郝秀靜　馬超　李敏

摘要：以結核分枝桿菌H37Ra DNA為模板，通過PCR擴增，獲得靶基因erp片段。采用重疊延伸PCR的方法得到erp基因PGLTS的4基序的突變體，依次刪除突變體的C-末端、N-末端和C/N-端，構建重組質(zhì)粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）pLysS。對重組菌株IPTG誘導后的表達產(chǎn)物進行Tricine SDS-PAGE，得到大小分別約為11.2、15.4、4.8 ku的目的蛋白。Western blotting分析結果表明，目的蛋白表達特異。

關鍵詞：結核分枝桿菌；重復輸出蛋白；重疊延伸PCR；PGLTS；原核表達

中圖分類號：S855.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0031-03

牛結核病是影響?zhàn)B牛業(yè)最為嚴重的疫病之一，且該病為人畜共患傳染病，既造成了極大的經(jīng)濟損失還嚴重威脅著人類健康，其主要致病菌為牛結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）[1]。重復輸出蛋白（exported repeated protein，ERP）是牛結核分枝桿菌上的一個重要毒力因子[2]，別稱P36、Pirg或Rv3810，它是一種分泌蛋白，存在于結核分枝桿菌復合體所有成員（結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡介苗和田鼠分枝桿菌）中[3]，而在其他細菌種內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)同族體，使得Erp成為結核分枝桿菌家族的一個特異信號分子。ERP蛋白全長為284個氨基酸，由3個不同區(qū)域組成，其中1～22個氨基酸是信號肽序列，中心是基于PGLTS基序的12個重復區(qū)[4]，N-末端結構域（氨基酸1～80）和C-末端結構域（氨基酸176～284）高度保守。N-末端含有運送Erp通過質(zhì)膜的信號肽序列，由22個氨基酸組成，帶正電荷的堿性氨基酸（尤其是精氨酸和賴氨酸）含量較為豐富，對于蛋白質(zhì)定位和導肽序列識別有一定作用[5-6]。C-末端富含疏水性氨基酸，可能與膜骨架網(wǎng)絡和細胞質(zhì)膜之間的連接有關，Kocincova等證實Erp蛋白疏水性 C-末端的作用——將Erp錨定在細菌表面[7]。中間是PGLTS重復區(qū)，它的重復區(qū)具有一定的可變性，如麻風分枝桿菌的PGLTS 重復區(qū)是4基序、牛結核分枝桿菌是12基序、而恥垢分枝桿菌是21基序[5]。為研究 Erp 的 PGLTS 區(qū)基序變化以及C-端、N-端與功能的關系，本研究通過查詢GeneBank中erp基因序列，以結核分枝桿菌H37Ra DNA為模板，通過PCR擴增，獲得靶基因erp片段。采用重疊延伸PCR的策略，得到含4基序的PGLTS突變體及基序 C-端、N-端和 C/N-端缺失突變體并構建到原核表達載體中，經(jīng)IPTG誘導表達，為以后進一步深入研究其基序變化以及C端、N端功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

結核分枝桿菌H37Ra、大腸桿菌DH（5α）和質(zhì)粒pET28a（+）由西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室保存，MD18-T Vector、BL21（DE3）pLysSp購自Transgene公司。

1.2 試劑與儀器

限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、KpnⅠ、XhoⅠ，T4 DNA連接酶和Wizard PCR preps DNA Purification System為Promerga公司產(chǎn)品；Taq PCR MasterMix試劑盒、Pfu PCR MasterMix試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒、D2000等DNA marker、100 ku 等預染蛋白質(zhì)marker為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；IPTG、X-Gal、氯霉素、氨芐青霉素購自Sigma公司；胰化蛋白胨（tryptone）、酵母提取物（yeast extract）為OXOID產(chǎn)品；氨基乙酸（甘氨酸）、瓊脂粉等化學試劑為索萊寶公司產(chǎn)品。

1.3 引物設計

利用Primer Premier 5.0設計的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，主要包括：

其中，小寫字母表示保護性堿基，下劃線表示酶切位點，長引物PN1表示在5′端加上Erp信號肽序列。

1.4 野生型erp序列擴增

以結核分枝桿菌H37Ra基因組DNA為模板，引物EP1、EP2擴增erp。50.0 μL反應體系包括20 ng/μL DNA 1.0 μL、10 mol/L上游引物2.0 μL、10 mol/L下游引物 2.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL、ddH2O 20.0 μL。反應條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，擴增30個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。反應產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 ERP 4基序突變體的構建

1.5.1 ERP 6基序突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP3和EP2、EP4為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-E為模板，依次經(jīng)過第1、第2輪PCR擴增得到erp 6個基序的突變體片段，連接到pMD18-T載體上，命名為pMD18-T-6。

1.5.2 ERP 4基序全長突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP5和EP2、EP6為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-6為模板，依次經(jīng)過第1輪、第2輪PCR擴增得到erp 4基序的序列片段。

1.6 4 基序缺失突變體的表達載體構建 以EP7、PN1、PN2、PC、EP8為引物，以pMD18-T-4為模板，擴增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段。缺失基因擴增產(chǎn)物和表達載體pET28a（+）連接，構建4基序為PGLTS突變體C-端、N-端和C/N-端缺失的原核表達載體，并命名為pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4。

1.7 核苷酸序列測定

利用ABI PRISM 3730 核苷酸序列分析儀，對質(zhì)粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4進行核苷酸序列測定，以獲得erp（4基序）的突變序列，具體工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.8 IPTG誘導表達重組蛋白并檢測

接種環(huán)劃線BL21（DE3）plsys（pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4），過夜培養(yǎng)12 h，挑取單個菌落，接種于含30 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下培養(yǎng) 12～16 h。將該菌液以1%接種量接種于含30 μg/mL Kan LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃、180 r/min下?lián)u瓶3 h，加入 IPTG 使終濃度達到1 mmol/L，于32 ℃、180 r/min下過夜誘導表達，進行SDS-PAGE檢測。

1.9 重組表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western blotting分析

將挑取的陽性菌落進行培養(yǎng)，加入IPTG，于32 ℃下過夜誘導表達，收集菌體，提取蛋白后進行SDS-PAGE檢測及Western blotting分析，檢測時陽性血清為1 ∶ 200 倍稀釋的兔陽性血清，二抗為1 ∶ 800 倍稀釋的HRP標記的兔抗鼠IgG。

2 結果與分析

2.1 野生型erp序列擴增

利用PCR技術從結核分枝桿菌H37Ra基因組DNA中擴增出大小約為855 bp的基因片段（圖1），連接到pMD18-T載體中。

2.2 ERP 4基序突變體的構建

2.2.1 ERP 6基序突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP3和EP2、EP4為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-E為模板，依次經(jīng)過第1輪（圖2）、第2輪（圖3）PCR擴增得到erp 6個基序的突變體片段，連接到pMD18-T載體中。將含有目的基因的重組質(zhì)粒分別進行酶切鑒定和序列測定，與預期結果一致，將重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-6。

2.2.2 ERP 4基序全長突變體的構建 利用重疊延伸技術，以EP1、EP5和EP2、EP6為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-6為模板，依次經(jīng)過第1輪（圖4）、第2輪（圖5）PCR擴增得到erp 4基序的序列片段。

2.3 4基序缺失突變體及其表達載體的構建

利用PCR技術，以EP9、PN1、PN2、PC、EP10為引物，以pMD18-T-4為模板，擴增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段，分別為405、495、231 bp的產(chǎn)物（圖6）。

缺失基因擴增產(chǎn)物和表達載體pET28a（+）經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)Wizard PCR preps DNA Purification System試劑盒純化回收后用T4 DNA Lingase進行連接，4 ℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS 中，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定（圖7），將篩選得到的陽性重組子分別命名為pET28a-C4、

pET28a-N4、pET28a-CN4。對其進行核苷酸序列測定，結果表明其基因序列和閱讀框架正確。

2.4 IPTG誘導表達重組蛋白及SDS-PAGE分析

將用于毒性蛋白表達的BL21（DE3）pLysS菌株作為pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4融合基因的表達宿主菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化挑取單個菌落培養(yǎng)，IPTG過夜誘導，菌體處理后，用Tricine SDS-PAGE分析，結果表明菌體中含有目的蛋白（圖8），分子量大小分別約為11.2、15.4、4.8 ku，與理論值相符，表明融合基因可在BL21（DE3）pLysS中實現(xiàn)表達。

2.5 表達產(chǎn)物的 Western blotting分析

BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4）表達產(chǎn)物進行Western blotting試驗分析，結果表明，重組蛋白可以被His-Tag特異性抗體識別，在約11.2、15.4、4.8 ku處出現(xiàn)識別條帶，而陰性對照在相同的位置沒有條帶（圖9），表明毒性蛋白在宿主菌中特異表達。

3 結論與討論

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種人畜共患病，它嚴重威脅人類健康，大約每年導致180萬人死亡[8] 。erp基因是結核分枝桿菌中一個重要的毒力基因，Christine等研究發(fā)現(xiàn)Erp 蛋白在分枝桿菌的細菌壁滲透性屏障形成中起重要作用，Erp缺陷可造成細菌壁通透性的缺陷，使之可以透過一些親脂性物質(zhì)，致使細菌對宿主的防御反應敏感，如活性氧、活性氮和防御素等可以透過細菌壁而對細菌起到殺傷作用[9]。Erp不僅僅是一種毒力因子，在麻風結核桿菌中還是一種免疫優(yōu)勢抗原，可以誘發(fā)機體的細胞免疫和體液免疫。早期研究空洞和非空洞結核病患者時發(fā)現(xiàn)，Erp蛋白僅可以刺激空洞性結核病患者機體產(chǎn)生抗體，而在結核病潛伏感染者體內(nèi)很少甚至沒有抗體產(chǎn)生[10]。

Kyte-Doolittle分析Erp蛋白時顯示，C-末端富含疏水性氨基酸可能與膜骨架網(wǎng)絡和細胞質(zhì)膜之間的連接有關。Kocincova等對恥垢結核分枝桿菌Erp進行突變，闡釋該蛋白疏水性C-末端將Erp錨定在細菌表面。ERP蛋白的N-端，PGLTS 重復區(qū)序列的不同對該蛋白質(zhì)的致病性和輸出運輸具有較大的影響，但是目前在ERP基序變化以及C、N端功能方面的研究還不是很清楚。

本試驗成功克隆了結核分枝桿菌erp，對erp進行一系列突變，得到4個基序的突變體，以pET28a（+）為載體構建大腸桿菌融合表達系統(tǒng)——BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4），經(jīng)Tricine SDS-PAGE檢測，目的蛋白大小為11.2、15.4、4.8 ku。Western blotting結果顯示，目的蛋白能被特異性抗體識別，本研究結果為進一步研究Erp的功能奠定了基礎。

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