葛　琳，郭大偉，何　方，黃金虎，王麗平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

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PmrA-PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)介導(dǎo)大腸桿菌對黏桿菌素耐藥的機(jī)制研究

葛琳，郭大偉，何方，黃金虎，王麗平*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

摘要：已報(bào)道PmrA-PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)在革蘭陰性菌對多黏菌素B耐藥過程中起重要作用，基于此認(rèn)識，作者擬從基因突變和mRNA表達(dá)兩個(gè)方面探討PmrA-PmrB介導(dǎo)大腸桿菌對黏桿菌素耐藥的可能性。首先檢測了臨床分離的52株禽致病性大腸桿菌對黏桿菌素的敏感性，篩選出耐藥菌株；然后采用step-wise方法對黏桿菌素敏感菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得人工誘導(dǎo)的耐藥菌株；最后通過PCR擴(kuò)增所有耐藥菌株的pmrA-pmrB后采用Mega軟件進(jìn)行突變位點(diǎn)分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測所有耐藥菌株中pmrA-pmrB的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，擬闡明PmrA-PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌黏桿菌素耐藥性產(chǎn)生的作用。MIC結(jié)果顯示，52株大腸桿菌中，雖然大多數(shù)菌株(88.5%，46/52)仍對黏桿菌素敏感，但也分離到少數(shù)耐藥菌株(為11.5%)。突變位點(diǎn)分析表明人工誘導(dǎo)成功的5株耐藥菌(9R、36R、53R、91R和107R)pmrA未發(fā)生突變，而pmrB均有不同程度的突變，其中耐藥菌株9R、36R和53R各在G55A (G19R)、T500C(L167P)和T263A(V88E)發(fā)生點(diǎn)突變，而91R和107R在229位和478位各插入長為30和189 bp的序列。但臨床分離的6株耐藥菌株(MIC=4～8 μg·mL-1)的pmrA-pmrB均未發(fā)生突變。qRT-PCR結(jié)果顯示發(fā)生點(diǎn)突變的三株人工誘導(dǎo)耐藥菌pmrA-pmrB轉(zhuǎn)錄量均極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)上升，發(fā)生插入突變的兩株耐藥菌pmrA-pmrB轉(zhuǎn)錄量雖有上升趨勢，但變化不顯著(P>0.05)，而臨床耐藥菌株(n=6)的pmrA-pmrB轉(zhuǎn)錄量均無變化。進(jìn)一步檢測人工誘導(dǎo)不同MIC的耐藥菌株中pmrA-pmrB的突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)菌株MIC達(dá)16 μg·mL-1時(shí)pmrA-pmrB才會發(fā)生突變。PmrA和PmrB介導(dǎo)了大腸桿菌對黏桿菌素的高度耐藥，其中PmrB的點(diǎn)突變伴隨PmrA-PmrB的高表達(dá)或者PmrB的組氨酸激酶-腺苷酰環(huán)化酶-甲基結(jié)合蛋白-磷酸化酶(HAMP)結(jié)構(gòu)域的插入突變是導(dǎo)致禽致病性大腸桿菌對黏桿菌素高度耐藥的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：黏桿菌素耐藥；大腸桿菌；pmrA-pmrB；突變

多黏菌素 E (polymyxin E) 又稱黏桿菌素(colistin)，是Bacilluspolymyxinvar.colistinus代謝產(chǎn)生的堿性多肽類抗生素，含有酰胺鍵與脂肪酸相連組成的陽離子環(huán)[1]。黏桿菌素主要通過與細(xì)菌的外膜脂多糖結(jié)合，改變細(xì)胞膜穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致細(xì)菌破裂死亡，故對革蘭陰性桿菌有強(qiáng)烈的抑菌作用[2]。2006—2009年，人類腸道菌群的流行病學(xué)檢測已有證據(jù)顯示鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯桿菌對黏桿菌素的耐藥率分別維持在0.9%、1.5%和0.4%，大腸桿菌耐藥率維持在0.2%，其中大腸桿菌對頭孢類、環(huán)丙沙星等藥物耐藥率均已達(dá)到20%以上[3]。由于多藥耐藥大腸桿菌感染廣泛流行，后續(xù)又缺乏有效的抗生素，所以多黏菌素類抗生素作為革蘭陰性桿菌感染治療的最后一道防線已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床，但目前在臨床中已分離到其耐藥菌株[4-5]。

二元調(diào)控系統(tǒng)可作為原核生物應(yīng)答外界環(huán)境的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。典型的二元調(diào)控系統(tǒng)由組氨酸激酶和相關(guān)的應(yīng)答調(diào)控蛋白組成，組氨酸激酶感受外界環(huán)境變化后調(diào)節(jié)應(yīng)答蛋白的磷酸化水平，而后對一系列應(yīng)答基因進(jìn)行調(diào)控[7]。目前發(fā)現(xiàn)PmrA-PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)參與銅綠假單胞菌和克雷伯桿菌對多肽菌素B和抗菌肽的耐藥性調(diào)節(jié)[8]。S.M.Moskowitz等[9]發(fā)現(xiàn)多黏菌素B耐藥菌株中存在pmrA-pmrB基因的突變，該突變有利于pmrB感受器激酶磷酸化，進(jìn)而激活pmrA，介導(dǎo)細(xì)菌對多黏菌素B的耐藥。已經(jīng)有研究證實(shí)二元調(diào)控系統(tǒng)元件發(fā)生突變可以使其過表達(dá)，導(dǎo)致arnBCADTEF基因激活，轉(zhuǎn)錄翻譯出4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N)或煙酸季戊四醇酯(PEtN)，添加到細(xì)菌外膜的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)上，降低細(xì)菌對多黏菌素的吸附[10-12]。K.Nishino等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的二元調(diào)控系統(tǒng)過表達(dá)還可引起eygA等基因的表達(dá)變化，介導(dǎo)大腸桿菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。pmr作為多黏菌素耐藥相關(guān)基因，可以通過促進(jìn)LPS共價(jià)修飾，減少藥物與革蘭陰性菌的接觸，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[15]。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在低Mg2+環(huán)境下，PhoP-PhoQ和PmrA-PmrB可以導(dǎo)致銅綠假單胞菌對黏桿菌素耐藥[16]。

本試驗(yàn)借鑒鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌的研究成果，充分論證該研究的可行性后，以臨床分離的52株禽致病性大腸桿菌為研究對象，通過MIC測定、誘導(dǎo)耐藥菌、檢測分析相關(guān)基因突變位點(diǎn)以及mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化，明確PmrA-PmrB在禽致病性大腸桿菌對黏桿菌素耐藥中的作用，進(jìn)一步為大腸桿菌耐藥性的分子流行病學(xué)調(diào)查和發(fā)掘新的藥物靶位提供參考，進(jìn)而探索阻遏細(xì)菌耐藥性上升趨勢的合理策略。

1材料與方法

1.1試劑

Solution I，pMD-19T載體；2×Prime STAR GXL DNA Polymerse Mix；DL2000 marker購自上海皓嘉生物科技有限公司；Trizol，2×Taq MasterMix，SYBY Green real-time PCR Master Mix購自南京鐘鼎生物科技有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)，dNTP，RNAse inhibitor，Random primer，瓊脂糖，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自南京生興生物科技有限公司；無水乙醇，異丙醇，氯仿購自南京壽德有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒為AXYGEN生物公司提供。

1.2菌株

52株大腸桿菌，2014年1—12月分離自江蘇5個(gè)不同的發(fā)病鴨場，經(jīng)鑒定后保存于本實(shí)驗(yàn)室。所有相關(guān)菌株均挑取單菌落于LB肉湯，37 ℃ 150 r·min-1震蕩培養(yǎng)16 h后用于試驗(yàn)。

1.3MIC測定

根據(jù)美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會推薦的肉湯二倍稀釋法測定52株禽致病性大腸桿菌對黏桿菌素的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(EUCAST)[17]規(guī)定的耐藥性折點(diǎn)分析菌株的耐藥性。

女人來得最晚，被介紹的時(shí)候，坐正首的一個(gè)黑臉男人笑著說知道她。女人很驚詫，說您是哪位呀，怎么知道我？女人以為這個(gè)男人曾經(jīng)是她的患者也說不定，就沒在意?？赡侨私又f我叫田連民，道外區(qū)的稅收員。

1.4耐藥株體外誘導(dǎo)

根據(jù)上述已測定的MIC值，選擇9、36、53、91和107 號(表1)敏感菌株進(jìn)行體外誘導(dǎo)試驗(yàn)。采用step-wise方法，以1/2×MIC，2×MIC，4×MIC，8×MIC依次類推的藥物梯度逐步誘導(dǎo)敏感菌株，實(shí)時(shí)監(jiān)測MIC變化情況直至其耐藥。取各親本菌株不同MIC值(8、16、64和≥256 μg·mL-1)的耐藥菌株在無藥平板上連續(xù)傳代，直至其耐藥性穩(wěn)定，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1試驗(yàn)所用引物序列

Table 1Primers used in this study

相關(guān)引物Relatedprimer引物序列(5'-3')Sequence退火溫度/℃Annealedtemperature產(chǎn)物長度/bpProductlengthPCR引物(PrimersforPCR)pmrA-FpmrA-RATGAAAATTCTGATTGTTGAAGACGTTAGTTTTCCTCATTCGCGACC64669pmrB-FpmrB-RATGCATTTTCTGCGCCGACTTATATCTGGTTTGCCACGTACTGA641092RT-PCR引物(PrimersforRT-PCR)pmrA-FpmrA-RCCTTTTGCGCTGGAAGAGTTCTTTGGGCGTCAGAATCAAC59158pmrB-FpmrB-RCTGCAAGAAGATGACGGAGCCTGTGTAATGCGGCTGACAA59156dnaE-FdnaE-RGGACATGAGCACCGAAGATTGGAAGCCCATCTGGTTGATA59161

1.5突變位點(diǎn)檢測

PCR擴(kuò)增所有耐藥菌株的pmrA-pmrB(引物由蘇州金唯智生物有限公司合成，見表1)，產(chǎn)物純化后連接pMD-19T載體并轉(zhuǎn)化DH5α進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選擇插入條帶正確的菌液送樣測序。所測得的基因序列均采用MEGA軟件進(jìn)行突變位點(diǎn)分析，并上傳GenBank獲取相應(yīng)的基因序列號。

1.6qRT-PCR檢測pmrA和pmrB轉(zhuǎn)錄水平

提取各臨床分離耐藥菌株、誘導(dǎo)耐藥菌株及其相應(yīng)親本菌株的總RNA，Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別以pmrA和pmrB為模板設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，以大腸桿菌看家基因dnaE為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(引物見表1 所示)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1MIC測定及耐藥菌體外誘導(dǎo)

臨床分離各菌株的MIC見表2所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)可知，本次所分離的禽致病性大腸桿菌對黏桿菌素大多數(shù)呈敏感(88.5%)，但也分離到6株低度耐藥菌株(1、3、12、38、54和94號)，占分離菌株的11.5%。

根據(jù)已測定菌株的MIC值，選取5株敏感菌株(9、36、53、91和107號)采用黏桿菌素進(jìn)行耐藥性誘導(dǎo)，篩選到不同程度的黏桿菌素耐藥菌株(表3)，選取MIC分別為8、16、64和≥ 256μg·ml-1的耐藥菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

表2黏桿菌素對臨床分離大腸桿菌的最小抑菌濃度

Table 2MICs of colistin againstE.colistrains isolated from diseased ducks

菌株StrainsMIC/(μg·mL-1)菌株StrainsMIC/(μg·mL-1)菌株StrainsMIC/(μg·mL-1)菌株StrainsMIC/(μg·mL-1)18250.5531772382725448024129<0.55618225<0.533<0.557186171350.558<0.5870.59136159188111238861289112439263291113240165292216<0.546<0.5690.5931180.547172194420248174210712225117611151

2.2pmrA和pmrB突變位點(diǎn)分析

通過PCR擴(kuò)增所有耐藥菌株和部分敏感菌株的二元調(diào)控系統(tǒng)pmrA和pmrB基因，并采用MEGA2.0軟件分析了所有菌株的pmrA和pmrB基因序列。表3結(jié)果表明：臨床分離的低度耐藥菌株的pmrA和pmrB均未發(fā)生突變；所有人工誘導(dǎo)耐藥菌株的pmrA無突變，但部分耐藥菌株pmrB則發(fā)生不同位點(diǎn)突變。所檢測到的耐藥菌株pmrB突變情況分為兩種：即3株敏感菌9、36和53菌株所產(chǎn)生的部分耐藥菌分別在55位、500位和263位發(fā)生點(diǎn)突變使之氨基酸發(fā)生相應(yīng)變化，而另2株敏感菌91和107菌株所產(chǎn)生的部分耐藥菌則分別在229位和478位發(fā)生插入突變，91R插入序列重復(fù)了親本株pmrB208—237位之間的序列，107R插入序列重復(fù)了親本株pmrB289—477位之間的序列，并且結(jié)果顯示，所有人工誘導(dǎo)耐藥菌株的MIC值達(dá)到16 μg·mL-1以上時(shí)，pmrB基因才會發(fā)生突變。以上所有測序基因的序列均已上傳至GenBank并獲得序列號。

2.3誘導(dǎo)耐藥菌及臨床耐藥菌pmrA和pmrBmRNA轉(zhuǎn)錄變化

如圖1所示，36、53和9號菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥菌株MIC達(dá)到16 μg·mL-1以上時(shí)，pmrAmRNA的轉(zhuǎn)錄量都呈極顯著上升(P<0.01)，并且各耐藥菌株隨MIC升高，其轉(zhuǎn)錄量也呈上升趨勢。91和107號菌株所產(chǎn)生的耐藥菌株即使MIC大于256 μg·mL-1，pmrA的mRNA轉(zhuǎn)錄量也未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

圖2結(jié)果顯示，9、53 和36 號菌誘導(dǎo)所產(chǎn)生的耐藥菌株在MIC達(dá)16 μg·mL-1以上時(shí)，pmrB轉(zhuǎn)錄量呈極顯著(9R2、9R4和53R2、53R4，P<0.01)或顯著(36R2、36R4，P<0.05) 上升；但是91號和107號菌株產(chǎn)生的所有耐藥菌pmrB轉(zhuǎn)錄量雖有上升趨勢，但均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

圖3結(jié)果顯示，與敏感株相比，臨床分離耐藥菌株的pmrA、pmrB轉(zhuǎn)錄量均無顯著變化(P>0.05)。

表3耐藥大腸桿菌的pmrB突變位點(diǎn)

Table 3pmrBmutations in colistin resistance strains

菌株StrainsMIC/(μg·mL-1)突變位點(diǎn)Mutations菌株StrainsMIC/(μg·mL-1)突變位點(diǎn)Mutations9(親本株)9(parentalstrain)1-91(親本株)91(parentalstrain)1-9R18-91R18-9R216G55A(G19R)91R216229位插入30bp9R364G55A(G19R)91R364229位插入30bp9R4≥256G55A(G19R)91R4≥256229位插入30bp36(親本株)36(parentalstrain)1-107(親本株)107(parentalstrain)1-36R18-107R18-36R216T500C(L167P)107R216478位插入189bp36R364T500C(L167P)107R364478位插入189bp36R4≥256T500C(L167P)107R4≥256478位插入189bp53(親本株)53(parentalstrain)1-臨床分離的耐藥菌株clinicalresistantstrains53R18-18-53R216T263A(V88E)38-53R364T263A(V88E)388-53R4≥256T263A(V88E)124-544-944-

“-”表示無任何突變位點(diǎn)

“-” means no mutations

R1.MIC=8 μg·mL-1；R2.MIC=16 μg·mL-1；R4.MIC≥256 μg·mL-1；**.P<0.01圖1　各耐藥菌株pmrA轉(zhuǎn)錄量變化Fig.1　Changes of pmrA mRNA transcription levels in resistance strains

R1.MIC=8 μg·mL-1；R2.MIC=16 μg·mL-1；R4.MIC≥256 μg·mL-1；*.P<0.05；**.P<0.01圖2　各耐藥菌株pmrB轉(zhuǎn)錄量變化Fig.2　Changes of pmrB mRNA transcription levels in resistance strains

圖3　臨床耐藥菌株pmrA-pmrB轉(zhuǎn)錄量變化Fig.3　Changes of pmrA-pmrB mRNA transcription levels in resistance strains

3討論

多黏菌素對生長繁殖期與靜止期細(xì)菌均有殺菌作用，最早在20世紀(jì)60年代用于革蘭陰性菌感染，80年代后由于其腎毒性而逐漸被棄用[2]。近年來，由于多藥耐藥革蘭陰性菌感染廣泛流行，多黏菌素作為治療的最后選擇又被應(yīng)用于臨床[18]。黏桿菌素也是獸醫(yī)臨床常用的多肽類抗生素，本研究結(jié)果顯示臨床分離致病性大腸桿菌對黏桿菌素的耐藥率相對較低，與A.C.Gales等[3]對革蘭陰性菌的調(diào)查結(jié)果相一致，表明黏桿菌素在臨床治療大腸桿菌時(shí)仍有一定優(yōu)勢，尤其對其他抗菌藥耐藥的大腸桿菌仍有較好效果。雖然如此，本試驗(yàn)中也分離到對黏桿菌素低度耐藥的禽致病性大腸桿菌，應(yīng)引起重視。

現(xiàn)已報(bào)道鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的多黏菌素耐藥菌株，其耐藥機(jī)制分別與lpxA、lpxC、lpxD突變以及二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP-PhoQ和PmrA-PmrB的調(diào)控有關(guān)[19-20]。A.Quesada等[21]初步研究豬源和禽源大腸桿菌與沙門菌對黏桿菌素的耐藥機(jī)制，發(fā)現(xiàn)耐藥菌的PmrA/PmrB發(fā)生突變，證實(shí)PmrA S39I、R81S和PmrB V161G突變與菌株對黏桿菌素的耐藥存在相關(guān)性。除此以外未見有關(guān)大腸桿菌對黏桿菌素耐藥機(jī)制的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)參考已報(bào)道的有關(guān)黏桿菌素耐藥的相關(guān)基因，首先檢測了各誘導(dǎo)耐藥菌株lpxA、lpxC、lpxD基因是否發(fā)生突變及其在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化，但未檢測到該類基因的任何變化，因此推測二元調(diào)控系統(tǒng)PmrA-PmrB在大腸桿菌對黏桿菌素耐藥中產(chǎn)生作用，故本試驗(yàn)從突變位點(diǎn)分析和轉(zhuǎn)錄水平檢測這兩個(gè)方面探討二元調(diào)控系統(tǒng)PmrA-PmrB在大腸桿菌對黏桿菌素耐藥中的作用。PmrA-PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)中，pmrB基因的HATPase結(jié)構(gòu)域(762—1 059位)提供能量將hisKA結(jié)構(gòu)域(432—594位)上的組氨酸His (456位) 磷酸化，進(jìn)而將信號傳遞給pmrA，從而起到調(diào)控基因表達(dá)的作用。此外，HAMP結(jié)構(gòu)域(207—408位)編碼組氨酸激酶及磷酸酶類，并含有甲基化結(jié)合位點(diǎn)。突變位點(diǎn)分析顯示，人工誘導(dǎo)耐藥株的pmrB序列均存在突變現(xiàn)象，如91R耐藥菌的HAMP結(jié)構(gòu)域(207—408位)的229位插入的30 bp序列；53R菌株的(T263A)突變，使得第89位氨基酸由纈氨酸變?yōu)楣劝彼?，該突變位點(diǎn)也位于HAMP結(jié)構(gòu)域(207—408)；107R耐藥菌在478位插入的189 bp序列，該位點(diǎn)處于hisKA結(jié)構(gòu)域(432—594位)中，臨近磷酸化位點(diǎn)(456位)和HAMP結(jié)構(gòu)域(207—408位)；36R耐藥菌在500位發(fā)生點(diǎn)突變(T500C)，該突變位點(diǎn)與J.Y.Lee等[20]在克雷伯桿菌與銅綠假單胞菌中證實(shí)的與黏桿菌素耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)相同，同樣位于pmrB的hisKA結(jié)構(gòu)域(432—594位)內(nèi)；9R(G55A)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致第19位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?，位于TM1結(jié)構(gòu)域(39—105位)，該結(jié)構(gòu)域?yàn)榭缒まD(zhuǎn)運(yùn)區(qū)。已有研究表明pmrB上的HATPase結(jié)構(gòu)域(762—1 059位)提供能量將hisKA結(jié)構(gòu)域(432—594位)上的組氨酸His(456位) 磷酸化，進(jìn)而將信號傳遞給pmrA從而起到調(diào)控基因表達(dá)的作用[22]。A.O.Olaitan等[23]的研究結(jié)果也證實(shí)HAMP結(jié)構(gòu)域發(fā)生點(diǎn)突變、缺失或移碼都能導(dǎo)致對多黏菌素耐藥。還有結(jié)果證實(shí)多黏菌素B耐藥菌株中存在pmrA-pmrB基因的突變，該突變有利于pmrB感受器激酶磷酸化，進(jìn)而激活pmrA，使其表達(dá)量上升，介導(dǎo)細(xì)菌對黏桿菌素的耐藥[9]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)生點(diǎn)突變3株耐藥菌的pmrA-pmrB轉(zhuǎn)錄量均極顯著(P<0.01)或顯著上升(P<0.05)上升，并且隨著耐藥菌MIC升高，轉(zhuǎn)錄量也逐漸升高，但是發(fā)生插入突變的兩株耐藥菌的pmrA-pmrB轉(zhuǎn)錄量雖有上升趨勢，但變化不顯著 (P>0.05)，這兩類耐藥菌之間差異的原因值得進(jìn)一步系統(tǒng)研究。同時(shí)人工誘導(dǎo)耐藥大腸桿菌對多黏菌素產(chǎn)生高度耐藥時(shí)(MIC至少高于16 μg·mL-1)其pmrB才會發(fā)生突變，進(jìn)而導(dǎo)致pmrA-pmrBmRNA轉(zhuǎn)錄顯著上升，該現(xiàn)象解釋了臨床分離的耐藥菌株(MIC=8 μg·mL-1)為何未檢測到pmrA-pmrB突變和mRNA轉(zhuǎn)錄量變化，由此可見大腸桿菌對黏桿菌素仍存在其他耐藥機(jī)制，有待依次揭示。

綜上所述，pmrA和pmrB在大腸桿菌對黏桿菌素的耐藥中起一定作用，pmrB的點(diǎn)突變伴隨pmrA-pmrB的高表達(dá)或者pmrBHAMP結(jié)構(gòu)域的插入突變是導(dǎo)致大腸桿菌對黏桿菌素高度耐藥的機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)(References)：

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(編輯白永平)

Resistance Mechanism of Escherichia coli to Colistin Mediated by PmrA-PmrB

GE Lin，GUO Da-wei，HE Fang，HUANG Jin-hu，WANG Li-ping*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

Abstract:It has been recently reported that PmrA-PmrB are associated with polymyxin B resistance.To determine whether PmrA-PmrB is contributing to colistin resistance inE.coli，we investigated amino acid alterations and transcription level ofpmrA-pmrBin colistin resistance strains.All clinical resistance isolated strains were screened for colistin resistance by using MIC determinations and step-wise method was used to induce colistin resistant strains.pmrA-pmrBgenes were amplified by PCR from resistant strain and their sequences were characterized by Mega software.Simultaneously，expression levels of PmrA-PmrB were detected by quantitive Real-time PCR.MIC (minimum inhibitory concentration) results showed that 88.5% of 52 clinic resistance strains tested in this study were susceptibility to colistin and 11.5% of the strains were resistant.Five mutations were identified inpmrBin induced colistin-resistant mutants 9R (G55A)，36R (T500C)，53R (T263A)，91R (insertion of 30 bp at position of 229) and 107R (insertion of 189 bp at position of 478).However，six clinical resistance isolates (MIC=4-8 μg·mL-1) did not show any mutations inpmrA-pmrB.Further study showed thatpmrA-Bexpression levels were significantly activated in three lab-derived colistin resistant strains with point mutations ofpmrB.The expression level ofpmrA-pmrBgenes tended to increase but not significant changed in resistant strains with insertion mutations compared with its correspond parent strains.The transcription level ofpmrA-pmrBin 6 clinical resistance isolates remained unchanged compared with susceptible strains.In addition，when MICs were over than 16 μg·mL-1，mutations inpmrA-pmrBwould occur.Mutations inpmrBor high expression levels inpmrA-pmrBcontribute to high-level colistin resistance inE.colistrains.

Key words:colistin resistance；Escherichiacoli；pmrA-pmrB；mutations

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.022

收稿日期：2015-11-09

基金項(xiàng)目：江蘇省自然基金(BK2012771)；江蘇省高校"青藍(lán)工程"中青年學(xué)術(shù)帶頭人項(xiàng)目

作者簡介：葛琳(1989-)，女，安徽淮北人，碩士，主要從事細(xì)菌耐藥性的研究， E-mail:760135099@qq.com *通信作者：王麗平，E-mail:wlp71@163.com

中圖分類號：S859.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0812-08