張麗麗，章玉萍，陳明，代君君，吳傳華，范濤（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，合肥230061）

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中性條件下2種酶解方法提取蠶蛹蛋白的比較研究

張麗麗，章玉萍，陳明，代君君，吳傳華，范濤
（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，合肥230061）

摘要：為了尋求經(jīng)濟(jì)實(shí)用的酶解蠶蛹蛋白的方法，本研究以新鮮和烘干蠶蛹為原料，在中性條件下比較了中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)蠶蛹的水解程度及蛋白收率。結(jié)果表明：在中性條件下2種蛋白酶作用后鮮蛹水解蛋白液的蛋白收率和水解度高于干蛹水解蛋白液。風(fēng)味蛋白酶水解后的蛋白收率高于中性蛋白酶，但水解度小于中性蛋白酶，造成這樣的原因可能是由于風(fēng)味蛋白酶的內(nèi)切酶活性較低。因此，在實(shí)際應(yīng)用中可盡量采用新鮮蠶蛹為原料，并根據(jù)蛋白水解產(chǎn)物不同的需求采用不同的蛋白酶進(jìn)行處理。

關(guān)鍵詞：蠶蛹蛋白；酶解；蛋白收率；水解度

0　引言

蠶蛹是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)價(jià)值均較高的自然資源，是一種全價(jià)蛋白質(zhì)，含有18種氨基酸組分，比例均衡，含量高達(dá)60%，是一種較為理想的優(yōu)質(zhì)蛋白［1-2］。

中國(guó)是世界上最大的繭絲生產(chǎn)國(guó)和供應(yīng)國(guó)，2014年全國(guó)桑蠶發(fā)種量1626萬(wàn)張，蠶繭總產(chǎn)量64萬(wàn)t［3］。然而長(zhǎng)期以來(lái)，中國(guó)的蠶蛹加工利用率極低，除少數(shù)經(jīng)烘干粉碎作為營(yíng)養(yǎng)添加劑外，多數(shù)用作飼料甚至肥料，還有很多被廢棄，資源的再生和利用效率低［4-5］。隨著蠶絲業(yè)的不斷發(fā)展，蠶蛹的產(chǎn)量將會(huì)更大，開發(fā)利用蠶蛹資源具有重要的意義和廣闊的前景。

但蠶蛹本身的某些性質(zhì)限制了它在食品加工中的應(yīng)用［6］。利用蛋白酶水解蠶蛹蛋白，可改善它的功能性質(zhì)，使其溶解性和熱穩(wěn)定性均增加，凝膠性降低，有利于進(jìn)一步加工，拓寬蠶蛹蛋白的應(yīng)用范圍。而且蛋白質(zhì)水解后分子量變小，比蛋白質(zhì)更易消化吸收，提高了生物利用率［7-8］?，F(xiàn)代研究表明，蠶蛹蛋白不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其水解產(chǎn)物還具有某些生物活性。超濾分離酶解繅絲蠶蛹蛋白后，得到的分子質(zhì)量為200～300 D的蛋白肽的抗氧化能力比酶解原液有一定提高［9］。酶解后的蠶蛹蛋白還可制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽，通過(guò)抑制ACE活性起降血壓作用［10］。

目前蛋白水解的方法有酸水解法、堿水解法和酶水解法。酸水解法中多采用鹽酸，反應(yīng)強(qiáng)烈并完全，但鹽酸會(huì)使設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，并且高溫下色氨酸被完全破壞。堿水解法在水解過(guò)程中使氨基酸大都消旋，無(wú)生物利用價(jià)值［11］。而酶水解法條件溫和，安全可靠［12］。經(jīng)過(guò)水解分離精制得到的多肽，具有高溶解性、高穩(wěn)定性、高吸濕保濕性、抗凝膠性等特點(diǎn)［13］。尤其中性條件下酶水解，不僅可以減少后期的中和及除鹽步驟，簡(jiǎn)化了工藝流程和加工設(shè)備，更可以節(jié)省時(shí)間提高效率。本研究中采用的中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶是當(dāng)前酶解工藝中較為常用的酶，在中性或近似中性條件下作用效率高。目前對(duì)蠶蛹蛋白的酶解研究大多采用烘干蠶蛹為原料，筆者對(duì)中性條件下2種蛋白酶對(duì)鮮蛹和干蛹的水解進(jìn)行了比較，旨在為進(jìn)一步利用蠶蛹蛋白提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2015年春季飼養(yǎng)‘菁松×皓月’，上蔟后第7天用刀片將蠶繭削開取出蠶蛹。一部分鮮蛹置于-30℃冰箱內(nèi)冷凍，另一部分蠶蛹置于烘箱中80℃烘至恒重。

取一定量鮮蛹80℃烘干至恒重后，用超微粉碎機(jī)粉碎成粉末過(guò)篩備用。試驗(yàn)在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所實(shí)驗(yàn)室，于2015年6—8月進(jìn)行。

1.2主要試劑和儀器

中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶（北京索萊寶生物科技有限公司），氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、甲醛溶液等均為分析純。

FA1204N型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；K9840凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)；QYC-2012C全溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；5430R高速離心機(jī)，Eppendorf生產(chǎn)；pH計(jì)，奧豪斯儀器上海有限公司生產(chǎn)；SQ211B多功能食品加工機(jī)，上海帥佳電子科技有限公司生產(chǎn)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1總氮含量的測(cè)定改良凱氏定氮法［14］。

1.3.2氨基態(tài)氮的測(cè)定［15］吸取酶水解液5 mL于燒杯中，加入20 mL水，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH 8.2，記錄數(shù)據(jù)，再加入已中和好的甲醛溶液10 mL，記錄滴定至pH 9.2時(shí)所消耗0.1 mol/L的NaOH的體積數(shù)。根據(jù)公式（1）計(jì)算得出氨基態(tài)氮的含量（mg/mL）。

式中：V1為滴定待測(cè)液耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)，V2為滴定空白樣品耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)，NNaOH為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的摩爾濃度。

1.3.3水解率的測(cè)定計(jì)算見公式（2）。

1.3.4蛋白質(zhì)收率計(jì)算見公式（3）。

1.3.5酶解方法和酶解工藝基本的水解流程為蛹粉或蛹漿→加蒸餾水→酶解→終止反應(yīng)→離心→水解蛋白液。

稱取5 g蠶蛹粉，加入45 g蒸餾水，分別加入中性蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶0.05 g，反應(yīng)溫度分別為40℃和50℃，置氣浴振蕩器中140 r/min振蕩3 h。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)液置于沸水浴中5 min滅酶終止反應(yīng)。離心吸出上層油脂層并棄沉淀即得水解蛋白液。

500 g鮮蛹烘干后可得干蛹162.5 g。折合5 g干蛹質(zhì)量，稱取15 g鮮蛹用自來(lái)水沖洗，瀝干水份后加45 g水勻漿，濾去蛹皮等不溶物。分別加入中性蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶0.05 g，反應(yīng)溫度分別為40℃和50℃，置于氣浴振蕩器中140 r/min振蕩3 h。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)液置于沸水浴5 min滅酶終止反應(yīng)。離心吸出上層油脂并棄沉淀即得水解蛋白液。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白收率的影響

由圖1可知，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)鮮蛹酶解后的蛋白收率都明顯高于對(duì)干蛹的酶解收率，分別達(dá)到了66.67%和64.64%。在這2組試驗(yàn)中，分別還做了未加入蛋白酶的干蛹和鮮蛹的本底溶出蛋白對(duì)照，結(jié)果表明，在沒有加入蛋白酶的對(duì)照組中，鮮蛹的本底水平幾乎是干蛹的2倍。分析造成這種現(xiàn)象的主要原因是因?yàn)樾Q蛹在烘干過(guò)程中，因?yàn)槭艿搅溯^長(zhǎng)時(shí)間的高溫烘烤，導(dǎo)致了一部分蛋白質(zhì)的變性，構(gòu)象發(fā)生變化，溶解度降低。而鮮蛹直接冷凍保存，蛋白質(zhì)構(gòu)象保存較好。所以，鮮蛹的蛋白收率高主要是由于其本身的可溶性蛋白含量高造成的。同時(shí)，由圖中也可以發(fā)現(xiàn)，在去除本底可溶性蛋白的基礎(chǔ)上，風(fēng)味蛋白酶組處理得到的水解蛋白含量略高于中性蛋白酶處理組。

圖1　2種蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白收率的影響

2.2不同蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白水解度的比較

由圖2可知，經(jīng)過(guò)蛋白酶處理后，鮮蛹得到的蛋白水解液的水解度明顯高于干蛹的蛋白水解液，這可能也是由于鮮蛹的可溶性蛋白含量高，與干蛹相比蛋白酶可作用的底物含量高。干蛹的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)高溫烘烤后變性，造成了結(jié)構(gòu)的變化，不僅水溶性蛋白的含量減少，同時(shí)也使得蛋白酶的作用位點(diǎn)藏匿于結(jié)構(gòu)中心，蛋白酶無(wú)法接觸到剪切位點(diǎn)而造成水解度的降低。從蛋白酶作用的結(jié)果來(lái)看，中性蛋白酶酶解后的水解度略高于風(fēng)味蛋白酶酶解后的水解度。

圖2　2種蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白水解度影響的比較

3　結(jié)論

在中性條件下2種蛋白酶作用后鮮蛹水解蛋白液的蛋白收率和水解度均高于干蛹水解蛋白液。而無(wú)論是鮮蛹還是干蛹，風(fēng)味蛋白酶水解后的蛋白收率高于中性蛋白酶，但水解度小于中性蛋白酶。所以，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)蠶蛹保存條件及對(duì)水解產(chǎn)品的要求選擇合適的蛋白酶。

4　討論

昆蟲被稱為21世紀(jì)最大的未開發(fā)的資源。中國(guó)具有幾千年的養(yǎng)蠶歷史，種類繁多，成本低廉。蠶蛹蛋白更是一種優(yōu)質(zhì)未被充分利用的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量在干蠶蛹中高達(dá)50%，其中人體必需的8中氨基酸占到45%左右，且必需氨基酸與非必需氨基酸的組成合理、均衡，符合世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（WHO/FAO）提出的標(biāo)準(zhǔn)模式［16-17］。但由于蠶蛹具有獨(dú)特的蛹臭味，未經(jīng)過(guò)深加工的蠶蛹在全國(guó)范圍內(nèi)食用量仍很少。

本試驗(yàn)中干蛹和鮮蛹分別采用2種蛋白酶進(jìn)行酶解比較后發(fā)現(xiàn)，利用鮮蛹進(jìn)行蛋白酶酶解后的水解蛋白液蛋白收率和水解度明顯高于干蛹的水解蛋白液。分析這種結(jié)果很可能是由于鮮蛹和干蛹的保存方法差異造成的。干蛹由于長(zhǎng)時(shí)間的高溫烘烤，蛋白質(zhì)加熱時(shí)，其內(nèi)部氫鍵斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。最終造成了蛋白質(zhì)變性而造成可溶性蛋白含量的減少，由于本身底物濃度低，所以也間接地造成了水解度較低的結(jié)果［18］。

在去除本底可溶性蛋白的基礎(chǔ)上，風(fēng)味蛋白酶組處理得到的水解蛋白含量高于中性蛋白酶處理組，但中性蛋白酶組處理的水解度略高于風(fēng)味蛋白酶組。這可能是由于風(fēng)味蛋白酶的外切肽酶活性較強(qiáng)，但內(nèi)切酶的活性低于中性蛋白酶［19］。在中性條件下，用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解鮮蛹可以顯著提高蛋白收率和水解度。雖然鮮蛹的酶解結(jié)果優(yōu)于干蛹，但干蛹的體積小，易保存，而鮮蛹的體積較大，保存條件要求高，否則容易腐敗。并且通過(guò)鮮蛹試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酶解過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的油小體被蛋白膜包裹，以及磷脂和蛋白質(zhì)極易乳化成乳狀液，不易分離，如需分離油脂和包裹蛋白質(zhì)需進(jìn)一步增加破乳工序［20］。所以在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)按蠶蛹的保存條件及對(duì)水解蛋白的需求選擇合適的蛋白酶進(jìn)行。

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Two Enzymatic Hydrolysis Methods for Extraction of Silkworm Pupa Protein Under Neutral Condition

Zhang Lili, Zhang Yuping, Chen Ming, Dai Junjun, Wu Chuanhua, Fan Tao
（The Sericultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Science, Hefei 230061, Anhui, China）

Abstract:To explore an efficient and economic method for enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein, using fresh pupa and dried pupa as raw materials, the effect of neutral protease and flavourzyme on the degree of hydrolysis and protein yield was examined under neutral condition. The results showed that fresh pupa could obtain higher protein yield and higher degree of hydrolysis than dried pupa. The protein yield of enzymatic hydrolysis using flavourzyme was higher than that of neutral protease, but its hydrolysis degree was lower. This might be caused by the low endonuclease activity of flavourzyme. So the fresh pupas were preferred in practice and proper protease should be used according to different requirements of protein hydrolysate.

Key words:Silkworm Pupa Protein; Enzymatic Hydrolysis; Protein Yield; Degree of Hydrolysis

中圖分類號(hào)：S886.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas15090012

基金項(xiàng)目：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目“蠶蛹蛋白生物活性肽抗氧化機(jī)理的研究”（15B0626）、“家蠶彩色繭中色素和絲心蛋白結(jié)合的反應(yīng)機(jī)理研究”（13B0631）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目“蠶蛹蛋白的加工利用及其生理功效研究”（14A0607）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目“經(jīng)濟(jì)昆蟲資源多功能利用創(chuàng)新與應(yīng)用”（15C0606）；安徽省蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（ahnycytx-16）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目“桑椹花色苷的提取純化及對(duì)紫外線誘導(dǎo)氧化損傷機(jī)制的初步研究”；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子工程項(xiàng)目“經(jīng)濟(jì)昆蟲的種質(zhì)資源保育與開發(fā)利用”（14D0606）。

第一作者簡(jiǎn)介：張麗麗，女，1984年出生，安徽合肥人，助理研究員，博士，研究方向：經(jīng)濟(jì)昆蟲資源綜合利用。

通信地址：230061安徽省合肥市霍山路15號(hào)，E-mail：llzhang818@163.com。 230061安徽省合肥市霍山路15號(hào)，Tel：0551-66826686，E-mail：fantao1116@163.com。

通訊作者：范濤，男，1962年出生，安徽太和人，研究員，碩士，研究方向：蠶桑資源綜合利用。

收稿日期：2015-09-29，修回日期：2015-11-10。