顏　瓊，黃元龍，尹　青，楊　丹，鄧明明△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內科，四川瀘州 646000;2.四川省阿壩州人民醫(yī)院　624000;3.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院北院　423000)

?

外源性瘦素對重癥急性胰腺炎肝損傷的機制研究

顏瓊1，黃元龍2，尹青3，楊丹1，鄧明明1△

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內科，四川瀘州 646000;2.四川省阿壩州人民醫(yī)院624000;3.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院北院423000)

[摘要]目的探討外源性瘦素對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠肝損傷的作用機制。方法將30只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、SAP組、瘦素干預組。采用逆行胰膽管注射3.5%牛黃膽酸鈉制作SAP大鼠模型。瘦素干預組大鼠腹腔內注入瘦素20 μg/kg。在術后12 h處死各組大鼠，取胰腺、肝臟組織進行HE染色、檢測肝臟組織核因子-κB(NF-κB)，采用細胞凋亡原位缺口末端標記法(TUNEL)測定肝臟組織的細胞凋亡指數(shù)，檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉移酶(AST)及淀粉酶(AMY)水平。結果與假手術組比較，SAP組和瘦素干預組大鼠肝臟組織病理評分均明顯增加(P<0.05)；與SAP組比較，瘦素干預組大鼠肝臟組織病理評分降低(P<0.05)；肝臟組織NF-κB表達在SAP組和瘦素干預組較假手術組明顯增加(P<0.01)，與SAP組比較，瘦素干預組大鼠NF-κB表達下降(P<0.05)。肝細胞凋亡指數(shù)SAP組、瘦素干預組大鼠均較假手術組明顯增高(P<0.05)，而瘦素干預組較SAP組降低(P<0.05)。SAP組和瘦素干預組大鼠ALT、AST、AMY水平較假手術組顯著增高(P<0.05)，而瘦素干預組較SAP組降低(P<0.05)。結論外源性瘦素可能通過降低肝臟組織NF-κB的表達而降低肝細胞的凋亡指數(shù)起到保護SAP并發(fā)的肝損害作用。

[關鍵詞]急性胰腺炎；肝損傷；瘦素；NF-κB；細胞凋亡

肝臟是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)并發(fā)損害的首要胰外器官，盡管在SAP時由于肝功能受損后所進一步導致的肝功能衰竭發(fā)生率只有5%[1]，但是一旦發(fā)生了肝功能衰竭將嚴重影響患者的預后，并可能進一步增加疾病的病死率。SAP并發(fā)肝功能損害的機制眾多，包括解剖關系、炎癥介質損害、循環(huán)障礙、肝細胞凋亡等。瘦素由肥胖基因所表達，瘦素與腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)被認為是由脂肪組織所產(chǎn)生的免疫相關信號[2]。有實驗發(fā)現(xiàn)，在SAP并發(fā)的肺損傷中，給予外源性的瘦素可降低肺組織中核因子-κB(unclear factor-kappa B，NF-κB)的表達水平。本試驗探討外源性瘦素對SAP并發(fā)的肝損傷組織中NF-κB的活化影響，以及對肝細胞凋亡情況的影響。

1材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠30只，由重慶鑫騰公司提供，鼠齡8～ 12個月，體質量為250～300 g。牛黃膽酸鈉、戊巴比妥鈉由美國Sigma公司提供，瘦素為由博奧森公司提供(每支0.5 mg的粉劑)，兔抗大鼠的NF-κB P56單抗由Biworld公司提供，細胞凋亡檢測試劑盒購自羅氏公司。主要實驗儀器包括：光學顯微鏡(NX40)，全自動生化分析儀(AU3500)，高速離心機(545F)，光學攝像系統(tǒng)(AR-45)，酶標儀DENLEY DRAGON，洗板機(Wellwash 4 MK2)等。

1.2方法將30只雄性SD大鼠隨機分為假手術、SAP、瘦素干預3組，每組10只。SAP組、瘦素干預組采用逆行胰膽管注射法將3.5%的牛黃膽酸鈉注入胰膽管中，制作SAP大鼠模型，假手術組開腹翻動胰腺周圍腸道組織；關腹后將20 μg/kg劑量的瘦素注入瘦素干預組大鼠腹腔，而假手術組和SAP組大鼠注入相同劑量的生理鹽水。術后各組大鼠禁食，自由飲水，12 h后剖殺各組大鼠，取胰腺組織進行HE染色，判斷模型制作成功與否，肝臟組織HE染色后進行光鏡下病理評分，免疫組化PV法檢測肝臟組織NF-κB的表達情況，每張切片在40×10倍數(shù)光鏡下，隨機選取10個肝組織視野，用ipp6．0圖像分析軟件分析陽性面積和陽性區(qū)域平均灰度值，以陽性單位(Positive unit，PU)值的大小代表著陽性細胞表達的高低。采用原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測肝臟細胞凋亡情況，以凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)表示，AI檢測計數(shù)方法為：分別計數(shù)5個高倍鏡下凋亡肝細胞總數(shù)和該5個高倍視野下的總肝細胞數(shù)，全自動生化儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉移酶(AST)、淀粉酶(AMY)水平。以Saidi等[3]所提出的肝臟組織病理評分標準為指導進行病理評分。

PU=陽性面積/陽性區(qū)域平均灰度值×100%

(1)

AI值=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%

(2)

2結果

2.13組大鼠胰腺組織病理變化比較假手術組大鼠胰腺組織小葉結構完整，未見到壞死、出血、炎癥細胞浸潤等，組織間無水腫。SAP組大鼠胰腺組織大片狀壞死，結構消失，組織間大量的炎癥細胞及紅細胞浸潤，組織間隙明顯增寬。瘦素干預組大鼠胰腺組織間隙增寬，部分胰腺小葉壞死，結構紊亂，組織間可見炎癥細胞及紅細胞，見圖1。

2.23組大鼠肝臟組織病理變化及評分比較假手術組大鼠肝細胞排列整齊，肝細胞無水腫，細胞間隙無增寬，無細胞壞死，組織間無炎癥細胞及紅細胞浸潤。SAP組大鼠肝細胞水腫明顯，細胞排列紊亂，細胞間隙增寬，組織間、肝竇及匯管區(qū)可見大量的炎癥細胞及紅細胞堆積，可見部分細胞出現(xiàn)嗜酸性變，點片狀的細胞壞死。瘦素干預組大鼠細胞輕度水腫，組織間隙稍增寬，點狀細胞壞死，少量細胞出現(xiàn)嗜酸性變，肝竇及匯管區(qū)少量的炎癥細胞及紅細胞(圖2)。假手術組、SAP組、瘦素干預組病理評分分別為(0.15±0.24)、(7.14±1.57)、(2.89±0.78)分，假手術組明顯低于SAP組和瘦素干預組(P<0.05)，而瘦素干預組又明顯低于SAP組(P<0.05)。

2.33組大鼠AMY、AST及ALT 3項檢測結果比較3項檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，SAP組和瘦素干預組檢測值較假手術組明顯增高(P<0.05)；而瘦素干預組其檢測值明顯低于SAP組(P<0.05)，見表1。

2.43組大鼠肝臟組織NF-κB表達情況假手術組大鼠肝臟組織可見少量的NF-κB表達，瘦素干預組、SAP組NF-κB的表達較假手術組明顯增加(P<0.01)；瘦素干預組NF-κB的表達明顯低于SAP組(P<0.05)。 假手術組、SAP組、瘦素干預組的NF-κB表達分別為(0.24±0.18)、(0.49±0.25)、(0.35±0.18)。免疫組化檢測3組大鼠肝組織NF-κB表達情況，見圖3。

A：假手術組；B：SAP組；C：瘦素干預組。

A：假手術組；B：SAP組；C：瘦素干預組。

2.5TNUEL法檢測肝臟凋亡細胞通過TUNEL法檢測可見各組大鼠均有凋亡細胞，假手術組凋亡細胞數(shù)量極少。假手術組、SAP組、瘦素干預組大鼠肝組織AI分別為16.22±1.74、36.13±1.67、26.85±1.20，SAP組肝細胞AI明顯高于假手術組和瘦素干預組(P<0.01)，瘦素干預組較假手術組AI明顯增高(P<0.01)。 TUNEL法檢測3組大鼠肝臟凋亡細胞的表達，見圖4。

2.6NF-κB表達與TNF-α及肝細胞AI的相關性分析Pearson相關分析顯示，各組大鼠肝臟組織中NF-κB的表達與肝細胞的AI、血清TNF-α水平呈正相關(r=0.868、0.926，P<0.01)；肝細胞的AI與血清TNF-α水平亦呈正相關(r=0.942，P<0.01)。

表1　　3組大鼠血清AMY、AST及ALT水平比較

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與SAP組比較。

A：假手術組；B：SAP組；C：瘦素干預組。

A：假手術組；B：SAP組；C：瘦素干預組。

3討論

急性胰腺炎是胰腺組織的無菌性炎癥，分為輕、中、重度[4]。中、重度的急性胰腺炎常常并發(fā)多器官功能的損害，其病死率高，并可能導致胰腺內外分泌功能障礙[5]，使患者出現(xiàn)繼發(fā)性糖尿病及慢性脂肪瀉等并發(fā)癥。肝細胞的過度凋亡是導致SAP時肝功能受損最直接的原因。SAP時眾多因素導致了肝細胞的凋亡，如Kupffer細胞衍生的Fas配體(FasL)表達增加[6]，線粒體的功能狀態(tài)[7]，細胞內的鈣離子超載，凋亡基因的調控，氧化劑的誘導等均促使了肝細胞的凋亡發(fā)生。TNF-α也是一重要的細胞凋亡誘導因子，可通過線粒體和死亡受體途徑參與細胞凋亡的調控，SAP時由于TNF-α的過度表達，誘導了肝臟細胞的凋亡和壞死，致使肝臟功能損害[8]。

NF-κB是真核內普遍存在的一種核轉錄因子。NF-κB的活化與細胞的凋亡有著密切的聯(lián)系，NF-κB的活化可誘導感染休克大鼠的肝細胞凋亡增加[9]，導致肝臟功能進一步損害。在缺血再灌注大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，NF-κB活性增加的同時促凋亡基因Fas/FasL的蛋白表達水平亦明顯升高，肝細胞的凋亡數(shù)量增加[10]。另有研究表明，NF-κB和Caspase-3在SAP肝組織中的表達呈正相關，且與肝損傷程度一致[11]。由此說明肝臟組織的NF-κB活化可能通過上調凋亡相關基因Fas/FasL及促進凋亡相關蛋白Caspase-3的表達來促進肝細胞的凋亡，SAP并發(fā)肝損傷時可見肝組織內的NF-κB大量活化，在NF-κB活化的同時伴隨著肝細胞凋亡數(shù)目的增多，隨著NF-κB的繼續(xù)活化致使炎癥介質數(shù)量進一步增多，使肝組織損害加重。在本實驗中肝臟組織在12 h時，SAP組NF-κB明顯升高，同時轉氨酶及血清TNF-α升高，且NF-κB的升高與TNF-α的升高相關性分析結果提示二者之間存在正相關性，表明肝臟組織NF-κB的活化導致了血清TNF-α水平的升高，進而導致肝臟組織受損。另外在實驗中發(fā)現(xiàn)在SPA 組中肝臟組織NF-κB大量活化的同時伴隨著肝細胞的AI的增加，且二者存在正相關性。以上實驗結果說明，SAP時肝臟組織NF-κB的活化表達促進了血清TNF-α的活化及肝細胞的凋亡，從而導致肝臟組織損害的加重。NF-κB可能是通過促進血清TNF-α的釋放，誘發(fā)了肝細胞的調亡途徑而促進了肝細胞的調亡，導致了SAP時肝組織的損傷。

瘦素在SAP并發(fā)的多器官功能損害中的保護作用目前已有了大量的研究[12]。在體外和體內實驗研究中發(fā)現(xiàn)，瘦素可促進中性粒細胞的活化并趨化單核細胞，誘導IL-6α的產(chǎn)生，促進單核細胞/巨噬細胞活化和吞噬作用，增強淋巴細胞增殖[13-14]。瘦素可以影響胃、胰腺組織的分泌功能，能保護胃黏膜免受有害物質的損傷，且對胰腺的炎癥也有作用[15]。瘦素可通過降低SAP時組織的炎癥反應，改善組織血液循環(huán)等達到對胰腺組織的保護作用[16]。在本研究中，給予外源性瘦素干預后的大鼠肝臟組織NF-κB水平明顯較SAP組降低，同時肝細胞的AI和血清TNF-α也有所下降，肝臟組織的病理評分降低，表明肝臟組織的NF-κB活化降低后肝臟組織的損傷明顯好轉。外源性瘦素在SAP大鼠肝損傷模型中對肝臟組織中NF-κB的活化有抑制作用，而NF-κB的活化與TNF-α水平和肝細胞的AI存在正相關性，本研究發(fā)現(xiàn)外源性瘦素可通過抑制肝臟組織中NF-κB的活化而減輕組織中的炎癥介質的釋放，減輕肝細胞的凋亡而達到對SAP并發(fā)肝損傷的保護作用。

但是本實驗研究僅僅對于外源性瘦素的作用做了初步的研究，但瘦素抑制肝臟組織NF-κB活化的具體機制尚未明確，有待進一步進行相關研究。

參考文獻

[1]TakeyamaY.Significance of apoptotic cell death in systemic Complications with severe acute pancreatitis[J]．J Gastroenterol,2005,40(1)：1-10.

[2]Kershaw EE,Flier JS.Adipose tissue as an endocrine organ[J].J Clin Endocrinol Metab,2004,89(6):2548-2556.

[3]Saidi RF,Chang J,Verb S,et al.The effect of methylprednisolone on warm ischemia-reperfusion injury in the liver[J].Am J Surg,2007,193(3):347-348.

[4]Sarr MG,Banks PA,Bollen TL,et al.The new revised classification of acute pancreatitis 2012[J].Surg Clin North Am,2013,93(3):549-562.

[5]Andersson B,Appelgren B,Sjodin V,et al.Acute pancreatitis——costs for healthcare and loss of production[J].Scand J Gastroenterol,2013,48(12):1459-1465.

[6]Yu HB,Zhang HF,Zhang X,et al.Resveratrol inhibits VEGF expression of human hepatocellular carcinoma cells through a NF-kappa B-mediated mechanism[J].Hepatogastroenterology,2010,57(102/103):1241-1246.

[7]肖經(jīng)緯,李斌，鐘才高．肝細胞凋亡機制及其檢測方法的研究進展[J].國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊)，2006，33(2)：93-96.

[8]Malleo G，Mazzon E，Siriwardena AK，et al.TNF-alpha as a therapeutic target in acute pancreatitis--lessons from experimental models[J]．Sci World J,2007,30(7)：431-438.

[9]高建芝,徐自超,王慶志,等.核因子-κB與感染性休克大鼠肝細胞凋亡的關系[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報,2007,24(5):447-450.

[10]莊永敬,曹云飛,吳桂榮,等.缺血預處理對大鼠肝臟缺血/再灌注早期核因子κB活性及細胞凋亡的影響[J].肝膽胰外科雜志,2009,21(6):431-434.

[11]鄒自萬,郭貴海,徐萍,等.NF-κBp65、Caspase-3在重癥急性胰腺炎大鼠肝損傷中的表達意義[J].江西醫(yī)藥,2009,44(11):1069-1072.

[12]Konturek PC,Jaworek J,Maniatoglou A,et al.Leptin modulates the inflammatory response in acute pancreatitis[J].Digestion,2002,65(3):149-160.

[13]La Cava A,Matarese G.The weight of leptin in immunity.Nature reviews[J].Immunology,2004,4(5):371-379.

[14]Sanchez-Margalet V,Martin-Romero C,Santos-Alvarez J,et al.Role of leptin as an immunomodulator of blood mononuclear cells:mechanisms of action[J].Clin Exp Immunol,2003,133(1):11-19.

[15]Gonzalez A,Merino B,Marroqui L,et al.Insulin hypersecretion in islets from diet-induced hyperinsulinemic obese female mice is associated with several functional adaptations in individual beta-cells[J].Endocrinology,2013,154(10):3515-3524.

[16]Dossin O.Laboratory tests for diagnosis of gastrointestinal and pancreatic diseases[J].Top Comp Anim Med,2011,26(2):86-97.

Protective effects of exogenous leptin on liver injury induced by severe acute pancreatitis

YanQiong1,HuangYuanlong2,YinQing3,YangDan1,DengMingming1△

(1.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;>2.AbaPrefecturePeople′sHospital,Aba,Sichuan624000,China;3.ChenzhouMunicipalNo.1People′sHospital,Chenzhou,Hunan423000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of exogenous leptin on liver injury in severe acute pancreatitis rat.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into the sham operation group,SAP group and leptin intervention group.The SAP rat models was established by retrograde injection of 3.5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct.The leptin intervention group was intraperitoneally injected with leptin 20 μg/kg.The rats in each group were sacrificed at 12 h after modeling.The pancreas and liver tissues were taken for HE staining and detecting the nuclear factor kappa B(NF-κB).The cell apoptosis in situ labeling method was adopted for detecting the liver tissue cell apoptosis index.ALT,AST and AMY were detected.ResultsCompared with the sham operation group,the liver tissue pathology score in SAP group and leptin intervention group were significantly increased(P<0.05).The liver tissue pathology scores in the leptin intervention group were lower than those in the SAP group(P<0.05).The NF-κB expression of liver tissue in the SAP group and leptin intervention group was obviously increased compared with the sham operation group,the expression in the leptin intervention group was decreased compared with the SAP group (P<0.05).The liver cell apoptosis index in the leptin intervention group and SAP group was significantly higher than that in the sham operation group (P<0.05),and which leptin intervention group was decreased compared with the SAP group(P<0.05).The results of ALT,AST and AMY in the SAP group and leptin intervention group were increased significantly compared with the sham operation group(P<0.05),while which in the leptin intervention group was decreased compared with the SAP group(P<0.05).ConclusionThe exogenous leptin may play the protective effect on SAP complicating liver damage by lowering the liver tissue NF-κB expression and reducing the liver cell apoptosis index.

[Key words]acute pancreatitis;liver injury;leptin;NF-kappa B;apoptosis

作者簡介：顏瓊(1986-)，醫(yī)師，碩士研究生，主要從事胃腸及胰腺疾病的研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：793070544@qq.com。

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.007

[中圖分類號]R576

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2471-04

(收稿日期：2015-11-21修回日期：2016-03-06)