陳 芳，劉 琴，王麗平，陳利峰，張 宜

（1.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，武漢 430070；2.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430070）

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改良組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細胞

陳 芳1，劉 琴1，王麗平1，陳利峰2，張 宜1

（1.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，武漢 430070；2.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430070）

【摘要】目的 通過改良組織塊細胞培養(yǎng)法，建立一種簡單，可行的兔成纖維樣滑膜細胞體外培養(yǎng)方法。方法 無菌條件下取正常兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剔凈后剪成碎塊，用滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分，碎片接種于培養(yǎng)皿，觀察細胞生長狀況及形態(tài)特征。取第3代對數(shù)期細胞，用CCK-8法繪制其生長曲線，并用免疫熒光法檢測波形蛋白的表達情況。結(jié)果 體外培養(yǎng)的兔成纖維樣滑膜細胞形態(tài)為長梭形纖維樣，細胞生長力較旺盛，生長曲線為典型的“S”型，免疫熒光檢測顯示第3代細胞強表達波形蛋白。結(jié)論 改良組織塊法可以分離培養(yǎng)出兔成纖樣維滑膜細胞，方法簡便，成功率高，滿足實驗要求。

【關(guān)鍵詞】改良組織塊法；兔成纖維滑膜細胞；分離；培養(yǎng)

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的慢性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其確切的病因還不完全確定，該病主要侵犯全身各處關(guān)節(jié)，致殘率很高，嚴重危害著人類健康。關(guān)節(jié)囊分為內(nèi)外兩層，外層為結(jié)締組織，內(nèi)層較疏松，稱為滑膜，滑膜表面有2～4層扁平或立方形的上皮樣結(jié)締組織細胞，即為滑膜細胞，成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）為滑膜中最主要的細胞，它參與滑膜增生和組織蛋白酶的分泌，與RA晚期關(guān)節(jié)損傷有著密切的關(guān)系［1，2］。關(guān)節(jié)滑膜是RA發(fā)病的靶器官，滑膜過度增生、增厚是造成關(guān)節(jié)損傷的主要病理基礎之一［3，4］。因此，建立FLS的體外培養(yǎng)方法是探尋RA發(fā)病機制與體外篩選藥物的重要手段。本研究應用改良組織塊法，體外分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細胞，并從細胞形態(tài)學、波形蛋白免疫熒光染色等方面予以鑒定，現(xiàn)報告如下。

1　材料和方法

1.1材料

實驗動物：健康新西蘭大白兔3只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，清潔級，由武漢市新洲區(qū)萬千佳禾實驗動物養(yǎng)殖場提供【SCXK（鄂）2011-0011】，本實驗在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科動物實驗設施內(nèi)進行【SYXK（鄂）2014-0082】。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。

1.2方法

1.2.1成纖維樣滑膜細胞的分離培養(yǎng)：新西蘭大白兔一只，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸濕膝關(guān)節(jié)，去皮，1%碘伏與75%酒精依次消毒，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，找出關(guān)節(jié)囊，用手術(shù)剪分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出平滑光亮的滑膜層組織，將滑膜組織放入含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的PBS中。移入超凈臺中，用含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的PBS 洗3次，用滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分，剪成1 ～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿7～8塊滑膜組織塊，溫箱內(nèi)放置5 min后，加入1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后每皿輕輕補加1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長形態(tài)并照相。4～5 d后進行首次換液，12～14 d后細胞達到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶進行1∶2傳代。

1.2.2細胞生長曲線的測定：取第3代細胞，按1 ×103/孔接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設置5個復孔，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d后隨機取出一組，按照CCK-8試劑盒操作說明，在酶標儀上檢測每孔A值，繪制細胞生長曲線。

1.2.3細胞鑒定：取第3代細胞，按1×105/孔接種含有爬片的6孔板中，細胞培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定液于4℃固定30 min。PBS洗3次，0.5%Triton X-100室溫通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，滴加足夠量的vimentin一抗（1∶100稀釋）并放入濕盒，4℃孵育過夜。PBS洗3次，吸水紙吸干爬片上多余液體，滴加稀釋好的熒光（Cy3）標記羊抗小鼠IgG（1∶100稀釋），濕盒中20℃ ～37℃孵育1 h，PBS洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2　結(jié)果

2.1細胞形態(tài)觀察

改良組織塊貼壁接種3～4 d后，在光學顯微鏡下可見組織塊周圍有大量的亮點，少量細胞生長，有長梭形、圓形和不規(guī)則的多角形，但以長梭形為主（圖1A）。7～8 d后，在光學顯微鏡下可見大量細胞生長，細胞形態(tài)以長梭形為主，仍然存在少數(shù)多角形和圓形細胞（圖1B）。9～10 d后用1 mL槍頭輕輕吸出組織塊。15～20 d，細胞數(shù)量明顯增多，達到90%融合，形態(tài)為以典型的長梭形為主（圖1C）。培養(yǎng)出來的細胞傳至P3時，可見成纖維細胞樣細胞多為長梭形且分布均勻（圖1D）。

圖1　原代兔成纖維樣滑膜細胞培養(yǎng)（×10）Note：A.Primary culture for 3-4 days；B.Primary culture for 7-8 days；C.Primary culture for 15-20 days；D.The third passage cells.Fig.1 Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes（×10）

2.2免疫熒光觀察

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，改良組織塊法分離得到的細胞表達中胚層組織特征性波形蛋白，用千屏圖像采集系統(tǒng)分析細胞的陽性率達98%以上（圖2）。

2.3細胞生長曲線

圖2　免疫熒光檢測兔成纖維樣滑膜細胞胞漿中波形蛋白表達情況（A×10；B×40）Fig.2 The expression of vimentin in rabbit fibroblast-like synoviocytes by immunofluorescence staining（A×10；B×40）

通過CCK-8法檢測P3兔成纖維樣滑膜細胞增殖能力，繪制出來的細胞生長曲線呈現(xiàn)典型的“S”形（圖3）。傳代后第一天細胞數(shù)量有所減少，經(jīng)過2 d潛伏期后在4 d進入對數(shù)生長期，隨著培養(yǎng)時間的增加而增殖，第7天進入平臺期后，細胞生長穩(wěn)定，最后達到衰老。

圖3　兔成纖維樣滑膜細胞生長曲線Fig.3 The growth curve of rabbit fibroblast-like synoviocytes

3　討論

原代細胞培養(yǎng)主要有機械分散法、組織塊培養(yǎng)法和酶消化法。本實驗在傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法的基礎上進行改進，從新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)中分離得到滑膜組織，剪成1～5 mm3大小，在組織塊置于3.5 cm培養(yǎng)皿之前，用滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分，溫箱內(nèi)放置5 min后，加入1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后每皿輕輕補加1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，3～4 d后，在光鏡下可見組織塊邊緣有很多圓形的亮點，長出少數(shù)細胞形態(tài)多為典型的長梭形，偶見多角形和圓形，15～20 d即可達到90%融合，細胞形態(tài)以典型的長梭形為主。通過胰蛋白酶消化傳代后，大量成纖維細胞樣細胞均勻分布。本實驗培養(yǎng)出的第3代兔成纖維樣滑膜細胞呈現(xiàn)典型的“S”形，與文獻報道一致［5］。傳至5～6代后，細胞逐漸老化，7 ～8代后活性幾乎喪失，老化停止增殖，建議采用3 ～4代細胞進行相關(guān)實驗。

成纖維樣滑膜細胞細胞表面標記物有：尿二苷磷酸葡萄糖脫氫酶 （uridinediphosphoglucose dehydrogenase，UDPGD），鈣粘蛋白-11（cadherin-11），CD14，CD44，促衰變因子（decay accelerating factor，DAF/CD55/mAb67），脯氨酸羥化酶、Thy-1/ CD90，血管細胞粘附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1/CD106），波形蛋白（vimentin）等，其中vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羥化酶是各種成纖維細胞的標記物［6-8］。實驗選用最常用波形蛋白來鑒定成纖維樣滑膜細胞。通過免疫熒光檢測結(jié)果顯示P3兔成纖維滑膜細胞表達vimentin，與袁琴等人報道的相符［9］。

滑膜細胞主要包括巨噬樣滑膜細胞和成纖維樣滑膜細胞，其中主要為成纖維樣滑膜細胞［10］。原代培養(yǎng)細胞多利用自然純化法獲得較高純度的細胞，即利用成纖維樣滑膜細胞可以貼壁生長、貼壁能力較強、增殖速度較快的特性，通過優(yōu)勢生長、多次消化傳代來去除非成纖維型細胞和不健康的成纖維細胞，從而獲得較高純度的成纖維樣滑膜細胞［11］。千屏圖像采集系統(tǒng)分析免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)vimentin的陽性率高達98%，與丁娟等人分離的人成纖維樣滑膜細胞vimentin陽性率相符［12］，說明通過多次傳代可以得到高純度的兔成纖維樣滑膜細胞。

該實驗采用改良組織塊法成功分離培養(yǎng)出兔成纖維樣滑膜細胞，與傳統(tǒng)的組織塊貼壁法相比，最大的優(yōu)點就是大大縮短了組織塊貼壁時間且操作簡單，組織塊置于培養(yǎng)皿之前進行了吸水處理后，只需要放置培養(yǎng)箱5 min后，就可以很牢固貼在培養(yǎng)皿上，之后加一半培養(yǎng)液即可，24 h候后補加剩下的一半培養(yǎng)液就行了，而傳統(tǒng)組織塊法由于沒有進行吸水處理，組織塊貼壁時間需要2～4 h，并且貼得不夠牢固，稍微操作不當組織塊就會漂浮起來，就很難長出細胞。但在采用改良組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維滑膜細胞的過程中也有一些注意事項：（1）取材比較繁瑣所耗時間過長，取材必須保證無菌操作下進行，實驗前應進行嚴格消毒；（2）由于取材時間較長，最好在冰塊上取材，這樣溫度恒定不喪失組織塊細胞活性，取材后立即進行培養(yǎng)；（3）滑膜組織塊的接種量是也是成功培養(yǎng)出兔成纖維滑膜細胞的關(guān)鍵，如一個3.5 cm培養(yǎng)皿加入7～8塊剪碎的組織塊即可，太多組織塊，沒有細胞生長的空間，太少組織塊，細胞的量太少，滿足不了后續(xù)實驗。（4）由于滑膜位于關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，在取材的過程中操作要特別仔細和小心，否則很容易取錯滑膜，導致雜細胞過多，實驗不成功。

參考文獻：

［1］ 鄒仲之，等.組織學與胚胎學［M］.北京；人民衛(wèi)生出版社，2004：54-55.

［2］ Turner JD，F(xiàn)iler A.The role of the synovial fibroblast in rheumatoid arthritis pathogenesis［J］.Curr Opin Rheumatol，2015，27（2）：175-182.

［3］ 張曉明，陳飛虎，黃學應，等.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞的體外培養(yǎng)與鑒定［J］.解剖學雜志，2007，30（6）：770 -773.

［4］ 談益芬，唐艷麗，王勝香，等.中藥組方NDRF對佐劑性關(guān)節(jié)炎家兔滑膜MMP-3、VEGF分子及其mRNA的影響［J］.中國免疫學雜志，2014，30（1）：57-59.

［5］ 秦蘇萍，孫德旭，李慧，等.CIA大鼠滑膜成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定［J］.免疫學雜志，2014，30（12）：1096-1099.

［6］ 蔡文虹，孫保東，張寶鳳，等.兩種方法分離培養(yǎng)類風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞的比較［J］.中國當代醫(yī)藥，2012，19（21）：13-19.

［7］ Zong M，Lu T，F(xiàn)an S，et al.Glucose-6-phosphate isomerase promotes the proliferation and inhibits the apoptosis in fibroblastlike synoviocytes in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2015，17（1）：100.

［8］ RosengrenS，BoyleDL，F(xiàn)iresteinGS.Acquistion，culture and phenotyping of synovial fibroblasts［J］.Mehods Mol Med，2007；135：365-375.

［9］ 袁琴，闞衛(wèi)兵，宋朋飛，等.大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜細胞原代培養(yǎng)［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學展，2012，12（2）：253-290.

［10］ 蔣明，朱立平，林孝義.風濕病學［M］.北京；科學出版社，1995：774-775.

［11］ 司徒鎮(zhèn)強，吳軍正，等.細胞培養(yǎng)［M］.西安：世界圖書出版西安公司，2009：65-67.

［12］ 丁娟，王志軍，董曉薇，等.RA滑膜成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12（36）：7008-7011.

〔修回日期〕2016-01-13

綜述與專論

Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes using an improved explant culture method

CHEN Fang1，LIU Qin1，WANG Li-ping1，CHEN Li-feng2，ZHANG Yi1
（1.Department of Medical Experiments，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430070，China；2.Department of Integrated Traditional and Western Medicine，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430070，China）

【Abstract】Objective To establish an easier and better method for primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes（FLS）by modified tissue cell culture.Method Healthy rabbit joint synovial layers were cut into small pieces and siphoned off water attached on the tissue with sterile filter paper and then cultured.The growth status and morphology were observed.The growth curve of the 3rdpassage cells was measured by CCK-8 assay，and the expression of vimentin was detected by immunocytochemistry.Results The FLS cultured in vitro exhibited a spindle-shaped appearance and could rapidly expand.The cell growth curve was typical of S type，and the cells highly expressed vimentin.Conclusions Primary culture of rabbit FLS by the improved explant culture method is successfully established.The method is simple and highly efficient.It provideds a new method for isolation of FLS.

【Key words】Improved explant culture method；Rabbit fibroblast-like synoviocytes；Isolation；Culture

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0075-04

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.014

［作者簡介］陳芳（1979-），女，主要研究方向：細胞生物學及藥效學研究，E-mail：wpcf401717@163.com。

［通訊作者］張宜（1966-），男，主任藥師，主要研究方向：藥劑學及藥物信息學研究，E-mail：hbpizy@tom.com。