韓知峽，楊　婷，張春蓮，熊　偉，張青碧△

(1.西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院；2.西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學專業(yè)2010級，四川瀘州 646000)

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還原型谷胱甘肽對微囊藻毒素-LR染毒小鼠肝臟抗氧化功能的影響*

韓知峽1，楊婷2，張春蓮1，熊偉1，張青碧1△

(1.西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院；2.西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學專業(yè)2010級，四川瀘州 646000)

[摘要]目的探討抗氧化劑還原型谷胱甘肽(GSH)對微囊藻毒素-LR(MC-LR)染毒小鼠肝臟抗氧化功能的影響。方法選擇健康清潔級5周齡昆明種小鼠40只，通過隨機抽樣的方法分為5組，生理鹽水對照組、GSH對照組、MC-LR染毒組、MC-LR染毒+ GSH低劑量組(GSH低劑量干預組)、MC-LR 染毒+GSH高劑量組(GSH高劑量干預組)，每組8只，雌雄各半，經腹腔注射持續(xù)染毒15 d，檢測肝臟組織病理變化情況及肝臟組織GSH水平、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)水平。結果與生理鹽水對照組比較，MC-LR染毒組肝細胞GSH水平及SOD、GSH-Px活力明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯增高(P<0.05)。與MC-LR染毒組比較，GSH低、高劑量干預組GSH水平及SOD、GSH-Px活力均增高(P<0.05)，MDA水平均降低(P<0.05)。結論GSH干預后可減輕MC-LR所致小鼠肝臟氧化毒性，對肝臟具有一定的保護作用。

[關鍵詞]微囊藻毒素類；谷胱甘肽；抗氧化功能

近年來由于各種有機物的大量排入，內陸水體富營養(yǎng)化日益加劇，導致藍藻類水華頻繁發(fā)生，已成為全世界普遍關注的環(huán)境問題[1]。其中，微囊藻毒素(microcystins，MCs)在藍藻水華污染中是出現(xiàn)頻率高、產量大、危害最嚴重的一類藍藻毒素[2]，而且其在水體中不斷累積導致濃度不斷增高[3]。其代表亞型MC-LR毒性最強，具有強烈的肝毒性、腎毒性[4-5]，嚴重威脅著人和動物的健康。近年來發(fā)現(xiàn)，MC-LR誘導活性氧(ROS)產物增加引起細胞氧化損傷在其細胞毒效應中發(fā)揮了關鍵作用，表明氧化應激是MCs所致毒性損傷的作用機制之一[6]。故作者推測通過對抗氧化系統(tǒng)的保護，可以適當減輕MC-LR對機體的毒性效應。還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種抗氧化物質，臨床上常用于乙醇、病毒、藥物及其他化學物質導致的肝損傷的輔助治療藥物[7]。本研究旨在探討抗氧化物質GSH對MC-LR染毒小鼠肝臟氧化損傷的保護作用，為今后研究抗氧化物質應用于MCs人群危害的化學預防和治療提供科學依據和實驗資料。

1材料與方法

1.1材料動物：健康清潔級5周齡昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質量18 g～22 g，西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號SYXK(川)2013-065。主要試劑： MC-LR標準品購自瑞士Alexis公司，注射用還原型GSH購自山東綠葉制藥有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、還原型GSH試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及處理將40只小鼠于溫度及濕度相對適宜的動物房適應性喂養(yǎng)7 d后，通過隨機抽樣的方法分為5組，生理鹽水對照組(生理鹽水腹腔注射)、GSH對照組 (100 mg/kg GSH腹腔注射)、MC-LR染毒組(5 μg/kg MC-LR腹腔注射)、MC-LR染毒+GSH低劑量組(GSH低劑量干預組，5 μg/kg MC-LR+100 mg/kg GSH腹腔注射)、MC-LR染毒+GSH高劑量組(GSH高劑量干預組，5 μg/kg MC-LR+200 mg/kg GSH腹腔注射)，每組8只，每只小鼠按0.01 mL/g注射，每天1次，記錄基本情況及體質量，持續(xù)15 d。實驗結束次日晨處死小鼠，收集肝臟，檢測臟器系數(shù)、肝臟組織病理變化、GSH水平及SOD、GSH-Px 活力和MDA水平。

1.2.2指標測定方法(1)臟器系數(shù)(肝體比)：小鼠處死后取出肝臟組織，稱體質量并記錄，肝體比=肝臟質量(g)/體質量(g)×100%。(2)光學顯微鏡檢測：迅速切取部分肝臟組織置于4%多聚甲醛固定液中，72 h后常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色光鏡下觀察肝臟組織結構病理改變。(3)GSH水平及SOD、GSH-Px 活力和MDA水平檢測：肝組織勻漿后取上清液后采用黃嘌呤氧化酶法測量SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸測GSH水平和GSH-Px活力，硫代巴比妥酸測量MDA水平，實驗操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2結果

2.1各組小鼠體質量和臟器系數(shù)比較實驗期間40只小鼠均存活。15 d喂養(yǎng)后，各組小鼠體質量均增加，組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與生理鹽水對照組比較，MC-LR染毒組肝臟指數(shù)則明顯增高(F=17.854，P=0.000)；與MC-LR染毒組比較，GSH低、高劑量干預組肝臟指數(shù)則明顯降低(F=15.861，P=0.000)，見表1。

2.2各組小鼠肝臟病理改變比較光鏡下，HE染色觀察到生理鹽水對照組肝細胞結構完好，肝索呈放射狀排列，中央靜脈、肝血竇清晰，肝細胞呈多邊形，細胞核居中，無明顯病理改變；GSH對照組肝細胞結構基本完好，細胞質輕度淺染，肝板稍寬；MC-LR染毒組，肝索排列紊亂，肝細胞水腫，以肝小葉中央最明顯，肝血竇變窄；GSH低劑量干預組，肝血竇細小，肝細胞腫脹程度較輕，淺染程度也較MC-LR染毒組輕；GSH高劑量干預組，上述各種表現(xiàn)均較GSH低劑量干預組有所減輕，見圖1。

表1　　各組小鼠體質量及臟器系數(shù)比較±s，n=8)

a：P<0.05，與生理鹽水對照組比較；b：P<0.05，與MC-LR染毒組比較。

2.3各組小鼠肝細胞MDA、GSH水平及SOD、GSH-Px活力比較與生理鹽水對照組比較，MC-LR染毒組肝細胞MDA水平明顯增高(F=10.551，P=0.004)；與MC-LR染毒組比較，GSH低、高劑量干預組MDA水平均降低(F=9.668，P=0.006)。與生理鹽水對照組比較，MC-LR染毒組肝細胞GSH水平明顯降低(F=11.462，P=0.003)，SOD、GSH-Px活力明顯降低(F=111.203、1 415.771，P=0.000)；與MC-LR染毒組比較，GSH低、高劑量干預組GSH水平及SOD、GSH-Px活力均增高(FGSH=5.871，PGSH=0.023；FSOD=23.593，PSOD=0.000；FGSH-Px=40.027，PGSH-Px=0.000)，見表2。

A：生理鹽水對照組；B：GSH對照組；C：MC-LR染毒組；D：GSH低劑量干預組；E：GSH高劑量干預組。

表2　　各組小鼠肝細胞MDA、GSH水平及SOD、GSH-Px活力比較

a：P<0.05，與生理鹽水對照組比較；b：P<0.05，與MC-LR染毒組比較。

3討論

MCs具有多器官多系統(tǒng)毒性，特別是對肝臟毒性較強。本研究觀察了MCs染毒小鼠后，導致小鼠肝臟損害的相應指標，結果顯示，在連續(xù)染毒15 d后，各組小鼠體質量均增加，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而MC-LR染毒組小鼠的肝體比明顯高于生理鹽水對照組(P<0.05)，提示小鼠的肝臟受到毒素損害，MC-LR毒素可能導致了肝臟水腫，從肝臟病理改變中證實了MC-LR染毒組的肝細胞出現(xiàn)了水腫。

目前對MCs引起的肝臟毒性具體機制研究較多，而對其造成機體損傷的防護措施研究較少。近年來許多學者提出氧化應激也是MCs所致毒性損傷的作用機制[8-9]，故MCs對細胞的氧化損害及抗氧化系統(tǒng)的反應逐漸成為研究熱點。有研究表明，MC-LR能誘發(fā)細胞內的ROS水平上升，使細胞處于氧化應激狀態(tài)，SOD、GSH-Px等參與ROS的清除，以消除或減輕ROS對細胞的毒害，而這些反應又會造成細胞內抗氧化物質的急劇減少以至耗竭[10]。施瑋等[11]推測MCs引起的氧化損傷和肝細胞凋亡可能是其致肝臟毒性的原因。本研究結果顯示，MC-LR染毒能引起肝臟抗氧化物質GSH水平的減少，抗氧化酶SOD、GSH-Px活性降低，以及脂質過氧化產物MDA水平增加，這與大量研究的結果基本符合，提示MC-LR所致的肝臟毒性可能與肝臟的氧化損傷有關。故減輕肝臟的氧化損傷就能一定程度上減弱MC-LR所致的肝臟毒性。陳鐵暉等[12]報道在MCs染毒的同時口服姜黃素可抑制MCs引起的機體氧化應激，但隨著給藥劑量升高，預防效果消失，其最適劑量范圍值需進一步探索。有研究發(fā)現(xiàn)，綠茶多酚及其主要活性物質表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)可減輕MC-LR引起的小鼠肝臟氧化損傷[13-14]。故抗氧化物質GSH對MCs引起肝臟損傷的保護效應方面是本研究的另一重點。

還原型GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種三肽，能和過氧化物及自由基結合，以對抗氧化劑對巰基的破壞，同時對抗自由基對重要臟器的損害[6]。外源性物質進入體內打破GSH的平衡會導致氧化損傷而損害機體[15]。有研究表明，GSH的前體物質劑N-乙酰半胱氨酸物質具有緩解MCs毒性作用的功能[16]。王琳等[17]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加GSH可緩解了MC-LR對羅非魚肝臟的毒性，也可緩解草魚因MCs引起的中毒癥。董桂芳等[18]的實驗表明，在黃顙魚飼料中添加500～800 mg/kg GSH可降低MCs的毒性。以上研究表明，GSH對MC-LR所致毒性具有一定保護性。本研究觀察了GSH對MC-LR所致肝臟氧化損傷的保護作用，結果顯示，GSH低、高劑量干預組的小鼠肝體比與MC-LR染毒組相比明顯降低，病理損害也減輕，MDA水平均減少，同時GSH水平、SOD活性和GSH-Px活性均增高，說明GSH具有很強的抗氧化作用，能清除體內的自由基，提高抗氧化物質含量和活性，從而減輕肝臟損傷，起到拮抗MCs對肝臟損傷的作用。

綜上所述，外源性MC-LR進入機體后可導致機體抗氧化物質活性降低，而使具有細胞毒性的MDA水平增加，給予GSH干預后可拮抗這兩種作用，從而達到保護肝臟的作用，但其具體機制還待進一步研究。

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Effect of glutathione on liver antioxidative function of microcystin-LR-induced mice*

HanZhixia1，YangTing2，ZhangChunlian1，XiongWei1，ZhangQingbi1△

(1.SchoolofPublicHealth;2.Grade2010,PreventiveMedicineSpecialty,SchoolofPublicHealth,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of glutathione(GSH)on liver antioxidative function of microcystin-LR(MC-LR)-induced mice.MethodsForty healthy clean class KM 5-week old mice were selected and divided into five groups by the random sampling method,including the norml saline control group,GSH control group,MC-LR group,MC-LR+low dose GSH group and MC-LR+high dose GSH group,8 cases in each group,half male and half female.The experiment lasted for 15 d by intraperitoneal injection of MC-LR,then the liver histopathological changes,liver tissue activity of superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px)and content of malondialdehyde(MDA) were detected.ResultsCompared with the normal saline control group,liver cell GSH level,SOD and GSH-Px activities in the MC-LR group were significantly decreased (P<0.05),while the MDA level was significantly increased (P<0.05).Compared with the MC-LR group,the GSH level,SOD and GSH-Px activities in the MC-LR+low dose GSH group and MC-LR+high dose GSH group were significantly increased (P<0.05),while the MDA level was significantly decreased(PP<0.05).ConclusionThe GSH intervention can alleviate MC-LR induced mouse liver oxidative toxicity and has protective effect on the liver to some extent.

[Key words]microcystin;glutathione;antioxidative function

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.003

基金項目：四川省衛(wèi)生廳自然科學基金資助項目(120384)；瀘州醫(yī)學院大學生科研項目(2012075)。

作者簡介：韓知峽(1981-)，講師，碩士研究生，主要從事環(huán)境毒理學研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：qingbizhang@126.com。

[中圖分類號]R994.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2457-03

(收稿日期：2015-11-30修回日期：2016-03-15)