王冬冬，張　毅，侯廣宇，劉永舉，劉　朔，蔣文明，李金平，于建敏，范丹丹，陳文雅，王守春，尹燕博*，陳繼明*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266109；4.青島澳蘭百特生物工程有限公司，青島 266101)

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2010
—2014年山東H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及HA和NA基因序列分析

王冬冬1，2，張毅2，侯廣宇2，劉永舉3，劉朔2，蔣文明2，李金平2，于建敏2，范丹丹1，陳文雅4，王守春4，尹燕博1*，陳繼明2*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266109；4.青島澳蘭百特生物工程有限公司，青島 266101)

摘要：旨在了解山東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒(AIV)的流行和遺傳變異情況，為該地區(qū)H9N2亞型禽流感的防制提供依據(jù)。通過雞胚接種的方法從山東省分離到1 296株H9N2 AIV，并選取40株對其進(jìn)行HA和NA基因的擴(kuò)增、測序及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，2013年H9N2 AIV的分離率最高，達(dá)42.30%；40株病毒的HA和NA的核苷酸序列同源性及推導(dǎo)的氨基酸相似性均在90%以上；HA裂解位點(diǎn)序列為PSRSSR↓GLF，NA頸部缺失3個(gè)氨基酸；HA和NA均存在糖基化位點(diǎn)的缺失和新的糖基化位點(diǎn)出現(xiàn)；大部分毒株發(fā)生了易于感染人型受體的突變；演化分析表明40株病毒的HA和NA基因均屬于Y280-like亞分支。結(jié)果提示，H9N2 AIV在山東省各地區(qū)普遍流行且在2013年達(dá)到高峰，所有毒株均符合低致病性禽流感病毒的分子特征，并且具有結(jié)合哺乳動物唾液腺受體的能力，因此應(yīng)密切關(guān)注H9N2病原出現(xiàn)的新變化，制定相應(yīng)的防控措施。

關(guān)鍵詞：H9N2；禽流感病毒；HA；NA；序列分析

禽流感(avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的禽類的一種傳染病。AIV亞型眾多，其中H9N2 AIV自1994年由陳伯倫等首次從中國大陸分離至今，已在我國持續(xù)流行，且宿主范圍廣泛，包括雞、鴨、珍珠雞、鵪鶉等[1]。H9N2 AIV已成為制約養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要因素，是我國現(xiàn)有AIV的主要亞型[2]。

AIV基因組分為8節(jié)段，至少翻譯11種蛋白質(zhì)，其中HA和NA為兩種主要的表面糖蛋白，在流感病毒致病力、宿主特異性等方面起重要作用[3-10]。HA基因和NA基因的變異性強(qiáng)，是導(dǎo)致病毒抗原變異的主要原因，最能反映流感病毒的變異程度。因此監(jiān)測HA與NA基因的進(jìn)化，調(diào)查HA與NA基因的變異情況至關(guān)重要。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病料和雞胚病料來源于2010—2014年山東部分地區(qū)送檢的病雞或病變的肺、氣管等組織；SPF雞胚購自山東SPF雞實(shí)驗(yàn)種雞場，由本實(shí)驗(yàn)室孵化至10日齡。

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)抗原和陽性血清AIV、新城疫病毒(NDV)等抗血清由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心饋贈。

1.1.3主要試劑RNAiso Plus試劑、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit(cat.#RR055A)購自寶生物工程(大連)有限公司；無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純。1.1.4引物設(shè)計(jì)與合成HA、NA基因全長擴(kuò)增引物參考E.Hoffmann等[10]的研究，引物序列見表1；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.1.5主要生物學(xué)軟件Lasergene 7軟件包 (DNASTAR，Madison，WI，USA)，MEGA 6軟件(http：//www.megasoftware.net/)，在線工具BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，在線工具NetNGlyc 1.0 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。

表1HA和NA全長基因擴(kuò)增引物

Table 1Primer set used for RT-PCR amplification ofHAandNAgene

基因Gene引物序列Primer(5'-3')產(chǎn)物長度/bpExpectedsizeHAF:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGR:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT1778+29NAF:TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTR:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT1413+29

1.2病毒分離與鑒定

將樣品除菌后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚分離病毒，每天觀察雞胚存活情況，并于72 h無菌收獲雞胚尿囊液，放至-80 ℃冰箱備用。收獲的尿囊液經(jīng)血凝(HA)、血凝抑制(HI)以及RT-PCR檢測鑒定。在所分離鑒定的H9N2 AIV中，每年選取8株(共計(jì)40株)不同地區(qū)的病毒進(jìn)行HA和NA基因全長的測序分析。

1.3核酸提取及擴(kuò)增

核酸提取參考RNAiso Plus試劑說明書進(jìn)行。核酸樣品凍存于-80 ℃冰箱備用。參考PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit說明書進(jìn)行HA和NA基因全長的擴(kuò)增。

1.4基因序列分析

基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。并通過測序峰圖及序列比對分析排除由RT-PCR擴(kuò)增引起的突變。使用SeqMan等軟件對測序獲得的序列進(jìn)行處理，使用EditSeq軟件進(jìn)行核苷酸翻譯，使用MegAlign計(jì)算核酸及蛋白質(zhì)序列的同源性，通過在線軟件NetNGlyc 1.0 Server進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測。

1.5系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank下載已報(bào)道的9株H9N2 AIV的HA和NA的基因序列作為參考，使用最大似然法(maximum likelihood)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹前，使用MEGA 6中的Muscle程序?qū)湫蛄谢诿艽a子(codons)方式進(jìn)行多重序列比對，利用Find Best DNA Models選擇最優(yōu)化的核苷酸替換模型，并參照BIC(Bayesian information criterion)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，自舉值(bootstrap)設(shè)置為1 000。

2結(jié)果

2.1病毒的分離鑒定

2010—2014年間，本實(shí)驗(yàn)室共檢測病料5 629份(2010年1 055份，2011年2 177份，2012年737份，2013年688份，2014年972份)，通過雞胚接種分離到H9N2 AIV 1 296株(2010年223株，2011年476株，2012年161株，2013年291株，2014年145株)，H9N2 AIV的年分離率分別為21.14%、21.86%、21.85%、42.30%和14.92%，每年各月份的病毒分離情況如圖1所示。

圖1　2010—2014年H9N2亞型禽流感病毒分離率Fig.1　Isolation rates of H9N2 avian influenza viruses during 2010-2014

2.2基因序列分析

將挑選的40株H9N2 AIV進(jìn)行HA和NA基因的擴(kuò)增和測序。序列分析顯示，HA基因的核苷酸相似性為92.60%～100%，推導(dǎo)的氨基酸相似性為94.86%～100%；僅C/SD/LX294/10毒株在HA蛋白裂解位點(diǎn)序?yàn)镻SRSSR↓GIF，其余毒株均為PSRSSR↓GLF；C/SD/PL135/13毒株和C/SD/LY554/10毒株在HA蛋白的145 aa處出現(xiàn)一個(gè)新的糖基化位點(diǎn)，C/SD/PL135/13毒株在313 aa和218 aa處各缺失1個(gè)糖基化位點(diǎn)，有7株病毒(C/SD/YT818/14、C/SD/WF631/14、C/SD/ZC635/13、C/SD/WF345/12、C/SD/LX242/12、C/SD/GM814/12和C/SD/LC750/13)在HA蛋白的218 aa處缺失1個(gè)糖基化位點(diǎn)；C/SD/PL135/13毒株在HA核苷酸序列的703—705位缺失3個(gè)堿基；測序毒株均有Q226L、S138A、I155T和H183N突變，90.0%(36/40)的毒株存在T160A突變，87.5%(35/40)的毒株存在A190V突變，這些位點(diǎn)的突變均與唾液腺受體結(jié)合特異性相關(guān)[1]。NA基因的核苷酸相似性為91.10%～100%，推導(dǎo)的氨基酸相似性為91.96%～100%；測序毒株均在NA蛋白的63—65 aa處缺失3個(gè)氨基酸；C/SD/PL135/13在NA蛋白143 aa處出現(xiàn)一新糖基化位點(diǎn)，C/SD/LX823/14毒株在234 aa處缺失1個(gè)糖基化位點(diǎn)。

2.3HA和NA基因進(jìn)化分析

應(yīng)用MEGA 6中Find Best DNA Models選擇最優(yōu)化的HA和NA基因核苷酸替換模型分別為HKY+G+I和TN92+G+I，根據(jù)模型將參考序列與所測序列構(gòu)建最大似然樹(圖2)。40株病毒的HA基因?qū)儆跉W亞系C/BJ/1/94分支，并且與D/HK/Y280/97的相似性達(dá)89.05%以上，屬于Y280分支；NA基因同樣屬于C/BJ/1/94分支，與D/HK/Y280/97的相似性達(dá)90.77%以上，屬于Y280分支。

圖2　HA與NA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2　Phylogenic tree of HA and NA gene

3討論

通過本實(shí)驗(yàn)室對山東地區(qū)送檢病料的H9N2 AIV分離情況可以看出，山東地區(qū)H9N2 AIV普遍流行，并在2013年達(dá)到峰值；病毒在春冬季節(jié)分離率較高，但在較少報(bào)道流感發(fā)生的溫暖月份(7—9月)也有病毒的分離。

基因序列分析顯示，絕大多數(shù)毒株的HA裂解位點(diǎn)為PSRSSR↓GLF，屬于低致病性毒株的特征。40株病毒的NA蛋白頸部均缺失3個(gè)氨基酸，這會增強(qiáng)NA蛋白酶的活性以及從紅細(xì)胞釋放的能力，同時(shí)NA頸部缺失的條件下，HA蛋白序列的316 aa處(即裂解位點(diǎn)前第5個(gè)氨基酸)A→S的突變可增強(qiáng)HA的裂解效率[3]。2株病毒在HA蛋白145 aa出現(xiàn)S→N的突變，造成145—147 aa多出1個(gè)糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的出現(xiàn)使得毒株的毒力增強(qiáng)和免疫原性的改變[4]。40株病毒蛋白質(zhì)序列均存在與唾液腺受體結(jié)合特異性相關(guān)位點(diǎn)的突變，顯示與哺乳動物唾液腺受體結(jié)合增強(qiáng)的特點(diǎn)，這類毒株的流行在公共衛(wèi)生上值得關(guān)注。關(guān)于HA基因的核苷酸序列在703—705處缺失3個(gè)堿基是否影響毒株生物學(xué)性狀等還需進(jìn)一步研究。

HA和NA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，病毒在不斷進(jìn)化，幾乎每年都形成小的亞分支，但仍屬BJ/94-like分支中的Y280-like亞分支，與國內(nèi)其他學(xué)者的研究報(bào)道相一致，提示山東省H9N2 AIV可能處于一個(gè)比較穩(wěn)定的遺傳進(jìn)化過程。

H9N2 AIV不僅在家禽中廣泛流行，且已通過多種變異機(jī)制獲得對新宿主適應(yīng)能力，可感染鼠、豬、犬等哺乳動物以及人類，對公共衛(wèi)生健康構(gòu)成巨大威脅。H9N2 AIV為H5N1、H7N9、H10N8等造成人類死亡的流感病毒提供內(nèi)部基因，提示加強(qiáng)對H9N2 AIV的監(jiān)測顯得尤為重要。

4結(jié)論

山東省各地區(qū)普遍流行H9N2 AIV，并且在2013年達(dá)到高峰。40株病毒蛋白質(zhì)序列均顯示與哺乳動物唾液腺受體結(jié)合增強(qiáng)的特點(diǎn)，但HA蛋白裂解位點(diǎn)序列仍符合低致病性禽流感病毒的分子特征。山東省H9N2 AIV在不斷進(jìn)化，但仍屬于Y280-like亞分支，處于比較穩(wěn)定的遺傳進(jìn)化過程。

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(編輯白永平)

Virus Isolation and Genetic Analysis of HA and NA Genes of H9N2 AIVs Isolated from Shandong Province from 2010 to 2014

WANG Dong-dong1，2，ZHANG Yi2，HOU Guang-yu2，LIU Yong-ju3，LIU Shuo2，JIANG Wen-ming2，LI Jin-ping2，YU Jian-min2，F(xiàn)AN Dan-dan1，CHEN Wen-ya4，WANG Shou-chun4，YIN Yan-bo1*，CHEN Ji-ming2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266019，China；2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China；3.CollegeofLifeScience，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266019，China；4.QingdaoOland-BetterBioengineeringCo.，LTD.，Qingdao266101，China)

Abstract:In order to explore the epidemiological and genetic character of the H9N2 viruses，a long-term surveillance have been conducted in Shandong province.One thousand two hundred and ninety six strains of H9N2 virus were isolated from clinical samples，which were collected in chicken farms and LBMs，and theHAandNAgenes of 40 strains selected were amplified and sequenced.TheHAandNAgenes of these viruses shared more than 90% identity at the nucleotide level and amino acid level；most viruses carried the amino acid sequence PSRSSR↓GLF at the HA cleavage site and a 3-amino-acid deletion in the NA stalk；new potential N-glycosylation sites were found in the HA and NA in some viruses；the Q226L (H3 numbering) mutation was detected in all viruses at the receptor-binding pocket of HA；phylogenetic analysis showed that the HA and NA belong to the Y280-like sublineage.The H9N2 influenza virus was widely circulating in poultry farms of Shandong province，and reached peak in 2013；all of isolates preferentially bound to the human-like receptor，but still have the characteristic of low-pathogenic AIV.So，keeping monitoring and controlling H9N2 virus is necessary.

Key words:H9N2；avian influenza virus；HA；NA；sequences analysis

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.027

收稿日期：2015-09-30

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31272535)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-13-011-03)

作者簡介：王冬冬(1990-)，男，山東安丘人，碩士，獸醫(yī)師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail: wdd20093246@163.com *通信作者：尹燕博，E-mail: yanboyin2011@163.com；陳繼明，E-mail: chenjiming@cahec.com

中圖分類號：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0852-05