梁俊玉，劉 晶，劉晶晶，胡 剛，楊 強(qiáng)，張 繼

(1. 西北師范大學(xué)　生命科學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州730070;2. 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州730070)

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隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷提取工藝研究

梁俊玉1，劉 晶1，劉晶晶1，胡 剛1，楊 強(qiáng)1，張 繼2*

(1. 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州730070;2. 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州730070)

摘要通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，提取隴蜀杜鵑葉中主要活性成分金絲桃苷，采用高效液相色譜法測(cè)定，確定金絲桃苷的最佳提取工藝。結(jié)果顯示影響隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷得率的主要因素是乙醇濃度，各因素影響順序?yàn)橐掖紳舛?料液比>提取溫度>提取時(shí)間，金絲桃苷最佳提取工藝為：乙醇濃度50%、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h，得率為0.68%。該方法提取隴蜀杜鵑葉中的金絲桃苷得率高，穩(wěn)定性好，工藝可控性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞隴蜀杜鵑；金絲桃苷；提取工藝；高效液相色譜

隴蜀杜鵑(RhododendronprzewalskiiMaxim.)為杜鵑花科植物，又名青海杜鵑、金背杜鵑、野枇杷，藏藥稱為達(dá)瑪，為常綠灌木，生于海拔2 900～4 300 m的高山林地中，常成林。在我國(guó)主要分布于陜西、甘肅、青海及四川等地，儲(chǔ)量較大[1-3]。隴蜀杜鵑具有清肺瀉火、止咳化痰作用，治療咳嗽痰喘、老年慢性支氣管炎等疾病[4-5]。隴蜀杜鵑葉中主要成分金絲桃苷[6]具有鎮(zhèn)痛，抗氧化，保護(hù)心肌、肝臟作用，還具有抗乙肝病毒作用等，具有廣泛藥理活性和潛在的應(yīng)用前景[7]。金絲桃苷存在于多種植物中，含量也不相同，其中含量較高的為貫葉連翹(1.02%～1.46%)， 云南山楂 (0.289%)， 地榆 (0.052%～0.291%)，黃蜀葵花(1.12%)，金華葵花(1.125%)，毛果杜鵑中(0.1565%)[8]。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇熱回流法提取隴蜀杜鵑葉中的主要活性成分金絲桃苷，并用HPLC法測(cè)定其得率，確定金絲桃苷最佳提取工藝，旨在為有效開發(fā)和合理利用隴蜀杜鵑資源提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1隴蜀杜鵑葉

隴蜀杜鵑葉采自甘肅省天祝縣石門鎮(zhèn)，海拔3 000 m，植物標(biāo)本經(jīng)西北師范大學(xué)晏民生副教授鑒定為杜鵑花科植物隴蜀杜鵑(RhododendronprzewalskiiMaxim.)。

1.1.2設(shè)備與試劑

戴安UltiMate3000高效液相色譜儀(美國(guó)，DIONEX公司)；電子天平；KW-水浴鍋。乙醇、甲醇、石油醚(60～90 ℃)(以上試劑均為分析純)，磷酸、甲醇(以上試劑均為色譜純)。金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京盈澤納新化工技術(shù)研究院(批號(hào)：MUST-13080201)。

1.2方法

1.2.1提取方法

隴蜀杜鵑葉曬干，粉碎，過(guò)40目篩，放入圓底燒瓶并加入石油醚熱回流提取，過(guò)濾，棄去石油醚提取液，取出藥渣晾干。將已晾干的藥渣樣品準(zhǔn)確稱取1.00 g置50 mL圓底燒瓶中，加入一定濃度和體積的乙醇溶液，在一定溫度下浸提一定的時(shí)間，過(guò)濾，濾液濃縮后，加入甲醇溶解，在50 mL容量瓶中定容，搖勻，用高效液相色譜分析儀測(cè)定金絲桃苷含量。

1.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選定乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比作考察4因素，先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，找出每個(gè)單因素的最佳因素水平，再以每組因素最佳水平為參考，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提取液中金絲桃苷的含量為考察指標(biāo)，確定從隴蜀杜鵑葉中提取金絲桃苷的最佳工藝。

1.2.3含量測(cè)定方法

1.2.3.1色譜條件色譜柱為Kromasil-C18柱；流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸水溶液(40∶60)；流速0.8 mL/min;柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備準(zhǔn)確稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,置于25 mL容量瓶中。用甲醇定容至刻度，搖勻。分別吸取上述溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，利用高效液相色譜分析儀分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.2.3.3精密度實(shí)驗(yàn)取“1.2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算精密度。

1.2.3.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)制備6份原藥材供試液按上述色譜條件操作，測(cè)定峰面積，計(jì)算精密度。

1.2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一濃度的對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積，計(jì)算精密度。

1.2.3.6加樣回收實(shí)驗(yàn)取已知含量的樣品粉末適量，加入一定量的對(duì)照品，制備成6份供試品溶液按照上述測(cè)定條件進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定峰面積，計(jì)算精密度。

1.2.4提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1溫度對(duì)提取效果的影響按照1.2.1所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別設(shè)定提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，提取金絲桃苷，得到的樣品液用高效液相色譜分析儀按“1.2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算其金絲桃苷含量，選擇出較適宜的浸提溫度。

1.2.4.2乙醇濃度對(duì)提取效果的影響按照1.2.1所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別用水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇，提取金絲桃苷，測(cè)定并計(jì)算出金絲桃苷含量，選擇出較適宜的乙醇濃度。

1.2.4.3料液比對(duì)提取效果的影響按照1.2.1所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別用料液比(g/mL)為1∶5、1∶15、1∶25、1∶35，按上述方法提取金絲桃苷，測(cè)定計(jì)算出金絲桃苷含量，選擇出較適宜的料液比。

1.2.4.4時(shí)間對(duì)提取效果的影響按照1.2.1所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別浸提提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h，按上述方法提取金絲桃苷，測(cè)定并計(jì)算出金絲桃苷含量，選擇較適宜的浸提時(shí)間。

1.2.5提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)中最佳水平為參考，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提取液中金絲桃苷的含量為考察指標(biāo)，確定從隴蜀杜鵑葉中提取金絲桃苷的最佳工藝。

2結(jié)果與分析

2.1金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用高效液相色譜分析儀測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，〗見(jiàn)圖1，得金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=1120.7X-02128，r2=0.9990,線性范圍0.004～0.04 mg/mL。

2.2精密度分析

2.2.1精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一濃度的的對(duì)照品連續(xù)測(cè)定5次。RSD為1.06%，結(jié)果表明，該測(cè)定方法精密度良好。

圖1　金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

制備6份原藥材供試液，分別測(cè)定，RSD為1.96%，結(jié)果表明，該測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。

2.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一濃度的對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行測(cè)定，RSD為1.48%，結(jié)果表明，樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4加樣回收實(shí)驗(yàn)

取已知含量的樣品粉末適量，加入一定量的對(duì)照品，制備成6份供試品溶液測(cè)定，加樣回收率在98.06%～101.76%，RSD為1.84%。

2.3提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1溫度對(duì)提取效果的影響

改變浸提溫度提取隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷，結(jié)果表明，溫度對(duì)提取效果影響不明顯，綜合考慮經(jīng)濟(jì)、節(jié)約等各方面因素，確定最佳浸提溫度為70 ℃。

2.3.2乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

采用不同乙醇濃度提取隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷，結(jié)果表明，金絲桃苷得率開始時(shí)隨乙醇濃度的增大而增大，當(dāng)乙醇濃度60%時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著乙醇濃度的升高，金絲桃苷得率有所下降，因此從隴蜀杜鵑葉中提取金絲桃苷，采用60%的乙醇溶液為提取劑效果最好。

2.3.3料液比對(duì)提取效果的影響

采用不同料液比提取隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷，結(jié)果表明，金絲桃苷得率隨料液比的增大而增大，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著料液比的升高，金絲桃苷得率有所下降，因此從隴蜀杜鵑葉中提取金絲桃苷，料液比為1∶15是效果最好。

2.3.4時(shí)間對(duì)提取效果的影響

改變浸提時(shí)間提取隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷，結(jié)果表明，時(shí)間對(duì)提取效果影響不明顯，綜合考慮經(jīng)濟(jì)、節(jié)約等各方面因素，確定最佳浸提溫度為1.0 h。

2.4提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1正交因素水平表

以單因素實(shí)驗(yàn)中最佳水平為參考，采用L9(34)正交法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)水平

2.4.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。影響隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷得率的主要提取因素為乙醇濃度，各因素的影響順序?yàn)橐掖紳舛?料液比>提取溫度>提取時(shí)間，提取最佳工藝組合為A3B1C3D2,即乙醇濃度50%、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h，得率為0.68%。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)處理

3結(jié)論

對(duì)隴蜀杜鵑葉中的金絲桃苷進(jìn)行乙醇熱回流法提取，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)影響隴蜀杜鵑葉中金絲桃苷得率的主要因素是乙醇濃度。其最佳工藝組合為乙醇濃度50%、料液比1∶25、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h，得率為0.68%。實(shí)驗(yàn)證明，最佳工藝的平均提取得率高，穩(wěn)定性好，且工藝操作控制容易。

4討論

本實(shí)驗(yàn)從隴蜀杜鵑葉中提取金絲桃苷得率可達(dá)0.68%。與貫葉連翹和黃蜀葵花、金華葵花中的金絲桃苷相比較，含量要低，但比其它植物中金絲桃苷含量高。且所用原料為植物葉，和黃蜀葵、金華葵所用原料花比較起來(lái)，資源量要大。隴蜀杜鵑在國(guó)內(nèi)資源豐富、分布較為廣泛，原料易得，并在采集其葉子后不會(huì)對(duì)植物造成傷害，從而在金絲桃苷的進(jìn)一步開發(fā)和利用方面具有一定意義。

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Study on Extracting Technique of Hyperin fromRhododendronprzewalskiiLeaves

Liang Junyu1, Liu Jing1, Liu Jingjing1, Hu Gang1, Yang Qiang1, Zhang Ji2*

(1.College of Life Science of Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China;2. Gansu Engineering Research Center for Effectire Component Products of Characteristic Plants,Lanzhou 730070, China)

AbstractHyperin fromRhododendronprzewalskiileaves was extracted By single factor and orthogonal experiments and measured by HPLC method. The optimum extract technique was determinated. The main factor that influenced the yield of extracting hyperin was alcohol concentration, the order of each factors is alcohol concentration > solvent ratio > temperature > extraction time, the best extract technique is that alcohol concentration was 50%, solvent ratio was 1∶25, temperature was 80℃ and extraction time was 1h. The yield is 0.6807%. The extract technique had the high yield.

Key wordsRhododendronprzewalskiiMaxim.; hyperin; extract technique; HPLC

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.03.006

收稿日期：2015-10-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200255) 。

作者簡(jiǎn)介：梁俊玉(1978—),男,碩士,副教授,研究方向：天然產(chǎn)物研究。E-mail:liangjunyu@nwnu.edu.cn * 通訊作者：張繼,教授。E-mail:zhangj@nwnu.edu.cn

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-9690(2016)03-0017-04