許　穎，石　嬌，吳東明，周曉萍

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科(成都　610500)

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唾液中差異性蛋白在2型糖尿病早期診斷中的臨床研究*

許穎，石嬌，吳東明，周曉萍

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科(成都610500)

【摘要】目的探討唾液中的胱抑素C(Cys-C)、α2-巨球蛋白(α2-MG)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT)及轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)在2型糖尿病早期診斷中的臨床意義及運(yùn)用。方法選取體檢正常人群38例(正常組)，空腹血糖升高患者23例(IFG組)，糖耐量患者31例(IGT組)及2型糖尿病患者86例(2-DM組)，通過免疫印跡檢測(cè)4組人群唾液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR蛋白的表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。同時(shí)通過ELISA方法對(duì)唾液及血液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR進(jìn)行定量分析后研究其相關(guān)性。同時(shí)，根據(jù)ELISA定量結(jié)果對(duì)Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR繪制ROC曲線，確定各指標(biāo)檢測(cè)的特異性和靈敏度。結(jié)果免疫印跡條帶進(jìn)行半定量及ELISA定量檢測(cè)均表明2-DM組患者唾液中Cys-C、α2-MG、A1AT明顯上調(diào)，而TTR蛋白無明顯變化。唾液及血液中Cys-C、α2-MG、 A1AT及TTR呈正相關(guān)，且唾液中Cys-C、α2-MG與血液中血糖濃度呈正相關(guān)。ROC曲線表明唾液中Cys-C、α2-MG可作為2-DM早期診斷標(biāo)志物。結(jié)論通過唾液中Cys-C、α2-MG的檢測(cè)，可在2-DM早期進(jìn)行篩查，并在糖尿病早期予以干預(yù)治療，具有潛在的臨床運(yùn)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】2型糖尿病；唾液；胱抑素C；α2-巨球蛋白；α1-抗胰蛋白酶；轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白

糖尿病是一組以血糖水平增高為特征的代謝性疾病，長期存在的高血糖導(dǎo)致機(jī)體各種組織器官(尤其是眼、腎、心臟、血管和神經(jīng)等)出現(xiàn)慢性損害、功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。近年來，隨著人口老齡化及生活水平的提高，糖尿病發(fā)病呈逐漸增長的趨勢(shì)且趨于年輕化[1]。據(jù)WHO估計(jì)，全球目前有超過2億的糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2025年將增至4億。我國現(xiàn)有糖尿病患者超過4千萬，居世界第2位[2]。糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第3大非傳染性疾病，其已逐漸成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題[3]。糖尿病患者需進(jìn)行日常血糖含量的監(jiān)測(cè)，目前主要采用指尖血血糖試紙條法，但該方法痛苦且增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，獲取簡(jiǎn)單快速且無創(chuàng)傷的檢測(cè)方法對(duì)糖尿病的早期診斷和日常監(jiān)測(cè)具有重要的研究意義。研究[4-5]表明，2型糖尿病(2-DM)患者從血糖升高或糖耐量異常到出現(xiàn)糖尿病的臨床癥狀平均時(shí)間可長達(dá)7年。因此，2-DM早期進(jìn)行診斷可顯著提高患者的治療效果和生存質(zhì)量。唾液的臨床診斷價(jià)值逐漸被人們認(rèn)識(shí)，在唾液中已經(jīng)鑒定出多個(gè)與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)[6]，同時(shí)，唾液標(biāo)本用于糖尿病的檢測(cè)簡(jiǎn)單快速且無創(chuàng)傷。本研究擬探討唾液中與糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的胱抑素C(Cys-C)、α2-巨球蛋白(α2-MG)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT)及轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)在糖尿病早期診斷中的意義及運(yùn)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

根據(jù)WHO糖尿病專家委員會(huì)提出的病因?qū)W分型標(biāo)準(zhǔn)(1999)對(duì)經(jīng)過OGTT檢查試驗(yàn)的患者進(jìn)行分類篩選后確定?？崭寡巧?IFG)患者：5.6 mmol/L<空腹血糖<7.0 mmol/L；糖耐量(IGT)患者：7.8 mmol/L<餐后2 h血糖<11.1 mmol/L；2-DM患者為多次診斷均為空腹血糖達(dá)到7.0 mmol/L或任意時(shí)刻血糖達(dá)到11.1 mmol/L。選取成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2015年6-10月住院糖尿病患者86例(2-DM組)，IFG患者23例(IFG組)，IGT患者31例(IGT組)及體檢正常人群38例(正常組)，均排除各種急慢性腎病、肝病及自身免疫性疾病等。正常組：男16例，女22例，年齡(54.0±3.0)歲；IFG組：男10例，女13例,年齡(51.0±4.0)歲；IGT組：男14例，女17例，年齡(55.0±5.0)歲；2-DM組： 男40例，女46例，年齡(50.0±2.0)歲。各組性別、年齡基本相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。血糖濃度、肝功能、腎功能及血常規(guī)等臨床標(biāo)本指標(biāo)數(shù)據(jù)見表1。本研究經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本的采集與處理

受試者空腹8～10 h后，于次日清晨清水漱口后，頭部向前傾斜，采用唾液收集專用管抵住舌頭前沿，收集自然分泌的唾液，以唾液量>1.5 mL為宜。將收集到的唾液冰上儲(chǔ)存運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室后立即4 ℃ 16 000 g離心10 min，吸取上清液，-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。同時(shí)，使用真空肝素鋰采血管采集受試者外周血4 mL，混勻后室溫靜置30 min后，3 000 g離心5 min，收集上層血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3Western Blotting檢測(cè)唾液中差異性蛋白

通過Western Blotting檢測(cè)唾液中Cys-C、α2-MG、 A1AT及TTR蛋白的表達(dá)水平，amylase作為唾液的內(nèi)參蛋白進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)收集備用的唾液上清液進(jìn)行冰上復(fù)融后，于4 ℃ 16 000 g離心10 min后，采用BCA法進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量，調(diào)整蛋白濃度至4 μg/uL，再通過Western Blotting進(jìn)行唾液蛋白含量檢測(cè)。蛋白定量后，加入一定量的5×上樣buffer，100 ℃煮沸5 min，使蛋白充分變性；根據(jù)待檢測(cè)蛋白質(zhì)的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Cys-C及TTR選擇濃度為15%的分離膠；α2-MG及A1AT選擇濃度為12%的分離膠)，每個(gè)加樣孔中上樣40 μg蛋白，電泳2 h左右，待測(cè)蛋白分離開后，開始轉(zhuǎn)膜；電泳后將凝膠取出，浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，濾紙浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，PVDF膜在100%甲醇中浸泡30～60 s；自電極板陰極到陽極方向，按照三層濾紙-膠-PVDF膜-三層濾紙的順序放置好轉(zhuǎn)膜裝置。去除各層之間的氣泡，100 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)具體的蛋白分子大小確定( Cys-C及TTR轉(zhuǎn)膜30 min；A1AT轉(zhuǎn)膜1 h；α2-MG轉(zhuǎn)膜2 h)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置入封閉液(5%脫脂奶粉)，室溫下振搖封閉2 h。然后加入相應(yīng)一抗(Cys-C：12245-1-AP；α2-MG：13545-1-AP；A1AT：16382-1-AP及TTR：11891-1-AP)(購自武漢三鷹)，4 ℃孵育14～16 h；取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，15 min/次。 加入HRP標(biāo)記二抗，37 ℃振搖1 h；用TBST洗滌3次，15 min/次，滴加發(fā)光底物，暗室曝光。

膠片經(jīng)掃描后，Image J2x軟件用于Western Blotting條帶的半定量分析。統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad 5.0軟件完成。

1.4ELISA法檢測(cè)唾液中差異性蛋白

用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Cys-C：BC013083；α2-MG：BC040071；A1AT：BC015642及TTR：BC020791)(購自武漢三鷹)及患者唾液標(biāo)本，加100 μL/孔到96孔酶標(biāo)板，4 ℃放置14～16 h。第2天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150 μL 1% BSA 37 ℃封閉1 h。 PBST洗滌3次后，每孔加入100 μL相應(yīng)的抗體(1∶5 000稀釋)(Cys-C：12245-1-AP；α2-MG：13545-1-AP；A1AT：16382-1-AP及TTR：11891-1-AP)(購自武漢三鷹)，37 ℃孵育2 h。PBST洗滌5次后，加入100 μL稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標(biāo)儀上讀取A405 nm吸收值。 用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品及其相應(yīng)吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行唾液蛋白含量的檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1唾液中差異性蛋白Cys-C及α2-MG與糖尿病早期病變的相關(guān)性

通過對(duì)糖尿病患者及早期病變?nèi)巳旱耐僖褐蠧ys-C、α2-MG、A1AT及TTR進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，唾液中Cys-C及α2-MG隨著病情的加劇，其表達(dá)量明顯上調(diào)，A1AT輕微上調(diào)。TTR無明顯改變(圖1A)。通過對(duì)Western Blotting條帶的半定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著病情的加劇，α2-MG(P<0.001)、Cys-C(P<0.001)和A1AT(P=0.018)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TTR無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.072)(圖1B)。

圖1唾液中差異性蛋白Western Blotting檢測(cè)及半定量分析比較

注：A：正常組、IFG組、IGT組及2-DM組唾液中，Cys-C、α2-MG、 A1AT及TTR的表達(dá)情況；B：對(duì)圖1A中Western Blotting條帶運(yùn)用Image J2x軟件進(jìn)行半定量分析

2.2唾液標(biāo)本與相應(yīng)血液標(biāo)本中Cys-C及α2-MG的相關(guān)性

通過對(duì)糖尿病患者及早期病變?nèi)巳旱耐僖杭把褐蠧ys-C、α2-MG、A1AT及TTR水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，唾液中Cys-C、α2-MG及A1AT的含量均隨著糖尿病病程明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P=0.003，P=0.021)，而TTR在糖尿病病程中無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)，且唾液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR均與血液中相應(yīng)蛋白的表達(dá)呈相關(guān)性(Cys-C：rs=1.000，P=0.038；α2-MG：rs=1.000，P=0.025；A1AT：rs=1.000，P=0.033；TTR：rs=1.000，P=0.045)，但其水平明顯低于血液中的含量(圖2～3)。同時(shí)，唾液中Cys-C、α2-MG均與患者血液中血糖濃度呈正相關(guān)(Cys-C：rs=1.000，P=0.034；α2-MG：rs=1.000，P=0.043)(圖4)。

圖24組唾液中差異性蛋白的ELISA定量檢測(cè)比較

圖34組血液中差異性蛋白的ELISA定量檢測(cè)比較

圖44組唾液中Cys-C、α2-MG與血液中血糖濃度的相關(guān)性比較

注：血糖濃度單位為mmol/L，Cys-C、α2-MG濃度單位為mg/L

2.3唾液差異性蛋白Cys-C及α2-MG用于糖尿病早期診斷效果的評(píng)價(jià)

唾液中Cys-C檢測(cè)糖尿病早期IFG及IGT的曲線下面積為0.925，P=0.029；α2-MG相應(yīng)的曲線下面積為0.960，P=0.021；A1AT曲線下面積為0.674，P=0.056；TTR曲線下面積為0.600，P=0.061(圖5)。表明Cys-C及α2-MG可用作糖尿病的早期檢測(cè)，而A1AT及TTR的診斷意義不佳。

圖5唾液中差異性蛋白用于檢測(cè)糖尿病早期IFG及IGT的ROC曲線比較

3討論

目前，2-DM的發(fā)病機(jī)制在蛋白質(zhì)翻譯、翻譯后修飾、靶細(xì)胞中的信號(hào)傳遞及代謝途徑調(diào)節(jié)等遺傳和基因組學(xué)方面已有充足的研究。基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)應(yīng)用于糖尿病的研究中，使糖尿病相關(guān)生物標(biāo)志物的研究飛速發(fā)展[7-8]，而對(duì)于易于取得的唾液中蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也取得良好的結(jié)果[9]?；谕僖簶?biāo)本的糖尿病檢測(cè)可顯著減輕糖尿病患者的物理性創(chuàng)傷，適用于其早期診斷和長期療效監(jiān)測(cè)。

Cys-C是半胱氨酸抑制劑蛋白質(zhì)中的一種，無組織特異性，不受年齡、性別、體質(zhì)量和炎癥等外來因素的影響，能在所有有核細(xì)胞內(nèi)以恒定速度持續(xù)表達(dá)[10]。糖尿病常伴隨慢性腎損傷，Cys-C可作為腎性糖尿病的早期診斷標(biāo)志。大量研究表明血清中Cys-C可作為糖尿病發(fā)生及病情監(jiān)控的分子指標(biāo)，具有良好的臨床運(yùn)用價(jià)值[11- 12]。本研究發(fā)現(xiàn)唾液中Cys-C的含量與血清中Cys-C含量呈正相關(guān)，且在2-DM早期糖耐量受損中明顯升高，可作為2-DM發(fā)生的早期診斷標(biāo)志物。

α2-MG是相對(duì)分子質(zhì)量最大的蛋白質(zhì)，能與蛋白水解酶結(jié)合而影響酶的活性，進(jìn)而選擇性保護(hù)某些蛋白酶活性[13]。已有研究[14- 15]表明，血清中α2-MG、A1AT與糖尿病發(fā)生過程密切相關(guān)，可作為糖尿病診斷的生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，唾液中α2-MG、A1AT的含量均與血清中α2-MG、A1AT的含量及血糖濃度呈相關(guān)性，ROC曲線表明唾液中A1AT的診斷特異性與靈敏度不佳，故而，α2-MG可作為有效的2-DM生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，TTR在2-DM早期糖耐量受損過程中，唾液及血液中含量較之正常組均無明顯變化[16]。已有研究[17]表明，TTR可作為2-DM心血管疾病發(fā)生的診斷指標(biāo)。在1-DM中，血清中TTR較之正常人群也有明顯的升高。表明TTR可能在1-DM或2-DM后期導(dǎo)致的心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析中具有一定的診斷價(jià)值。

綜上所述，本研究通過對(duì)唾液及血液中Cys-C、α2-MG、A1AT和TTR蛋白的檢測(cè)，表明上述蛋白在患者唾液標(biāo)本與血液標(biāo)本中均呈正相關(guān)，且唾液中Cys-C及α2-MG可作為糖尿病發(fā)病早期的有效診斷標(biāo)志物。同時(shí)，本研究所采用的唾液檢測(cè)方法，可無創(chuàng)、安全的對(duì)患者進(jìn)行多次檢測(cè)，該方法有望成為糖尿病早期檢測(cè)及日常療效動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的新趨勢(shì)。

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Clinical Study on Different Proteins in Saliva for Early Diagnosis of Type 2 Diabetes

XuYing,ShiJiao,WuDongming,ZhouXiaoping.

DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

【Key words】Type 2 diabetes; Saliva; Cystatin C; alpha-2 macroglobulin; Alpha-1 antitrypsin; Transthyretin

【Abstract】ObjectiveTo study the clinical significance and application of Cys C, α2-MG, A1AT and TTR in saliva for early diagnosis of type 2 diabetes. MethodsThe protein expressions of Cys C, α2-MG, A1AT and TTR in the saliva of 38 normal cases, 23 patients with IFG, 31 patients with IGT and 96 patients with type 2 diabetes were tested by Western-blotting analysis and the proteins were semi-quantitatively analyzed. At the same time, CysC, α2-MG, A1AT and TTR in saliva and serum were detected by ELISA for quantitative analysis and further correlation study. ROC curves of Cys C, α2-MG, A1AT and TTR were drawn according to the quantitative results of ELISA and the specificity and sensitivity of each detection were determined. ResultsThere were significant increase in Cys C, α2-MG and A1AT, but no significant changes in TTR protein in saliva of patients with type 2 diabetes according to the results of Western-blotting test and ELISA detection. Cys-C,α2-MG, A1AT and TTR in saliva and serum were positively correlated with each other, and Cys-C and α2-MG in saliva were positively correlated with blood glucose concentration. ROC curves showed that Cys C and α2-MG in saliva could be used as early diagnostic markers of type 2 diabetes. ConclusionThe detection of Cys C and α2-MG in saliva has potential clinical significance in the early screening of Type 2 diabetes and clinical value in preventing and treating diabetes in the early stage.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.003

*基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(No:140019)；四川省2014年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)資金資助

【中圖分類號(hào)】R587.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160607.1058.002.html

·論著·