王心倩，孫　妍，占衛(wèi)紅，雷　航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢430023)

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結核分枝桿菌 Rv3607c T細胞表位分布情況預測及分析

王心倩，孫妍，占衛(wèi)紅，雷航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢430023)

摘要：為了預測和分析結核分枝桿菌( MTB) Rv3607c抗原的 CD4+T以及CD8+T 細胞表位的分布狀況，首先在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取抗原的氨基酸序列，然后使用BLAST并與人類蛋白進行同源比對；之后使用NetMHC數(shù)據(jù)庫預測并分析MTB的Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位的分布狀況；再使用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC 在線預測分析MTB的Rv3607c抗原CD8+T細胞表位的分布狀況。結合兩個表位預測結果，篩選出最終表位肽段，為后續(xù)驗證試驗做準備。其結果為：首先預測出MTB的Rv3607c抗原有4個CD8+T細胞候選表位；而CD4+T細胞表位的初步結果為強結合表位29個，弱結合表位183個。結合兩個表位預測并分析，最終篩選出2個優(yōu)勢表位肽段。最后預測出的T 細胞候選表位將作為結核病特異性診斷和抗結核多表位疫苗的研究根基。

關鍵詞：結核分枝桿菌；Rv3607c；T細胞表位分析

1引言

結核病是影響我國人民健康的最主要的重大傳染性疾病，是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的。據(jù)2015年WHO報[1]，2014年估算全球有960萬新發(fā)結核病病例，其中包括約540萬男性、320萬女性以及100萬的兒童，其中150萬人死于結核病，更不幸的是，HIV 共感染的不斷擴散、MDR-TB患者的不斷增多，愈加加劇了結核病的危害性。

目前，卡介苗( BCG)是唯一廣泛使用的疫苗，BCG對兒童具有較強的保護作用[2]，尤其是防止兒童重癥結核病的發(fā)生，如結核性腦膜炎。但是卡介苗對成年人的保護作用在降低[3]，并且有些人接種卡介苗后不能保證不感染結核病。隨著耐藥結核病的高發(fā)，以及各種抗結核藥物的較大毒副作用，使得結核病的發(fā)病率以及死亡率不斷攀升。理想的抗結核藥物應當具有抗病高效性以及快速殺菌活性，并且價格低廉。

1998年，結核病的全基因序列被Cole等[4]破譯，分子病理學檢測技術也逐漸被應用于結核病的檢查當中，基因檢查技術也在結核分枝桿菌應用非常廣泛，結核病研究也進入了基因組學新時代?？乖砦回撠熍c抗體或者細胞表面的抗原受體結合而發(fā)揮免疫效應，即一個抗原分子的免疫活性區(qū)域。就目前所知，一個蛋白質抗原的表位，包含B細胞表位、輔助性T細胞表位和細胞毒性T細胞表位、自然殺傷細胞表位等一些與免疫識別密切相關的結構，并且也包含了一些不利于保護性免疫作用的結構。因此篩選和鑒定MTB蛋白抗原優(yōu)勢抗原表位對于通曉結合分支桿菌抗原引起的免疫應答反應、深入了解結核分枝桿菌的致病機制、改進免疫學診斷方法以及新型疫苗開發(fā)具有相當重要的意義[5]。

2材料與方法

2.1材料

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得MTB的Rv3607c蛋白序列(Gene ID: 885345、133 aa)。

2.2同源性分析比對

在 NCBI中的 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )將Rv3607c的蛋白序列以及核酸序列與其他序列進行同源比對分析。登錄NCBI選擇protein Blast，然后選擇非重復蛋白序列Non-redundant protein sequences ( nr) 數(shù)據(jù)庫，并提交Rv3607c抗原序列，分析抗原序列與MTB復合群、非結核分支桿菌以及其他細菌的同源性；然后選擇人類Human，進行分析比對Rv3607c抗原序列與人蛋白序列的同源性。

2.3Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位進行預測

登錄NetMHCⅡpan 3.1 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/service/NetMHCⅡpan/)，該軟件可預測MHCⅡ中的三類分子HLA-DR、HLA-DR以及HLA-DR。預測分析時的限定條件選定為15個氨基酸殘基長度的多肽，HLA-DR亞型，對MTB Rv3607c抗原進行在線預測。NetMHCⅡpan 3.1 Server預測結果輸出依據(jù)親和力的強弱判定，認定親和值小于50 nm為強結合，親和值大于50 nm小于500 nm為弱結合。

2.4Rv3607c抗原的CD8+T細胞表位預測

2.4.1NetMHC表位預測

登錄NetMHC ( http://www.cbs.dtu.dk/service/NetMHC/)，該軟件可預測分析HLA-A、HLA-B、HLA-C以及HLA-E類別的MHC分子。由于絕大多數(shù)HLA分子偏向于與九個氨基酸長度的多肽有強結合，所以選擇氨基酸長度為9個，并選擇可能性最大的HLA-A 02 :01(A2 )以及HLA-A0301(A3 )兩類HLA分子作為限定條件[6]。其預測結果評定方法同NetMHCⅡpan 3.1 Server 。

2.4.2SYFPEITHI表位預測

SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/#userconsent#)是一個主要組織相容性復合體的數(shù)據(jù)庫，可以進行針對MHC等位基因的產物的配體進行預測。進入網(wǎng)站“http://www.syfpeithi.de/#userconse nt#”，選擇HLA- A* 02: 01、HLA- A* 03: 01兩類，多肽長度選為9 個氨基酸，提交抗原序列，記錄分析得分在前2%的多肽序列。

2.4.3BIMAS表位預測

進入BIMAS網(wǎng)站“http :// www - bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bin d/”，BIMAS是依據(jù)多肽分子與HLAⅠ類分子解離所用時間的一半進行排序，其分析結果是依據(jù)系數(shù)表推導的。選擇 A_0201、A3兩類HLA分子，多肽長度選為9 個氨基酸，而后輸入Rv3607c的氨基酸序列并提交，進行預測分析[7]。

2.4.4NetCTL表位預測

登錄NetCTL網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，從Supertype網(wǎng)頁選擇類別中，選定A2和A3兩個超類型，Weight on C terminal cleavage值填寫為“0.15”，以及Weight on TAP transport efficiency填寫為“0.05”，Threshold for epitope identification填寫為“0.75”，而后輸入Rv3607c的氨基酸序列，進行在線預測。NetCTL 預測是通過人工網(wǎng)絡神經(jīng)操作的，結果是以得分高低來分別顯示敏感度和特異度的高低。最后，對預測出的九個氨基酸的肽段，并且得分超過0.75的進行記錄分析[8]。

3結果

3.1Rv3607c抗原同源性比對結果

Rv3607c抗原與結核分枝桿菌復合群(包括非洲分枝桿菌、減毒牛分枝桿菌、人型結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)的同源性都達到100%；與非結核分枝桿菌的同源性為65%—83%，其平均值為74%，與結核分枝桿菌復合群相比，二者之間的同源性不如前者的高；與其他細菌平均值為65%。Rv3607c抗原序列與人類蛋白同源性比對結果匯總可見表1。從表1中可以看得出，Rv3607c抗原與人類蛋白相似性較低，并且同源性僅為46%。

表1人類蛋白同源性與抗原Rv3607c比較結果

蛋白最高評分期望值同源性/%Rv3607c29.65.146

從以上結果可以得出Rv3607c抗原與結核分枝桿菌復合群的同源性相當高，另一方面Rv3607c抗原與人類蛋白的同源性卻較低。因此認為，Rv3607c抗原有作為免疫性結核病疫苗的潛能，并且也有繼續(xù)進行預測分析實驗的必要性。

3.2Rv3607c抗原 T細胞表位結合預測結果

3.2.1Rv3607c抗原表位預測結果

使用NetMHCⅡ pan 3.1 Server對Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位進行預測分析，過程中選擇在中國HLAⅡ分子中分布頻率較高的分子DRB1_0101、DRB1_0301、DRB1_0401、DRB1_0701、DRB1_0802、DRB1_0901、DRB1_1101、DRB1_1302、DRB1_1501作為限定條件，預測結果見表2。從預測結果可知，不同HLA分子結合數(shù)目大相徑庭，具體來說Rv3607c抗原與DRB1_0101強結合的數(shù)目明顯較多；與DRB1_1302結合的短肽數(shù)目最少。與不同HLA分子強弱結合的數(shù)目可見表2。

表2NetMHCⅡpan對Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位分布的預測結果

HLAⅡ分子Rv3607c總肽段數(shù)118強結合肽段數(shù)弱結合肽段數(shù)DRB1_01011440DRB1_0301022DRB1_0401017DRB1_0701028DRB1_0802212DRB1_0901315DRB1_11011020DRB1_1302010DRB1_1501019

3.2.2Rv3607c CD8+T細胞表位預測結果

選擇在中國分布較廣的HLAⅠ分子， HLA-0201 和 HLA-0301作為限定條件，對Rv3607c抗原使用 NETCTL、SYFPEITH、NetMHC和BIMAS這4種不同在線預測軟件進行預測，并且綜合HLA-0201和HLA-0301的預測結果，匯總結果見表3。最后，綜合各種在線工具預測結果，Rv3607c抗原預測出4條抗原表位多肽。

表3不同在線預測工具對 Rv3607c抗原CD8+T 細胞表位的綜合分析

蛋白位置序列NETCTL親和值得分SYFPEITHI得分NetMHC親和值得分BIMAS得分29-37FVIDVTVWI0.82941.4115206.91強結合94.69247-55DLADTYDYV0.39870.724422453.57弱結合86.45856-64RLASRAAEI0.20680.548624214.31弱結合10.433106-114QTFDDVAVV0.52030.932322190.15弱結合13.819

3.2.3Rv3607c CD4+T和CD8+T細胞表位綜合分析預測結果

通過五種在線預測工具分別預測，得出Rv3607c抗原的CD4+與CD8+T細肽段。最后依據(jù)CD4+T細胞表位的肽段包含CD8+T 細胞表位的肽段的原則，預測篩選出抗原 Rv3607c有2 條肽段，結果見表4 。

表4Rv3607c抗原的CD4+T和CD8+T細胞表位綜合分析

蛋白序列CD8表位肽段CD4表位肽段47-61DLADTYDYVDLADTYDYVRLASRA106-120QTFDDVAVVQTFDDVAVVIRRSRR

4討論

在近幾年的研究中，許多特異性結核抗原被研究人員發(fā)現(xiàn)[9]，這一結果為結核病疫苗的研制提供了有價值的研究基礎。許多新的疫苗也在動物實驗中取得了較好的實驗結果，但是仍然存在許多T細胞所識別的MTB蛋白抗原有待開發(fā)，這些抗原表位對于T細胞的激活和應答，包括參與抗MTB感染的免疫起到的重要作用是不容忽視的。在未來的研究中，我們還應當加大對其他MTB蛋白抗原的研究力度，并研制出更具有治療效用、簡單便捷的疫苗。

結核特異性免疫反應極其需要有效的T細胞免疫應答[10-11]。有研究表明，CD4+T細胞能夠產生細胞因子IFN-γ，并且該細胞因子對于實驗結核小鼠模型有極強的保護作用[12]。此外，通過對結核小鼠模型進行研究，實驗人員也證實了CD8+T細胞對特異性免疫應答過程具有保護作用[13]。同時在艾滋病患者中，出現(xiàn)了代謝阻礙的CD4+T細胞會更容易感染結核病[14]，即結核病合并感染艾滋病[15]。有部分研究報道，實驗過程中發(fā)現(xiàn)受到結核分枝桿菌感染的患者體內存在MTB特異性CD8+T細胞[16-17]，包括細胞毒性T細胞[18]以及自然殺傷性細胞[19]。到目前為止，還沒有研究人員對結核分枝桿菌Rv3607c所編碼的蛋白是否影響結核病的發(fā)病做出相關判斷。本研究由于材料的局限性以及其他各方因素的限制，無法做出更加精準的判斷，只有通過進一步實驗，對Rv3607c的表位在結核病診斷所發(fā)揮的作用進行驗證包括測定其免疫保護作用的強弱，才能給出更加讓人信服的結論。

筆者預測分析是通過生物信息學的方法，并使用 SYFPEITH和INETCTL等在線預測軟件對 MTB的Rv3607c的CD8+T以及CD4+T細胞表位進行預測，最終分析預測結果得出優(yōu)勢抗原表位肽段，并且為之后驗證該抗原多肽段的特異性和敏感性做預備。預測過程中，使用NetMHC pan 2.1 Server 在線預測工具對CD4+T 細胞表位進行預測，再使用SYFPEITH對比其他3種在線預測工具預測結果得出Rv3607c抗原的CD8+T細胞表位有4個。最后，綜合CD8+T細胞表位和CD4+T細胞表位預測分析的結果，選取出2條多肽段(DLADTYDYVRLASRA、QTFDDVAVVIRRSRR)進行人工合成，為進一步的驗證實驗做準備。

綜合以上實驗結果，筆者使用五種在線預測工具對MTB的Rv3607c抗原T細胞表位進行預測分析。這五種在線預測工具是根據(jù)Rv3607c的抗原表位多肽與不同等位基因結合能力強弱以及最終得分高低選取出最終優(yōu)勢抗原肽段。最終的實驗結果將作為后階段實驗的理論依據(jù)以及實驗基礎，確定了該抗原的實驗價值，為進一步的驗證實驗打下了良好的基礎。

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Prediction and analysis of T cell epitopes’s distribution of theMycobacteriumtuberculosisRv3607c

WANGXin-qian，SUNYan，ZHANWei-hong，LEIHang，CHENGao-zhan，YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytecnic University,Wuhan 430023,China)

Abstract：To predict and analyze the distribution of CD4+T cell and CD8+T cell epitopes encoded by the Rv3607c ofMycobacteriumtuberculosis,We obtain the amino acid sequences by online NCBI database and analyze the homology between MTB complex and human proteins by BLAST,and predicting the distribution of CD8 T cell epitopes by SYFPEITHI、NETCTL、BIMASand NetMHC databases．After the predictiction，we can select the superior epitopes . For the results，there are 4 CD8+T cell epitopes candidates，29 strong and 138 weak candidate CD4+T cell epitopes candidates. In the end，two superior epitopes can be selected. Prediction of T cell epitopes will be the basis diagnosis of tuberculosis and the study of new tuberculosis vaccine.

Key words：Mycobacteriumtuberculosis;Rv3607c;T cell epitope analyze

收稿日期：2015-01-05.

作者簡介：王心倩(1993-)，女，碩士研究生，E-mail: wawawayyy@qq.com.

文章編號：2095-7386(2016)02-0036-04

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.02.006

中圖分類號：Q 93

文獻標識碼：A