何冬蘭，詹　銳，萬(wàn)文結(jié)，薛芷筠

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北省重金屬?gòu)U水處理與回收工程技術(shù)研究中心, 武漢 430074)

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一株厭氧型聚磷菌的分離鑒定與聚磷特性

何冬蘭，詹銳，萬(wàn)文結(jié)，薛芷筠

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北省重金屬?gòu)U水處理與回收工程技術(shù)研究中心, 武漢 430074)

摘要在厭氧-缺氧環(huán)境下，從磷礦廢水中篩選出一株高效的厭氧型聚磷菌，命名為AP06.對(duì)該菌株進(jìn)行了生理生化研究及16S rDNA序列分析，并對(duì)該菌株的聚磷效率和影響聚磷特性的因素進(jìn)行了研究.結(jié)果顯示：菌株初步鑒定為Aeromonassobria，聚磷效果最佳的pH值為7，溫度為30℃，磷源為KH2PO4，接種量(V/V)為7%，菌株的聚磷效率為86.1%.

關(guān)鍵詞篩選; 聚磷菌; 厭氧; 鑒定

水是人類與所有生物生存與發(fā)展的最基礎(chǔ)資源之一.近年來(lái)水體富營(yíng)養(yǎng)化問題越來(lái)越嚴(yán)重，使得人類面臨著水資源短缺與水環(huán)境污染的雙重挑戰(zhàn).氮、磷污染物是導(dǎo)致眾多內(nèi)陸湖、水庫(kù)甚至河流水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要因素[1].在所有已知的除磷方法中，成本低廉且無(wú)二次污染的微生物修復(fù)技術(shù)是解決水體富營(yíng)養(yǎng)化的有效途徑之一[2].

隨著反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，厭氧型的聚磷菌已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)，這類微生物能在厭氧-缺氧的條件下完成反硝化和有效聚磷的雙重目的，對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化的治理具有巨大的潛力及重大意義[3].

通過(guò)本研究，希望從磷礦廢水中篩選出能在厭氧環(huán)境下高效聚磷的菌株，同時(shí)對(duì)該菌株的聚磷條件進(jìn)行研究，能為磷污染水體的生物修復(fù)奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料和儀器

厭氧培養(yǎng)箱(YQX-II型上海厭氧培養(yǎng)箱)，紫外分光光度計(jì)(Lambda 35型，英國(guó)PerkinElmer公司)，數(shù)字型pH計(jì)(國(guó)營(yíng)杭州萬(wàn)達(dá)儀器儀表廠)，BA400顯微鏡(德國(guó)Motic公司).

過(guò)硫酸鉀，抗壞血酸，鉬酸銨，硫酸，磷酸二氫鉀等試劑均為國(guó)藥集團(tuán)分析純.

廢水樣本取自湖北省宜昌市長(zhǎng)陽(yáng)開發(fā)區(qū)磷礦區(qū)廢水.

主要培養(yǎng)基包括：1) 分離培養(yǎng)基[4]：無(wú)水乙酸鈉5 g、MgSO4·7H2O、CaCl20.2 g、 (NH4)2SO42 g、K2HPO4分別為2、5、 8 、10、15、 20 mg、水1000 mL；2)YG培養(yǎng)基基[5]：酵母浸膏1 g、葡萄糖1 g、K2HPO40.3 g、KH2PO40.25 g、MgSO40.2 g、水 1000 mL；3)合成廢水[6]：乙酸鈉0.925 g、蛋白胨0.1 g、酵母膏0.01 g、NaCl 0.05 g、KH2PO40.0655 g，MgCl2·7H2O 0.1537 g、CaCl20.025 g、水1000 mL 、pH 7.0～7.2；4) LB培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1000 mL、pH 7.0～7.2.

1.2厭氧型聚磷菌的篩選

取1 mL的磷礦廢水加入到100 mL分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600>0.3)后，依次取1 mL接入不同磷含量的分離培養(yǎng)基中，將有菌落生長(zhǎng)的含磷濃度最大的菌液進(jìn)行梯度的稀釋后涂布在LB固體培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落并保存菌種.

1.3菌株AP06聚磷效果的測(cè)定

1.4AP06菌株聚磷條件的研究

以合成廢水為基礎(chǔ)，通過(guò)控制不同條件，分別研究pH、溫度、磷源和接種量對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響.

1.4.1pH對(duì)聚磷效果的影響

將合成培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，并接種7%(V/V)的AP06菌株，于厭氧培養(yǎng)箱中30℃下培養(yǎng)48 h 后測(cè)定OD600和聚磷效果.

1.4.2溫度對(duì)聚磷效果的影響

將活化的AP06菌株以7%(V/V)的接種量接種至合成廢水中，于厭氧培養(yǎng)箱中分別為22℃、25℃、28℃、30℃、34℃、37℃等不同溫度條件下培養(yǎng)48 h后測(cè)定菌株的OD600值和聚磷率.

1.4.3磷源對(duì)聚磷效果的影響

將活化的AP06菌株以7%(V/V)的接種量分別接種至以(NaPO3)6、NaH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、K3PO4為磷源的合成廢水中，于厭氧培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定OD600值和聚磷率.

1.4.4接種量對(duì)聚磷效果的影響

將活化的AP06菌株分別取1%、3%、5%、7%、10%(V/V), 不同接種量的菌液至合成廢水中，厭氧培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定菌株的OD600值和聚磷率.

1. 5菌株生理鑒定與16S rDNA分析

對(duì)菌株AP06進(jìn)行亞甲基染色和革蘭氏染色[7,8].將AP06菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，提取菌株總DNA，隨后PCR擴(kuò)增得其16S rDNA.將PCR產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上，經(jīng)DNA測(cè)序后，使用NCBI和MEGA5對(duì)序列進(jìn)行分析并建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

2結(jié)果與分析

2.1聚磷效果的測(cè)定

菌株的聚磷效果結(jié)果見圖1.從圖1可知，AP06菌株在厭氧環(huán)境下經(jīng)過(guò)48 h的生長(zhǎng)后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)基中的磷含量隨著菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)而快速減少，當(dāng)培養(yǎng)至48 h時(shí)，磷濃度由最初的27.3 mg/L降至1.9 mg/L，培養(yǎng)基中磷的去除率即菌株的聚磷效率達(dá)到了86.1%.而作為對(duì)照的E.coli，培養(yǎng)基上清液中的磷濃度由最初的30.4 mg/L降至24.1 mg/L，磷的去除率為20.7%.

圖1　菌株AP06的聚磷效果Fig.1　Efficiency of phosphate accumulating of strain AP06

2.2不同條件對(duì)菌株聚磷效果的影響

2.2.1pH值對(duì)菌株聚磷效果的影響

圖2　pH值對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響Fig.2　Effect of pH on the phosphorus removal rates by strain AP06

pH對(duì)AP06菌株的生長(zhǎng)和聚磷效果有明顯的影響(見圖2).當(dāng)pH低于7時(shí)，菌株AP06的生長(zhǎng)受到了抑制，除磷的效果也較差.菌株AP06在pH為7時(shí)除磷效果達(dá)到最佳， 培養(yǎng)液中磷濃度由20.5mg/L降至8.1mg/L，磷的去除率為68.3%.隨著pH的升高，菌株在48 h時(shí)也能生長(zhǎng)，但除磷效果未提升.

2.2.2溫度對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響

溫度對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響見圖3.由圖3可見AP06菌株的最佳生長(zhǎng)溫度是30℃，此時(shí)除磷效果最佳，磷濃度由19.5 mg/L降至6.4 mg/L，效率為71.8%.當(dāng)溫度低于28℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)和聚磷效果均受到了抑制.溫度過(guò)高不適合菌株的生長(zhǎng)和除磷.

圖3　溫度對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響　Fig.3　Effect of temperature on the phosphorus removal rates by strain AP06

2.2.3磷源對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響

在5種磷源中， AP06菌株對(duì)K2HPO4的吸附效果最好(圖4)，磷濃度由122.46mg/L降到115.86mg/L，聚磷效果為21.7%.NaH2PO4的吸附效果最差.由于5種磷源的培養(yǎng)液含磷量均較高(磷含量>60 mg/L)，導(dǎo)致AP06對(duì)各種磷源的培養(yǎng)液處理效果均不理想.

圖4　磷源對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響Fig.4　Effect of resource of phosphorus on the phosphorus removal rates by strain AP06

2.2.4接種量對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響

10%以內(nèi)的 接種量與AP06菌株的生長(zhǎng)及聚磷效果呈正相關(guān)(見圖5).當(dāng)菌株的接種量低于7%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)和聚磷效率都與接種量成正相關(guān)，菌株的最佳接種量為7%，磷濃度由30.6 mg/L降至5.5 mg/L，聚磷效率為82%，當(dāng)接種量大于7%時(shí)，接種量的增加不會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)和聚磷效率.

圖5　接種量對(duì)菌株AP06聚磷效果的影響Fig.5　Effect of inoculum volume on the phosphorus removal rates by strain AP06

2.2.5染色結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹

在分離培養(yǎng)基中，AP06菌株的菌落呈乳白色，表面光滑，較厚、不透明.顯微鏡下觀察成短桿狀，革蘭氏染色結(jié)果陰性.亞甲基藍(lán)染色結(jié)果能在菌株體內(nèi)觀察到明顯的黑色顆粒，為Poly-P構(gòu)成的異染顆粒.

AP06菌株與Aeromonassobria16S rDNA序列有99%的同源性，初步鑒定該菌株為嗜水氣單胞菌(Aeromonassobria)

圖6　AP06菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6　Phylogenetic tree of strain AP06

3結(jié)語(yǔ)

本研究從磷礦廢水中篩選出一株厭氧型的高效聚磷菌AP06，為革蘭氏陰性菌，并能在菌株體內(nèi)形成Poly-P的異染顆粒，進(jìn)一步經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)分析,AP06菌株初步鑒定為嗜水氣單胞菌(Aeromonassobria).通過(guò)聚磷效果的測(cè)定表明：該株菌在厭氧環(huán)境下48h計(jì)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，聚磷效果為86.1%.根據(jù)國(guó)內(nèi)外近些年的報(bào)道，氣單胞菌聚磷特性的研究數(shù)量很少，周康群等[10]篩得的氣單胞菌菌株聚磷效率為91.0%，Jyotsnarani Jena等[11]篩得的菌株聚磷效率為86%，高茜等[12]所篩得的氣單胞菌聚磷效率為70%.

AP06菌株的最佳聚磷單因素分別為：pH為7，溫度為30℃，磷源為K2HPO4，接種量不低于7%，其中磷源對(duì)菌株聚磷效率的影響較小，pH值、溫度和接種量等單因素對(duì)菌株聚磷效果影響明顯.

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Isolation and Characteristics of an Anaerobic Phosphate-Accumulating Bacterium Strain

HeDonglan,ZhanRui,WanWenjie,XueZhijun

(Research Center for Heavy Metal Wastewater Treatment and Reuse Engineering & Technology of Hubei Province,College of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

AbstractA high-efficiency phosphate-accumulating bacterium strain named AP06 was isolated from phosphorite wastewater . The strain was identified according to its physiological and biochemical characteristics, and its 16S rDNA sequence. The biological phosphorus removal characteristics of this strain were also studied. The results showed that the strain was identified asAeromonassobria. The phosphorus effect was best with removal rate of 86.1% when pH of the fermentation medium was 7, culture temperature was 30 ℃, KH2PO4was used as phosphorus source, and the inoculum concentration was 7%(V/V).

Keywordsisolation; phosphate-accumulating bacterium; anaerobic-anoxic condition；identification

收稿日期2014-03-14

作者簡(jiǎn)介何冬蘭(1964-)，女，教授，研究方向：資源微生物，E-mail:hdl@mail.scuec.edu.cn

基金項(xiàng)目湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(BZZ11003);中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(CZW15054)

中圖分類號(hào)Q28； Q291

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1672-4321(2016)02-0023-03