究發(fā)現(xiàn)Smad2、Smad4、Smad7除在湖羊母羊卵巢、子宮、輸卵管等生殖器官有表達(dá)外，在肌肉組織中也有表達(dá)，這與本文的研究結(jié)果一致。GOLDSTEIN［27］在以小鼠為對(duì)象研究TGF-β通路中Smad信號(hào)對(duì)肌肉萎縮的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)降低Smad4信號(hào)后，小鼠在12周齡時(shí)的體重和脛骨長度顯著增加（P＜0.05），股四頭肌肌纖維平均直徑更大（P＜0.001）。COHEN等［28］研究發(fā)現(xiàn)在 TGF-β通道缺乏 Smad7時(shí)上調(diào)Smad2、Smad3信號(hào)會(huì)抑制肌肉生長，并認(rèn)為Smad7是引起肌肉紊亂的原因。本研究中 Smads在腓腸?。á蛐屠w維為主）中的表達(dá)高于趾長伸?。á蛐屠w維為主），可能與這兩種肌肉分屬不同部位有關(guān)；Smad2、Smad3、Smad4均在2日齡的表達(dá)量高于其他月齡，而Smad7在2日齡的表達(dá)量低于6月。從這些研究結(jié)果中可以看出TGF-β信號(hào)通路中 Smads基因可在肌肉組織有效地進(jìn)行表達(dá)。

3.2 湖羊肌肉TGF-β/smad信號(hào)通路中Smads、YAP1基因表達(dá)相關(guān)性

DROGURTT［23］研究發(fā)現(xiàn)雖然肌肉通常在 TGF-β通道的環(huán)境中形成，但是骨骼肌分化也受到TGF-β信號(hào)通路的強(qiáng)烈抑制，Smad2、Smad3、Smad4與抑制型Smad7在表達(dá)水平上沒有差異，相反 TGF-β-RⅠ和TGF-β-RⅡ在骨骼肌分化過程中增加了，同時(shí)指出下調(diào)Smad蛋白及其TGF-β受體信號(hào)對(duì)于骨骼肌分化是及其重要的。FERRIGNO［15］在研究中發(fā)現(xiàn)，YAP1增強(qiáng)了Smad7與其關(guān)聯(lián)性，促進(jìn)Smad7對(duì)TGF-β-RⅠ的活化，Smad7對(duì)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的抑制活性也可被YAP1所加強(qiáng)。而GUO［29］用免疫組化法研究胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)現(xiàn)YAP65與Smad7或Smad4變異之間不存在相關(guān)。SUN［30］研究發(fā)現(xiàn)YAP1基因的表達(dá)與磷酸化Smad3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的增殖分化；在敲除小鼠YAP1基因后，乳腺腫瘤干細(xì)胞生長頻率下降 200倍以上（P＜0.01），并得出結(jié)論YAP1基因通過抑制Smad3信號(hào)促進(jìn)乳腺腫瘤干細(xì)胞的增殖分化。本研究發(fā)現(xiàn)在湖羊腓腸肌Hippo通道中YAP1可能通過調(diào)控TGF-β/smad通路中Smad3的表達(dá)進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)；在趾長伸肌中，Smad家族（Smad2、Smad3、Smad4、Smad7）的表達(dá)與YAP1存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01），進(jìn)一步說明在這兩種不同肌肉組織中，YAP1可通過參與調(diào)控TGF-β/smad通路中Smads的表達(dá)來參與肌肉的增殖和分化過程。

4 結(jié)論

不同組織、生長階段以及性別因素均可影響Smads在肌肉中的表達(dá)。在湖羊這兩種不同肌肉組織中，Hippo通道中YAP1基因可通過參與調(diào)控TGF-β/smad通路而參與肌肉的增殖和分化過程。

References

［1］ OVERHOLTZER M， ZHANG J， SMOLEN G A， MUIR B， LI W，SGROI D C， DENG C X， BRUGGE J S， HABER D A. Transforming properties of YAP， a candidate oncogene on the chromosome 11q22 amplicon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（33）：12405-12410.

［2］ 史夢婕， 邵松軍， 李潔媚， 周艷芳， 黃培春. Hippo通路與腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 36（3）：361-365. SHI M J， SHAO S J， LI J M， ZHOU Y F， HUANG P C. The advances in Hippo pathway association with cancer. Chinese Journal of Cell Biology， 2014， 36（3）：361-365.（in Chinese）

［3］ 張靖， 朱金水. Hippo-YAP信號(hào)通路與胃癌相關(guān)性研究. 國際消化病雜志， 2011， 31（4）：207-215. ZHANG J， ZHU J S. The advances in Hippo signaling pathway association with gastric cancer. International Journal of Digestive Disease， 2011， 31（4）：207-215.（in Chinese）

［4］ NGUYEN L T， TRETIAKOVA M S， SILVIS M R， LUCAS J，KLEZOVITCH O， COLEMAN I， BOLOURI H， KUTYAVIN V I，MORRISSEY C， TRUE L D， NELSON P S， VASIOUKHIN V. ERG activates the YAP1 transcriptional program and induces the development of age-related prostate tumors. Cancer Cell， 2015， 27（6）：797-808.

［5］ MELFI S， COLCIAGO A， GIANNOTTI G， BONALUME V，CAFFINO L， FUMAGALLI F， MAGNAGHI V. Stressing out the Hippo/YAP signaling pathway： toward a new role in Schwann cells. Cell Death and Disease， 2015， 6：e1915. doi： 10.1038/cddis.2015.291.

［6］ CAO X， PFAFF S L， GAGE F H. YAP regulates neural progenitor cell number via the TEA domain transcription factor. Genes and Development， 2008， 22（23）：3320-3334.

［7］ PLOUFFE S W， HONG A W， GUAN K L. Disease implications of the Hippo/YAP pathway. Trends in Molecular Medicine， 2015， 21（4）：212-222.

［8］ MOUSTAKAS A， SOUCHELNYTSKYI S， HELDIN C H. Smad regulation in TGF-beta signal transduction. Journal of Cell Science，2001， 114（Pt 24）：4359-4369.

［9］ XU P， LIU J， DERYNCK R. Post-translational regulation of TGF-β receptor and Smad signaling. Febs Letters， 2012， 586（14）：1871-1884.

［10］ MOUSTAKAS A， HELDIN C H. The regulation of TGFbeta signal transduction. Development， 2009， 136（22）：3699-3714.

［11］ WAKEFIELD L M， HILL C S. Beyond TGFβ： roles of other TGFβsuperfamily members in cancer. Nature Reviews Cancer， 2013， 13（5）：328-341.

［12］ IKUSHIMA H， MIYAZONO K. TGFbeta signalling： a complex web in cancer progression. Nature Reviews Cancer， 2010， 10（6）：415-424.

［13］ YAN X， LIAO H， CHENG M， SHI X， LIN X， FENG X H， CHEN Y G. Smad7 protein interacts with Receptor regulated Smads （R-Smads）-Smads to inhibit transforming growth factor-β（TGF-β）/Smad signaling. Journal of Biological Chemistry， 2016， 291： 382-392.

［14］ L?NN P， MORéN A， RAJA E， DAHL M， MOUSTAKAS A. Regulating the stability of TGFbeta receptors and Smads. Cell Research， 2009， 19（1）：21-35.

［15］ FERRIGNO O， LALLEMAND F， VERRECCHIA F， L'HOSTE S，CAMONIS J， ATFI A， MAUVIEL A. Yes-associated protein （YAP65）interacts with Smad7 and potentiates its inhibitory activity against TGF-β/Smad signaling. Oncogene， 2002， 21（32）：4879-4884.

［16］ SCHILD L， LU Y， GAUTSCHI I， SCHNEEBERGER E， LIFTON R P， ROSSIER B C. Identification of a PY motif in the epithelial Na channel subunits as a target sequence for mutations causing channel activation found in Liddle syndrome. EMBO Journal， 1996， 15（10）：2381-2387.

［17］ 孫偉， 李達(dá)， 蘇銳， 馬月輝， 關(guān)偉軍， 張有法， 陳玲， 吳文忠， 周洪.綿羊YAP1 基因全長cDNA 克隆及生物信息學(xué)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46（8）：1725-1735. SUN W， LI D， SU R， MA Y H， GUAN W J， ZHANG Y F， CHEN L，WU W Z， ZHOU H. Cloning and bioinformatics analysis of fulllength cDNA sequence of YAP1 gene in sheep. Scientia Agricultura Sinica， 2013， 46（8）：1725-1735.（in Chinese）

［18］ KOLLIAS H D， MCDERMOTT J C. Transforming growth factor-beta and myostatin signaling in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology， 2008， 104（3）：579-587.

［19］ NAKAMURA R， KAYAMORI K， OUE E， SAKAMOTO K，HARADA K， YAMAGUCHI A. Transforming growth factor-β synthesized by stromal cells and cancer cells participates in bone resorption induced by oral squamous cell carcinoma. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015， 458（4）：777-782.

［20］ FUJII M， TOYODA T， NAKANISHI H， YATABE Y， SATO A，MATSUDAIRA Y， ITO H， MURAKAMI H， KONDO Y， KONDO E，HIDA T， TSUJIMURA T， OSADA H， SEKIDO Y. TGF-β synergizes with defects in the Hippo pathway to stimulate human malignant mesothelioma growth. Journal of Experimental Medicine， 2012，209（3）： 479-494.

［21］ NAKAO A， AFRAKHTE M， MORéN A， NAKAYAMA T，CHRISTIAN J L， HEUCHEL R， ITOH S， KAWABATA M， HELDIN N E， HELDIN C H， TEN DIJKE P. Identification of Smad7， a TGF beta-inducible antagonist of TGF-beta signaLling. Nature， 1997，389（6651）：631-635.

［22］ BEPPU H. Smad7-modified alleles by various gene-targeting strategies. Journal of Biochemistry， 2013， 153（5）：399-401.

［23］ DROGUETT R， CABELLO-VERRUGIO C， SANTANDER C，BRANDAN E. TGF-beta receptors， in a Smad-independent manner，are required for terminal skeletal muscle differentiation. Experimental Cell Research， 2010， 316（15）：2487-2503.

［24］ FOURNIER P G， JUáREZ P， JIANG G， CLINES G A， NIEWOLNA M， KIM H S， WALTON H W， PENG X H， LIU Y， MOHAMMAD K S， WELLS C D， CHIRGWIN J M， GUISE T A. The TGF-β signaling regulator PMEPA1 suppresses prostate cancer metastases to bone. Cancer Cell， 2015， 27（6）：809-821.

［25］ NAKAO A， IMAMURA T， SOUCHELNYTSKYI S， KAWABATA M，ISHISAKI A， OEDA E， TAMAKI K， HANAI J， HELDIN CH，MIYAZONO K， TEN DIJKE P. TGF-beta receptor-mediated signalling through Smad2， Smad3 and Smad4. EMBO Journal， 1997，16（17）： 5353-5362.

［26］ 徐業(yè)芬. Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)與湖羊高繁殖力關(guān)系的研究［D］. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010. XU Y F. Gene expressions related to smad sigenaling molecule and its relationship with fecundity in Hu sheep［D］. Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2010.（in Chinese）

［27］ GOLDSTEIN J A， BOGDANOVICH S， BEIRIGER A， WREN L M，ROSSI A E， GAO Q Q， GARDNER B B， EARLEY J U，MOLKENTIN J D， MCNALLY E M. Excess SMAD signaling contributes to heart and muscle dysfunction in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics， 2014， 23（25）：6722-6731.

［28］ COHEN T V， KOLLIAS H D， LIU N， WARD C W， WAGNER K R. Genetic disruption of Smad7 impairs skeletal muscle growth and regeneration. Journal of Physiology， 2015， 593（11）：2479-2497.

［29］ GUO J， KLEEFF J， ZHAO Y， LI J， GIESE T， ESPOSITO I，BüCHLER M W， KORC M， FRIESS H. Yes-associated protein （YAP65） in relation to Smad7 expression in human pancreatic ductal adenocarcinoma. International Journal of Molecular Medicine， 2006，17（5）：761-767.

［30］ SUN J G， CHEN X W， ZHANG L P， WANG J， DIEHN M. Yap1 promotes the survival and self-renewal of breast tumor initiating cells via inhibiting Smad3 signaling. Oncotarget， 2015， doi： 10.18632/ oncotarget.6655.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

The Temporal and Spatial Expression and Correlation Analysis of Smads and YAP1 Gene in the Hippo Pathway in Sheep Muscle Tissue

BAO Jian-jun1， SU Rui1， WANG Qing-zeng1， Lü Xiao-yang1， GAO Wen1， YU Jia-rui1， WANG Li-hong1，CHEN Ling2， WU Wen-zhong2， SHENG Shui-xing2， ZHOU Hong3， SUN Wei1， DAI Guo-jun1

（1Animal Science and Technology College， Yangzhou University， Yangzhou 225009， Jiangsu；2Animal Science and Veterinary Medicine Bureau of Suzhou， Suzhou 215200， Jiangsu；3Forestation， Herding， Fishing Bureau of Suining Country of Xuzhou， Suining 221200， Jiangsu）

Abstract：【Objective】 In order to explore the expression pattern and inner connection between the different genes， the mRNA expression level was used to detect the spatial and temporal expression of genes in TGF-β/Smad signaling pathway of sheep muscle tissue. 【Method】 In this study， q-PCR was used to detect relative expression of Smads genes and Yes-associated protein 1（YAP1） in 2 different skeletal muscles （i.e.， gastrocnemius muscle， extensor digitorum longus） and 3 different growth stages （i.e.， 2-day-old， 2 and 6-month-old） of Hu Sheep， and analyze the relative expression between Smads（Smad2， Smad3， Smad4 and Smad7） and YAP1. 【Result】The results of the spatial and temporal expression of Smads in TGF-β/Smad signaling pathway showed that the expression of Smads in extensor digitorum longus were lower than in gastrocnemius muscle， which may be related to two different parts of the skeletal muscle. The expression of Smad2， Smad3 and Smad4 genes in the 2-day-old were higher than other growth stages， and Smad7 gene expression in the 2-day-old was lower than 6-month-old， and the expression in 2-month-old was the lowest. The expressions of Smads gene of ram in the 2-day-old was higher than ewe， and the expressions of Smad2， Smad4，and Smad7 genes of ram in 2-month-old and 6-month-old were lower than the ewe in 2-day-old， the expression of Smad3 gene of ram in 3 growth stages were higher than ewe. The correlation expression of Smads gene and YAP1 gene in TGF-β/smad signaling of sheep muscle was found that there was no significant correlation in 2-day-old of gastrocnemius muscle between YAP1 and smads （P＞0.05） . The expression between YAP1 and Smad2 had a significant positive correlation （P＜0.05） and the correlation of the expression between YAP1 and other Smads was not significant in 2-month-old of gastrocnemius muscle （P＞0.05）. There was a significant negative correlation between YAP1 and Smad3 in different growth stages of gastrocnemius muscle（P＜0.01）. YAP1 expression exhibited a high positive correlation with Smad3 and the expression of YAP1 with the others was significantiy correlated in extensor digitorum longus of 2-month-old （P＜0.05）. There was no significant correlation between YAP1 and Smads in 2-month-old of extensor digitorum longus （P＞0.05）. The expression between YAP1 and Smad7 had a high significant positive correlation （P＜0.01） and the correlation of expression between YAP1 and other Smads was not significant in 6-month-old of extensor digitorum longus （P＞0.05）. There were highly significant negative correlations between YAP1 and Smads in different growth stages of extensor digitorum longus （P＜0.01）. 【Conclusion】 It was suggested that different tissues， growth stages and gender could affect the expression of Smads in muscle. YAP1 of Hippo pathway may participate in regulating the TGF-β/smad pathway and the process of muscle proliferation and differentiation in gastrocnemius muscle and extensor digitorum longus of Hu sheep.

Key words：Hu sheep； Smads； YAP1； Hippo pathway； TGF-β pathway

收稿日期：2015-12-03；接受日期：2016-03-18

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（BE2012331）、江蘇省工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目（BM2012308）、科技部家養(yǎng)動(dòng)物平臺(tái)項(xiàng)目、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目、國家星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2012GA690003）、江蘇省蘇北科技計(jì)劃（BN2014003，BN2015013，BN2015014）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目（CX（14）2073）、江蘇省研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（KYLX15_1375）