丁 寧，邱景劍，王定友，李劭恒，張 云，李 坤

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

丁 寧，邱景劍，王定友，李劭恒，張 云，李 坤

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建人核糖核酸酶抑制因子穩(wěn)定干涉載體pLKO.1-dsRI，為后續(xù)觀測人核糖核酸酶抑制因子干涉載體的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響奠定基礎(chǔ)。用亞克隆法,將針對(duì)人核糖核酸酶抑制因子的干涉片段從 Simple T-dsRI質(zhì)?？寺〉絧LK-0.1-TRC質(zhì)粒,用酶切法篩選得到陽性重組質(zhì)粒pLKO.1-dsRI，用測序法鑒定克隆序列正確。轉(zhuǎn)染時(shí)設(shè)干擾組、空載體組和空白組三組，每組三次重復(fù)。用脂質(zhì)體CellfectinR將pLKO.1-dsRI（干擾組）、pLKO.1-TRC（空載體組）轉(zhuǎn)染進(jìn)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞中，未處理的細(xì)胞作空白組。轉(zhuǎn)染后72hr用Western blotting檢測細(xì)胞中核糖核酸酶抑制因子表達(dá)的變化。雙酶切鑒定及測序鑒定結(jié)果均正確；Western blotting結(jié)果表明，對(duì)比空白組（1.1578±0.015）和空載體組（1.1216±0.027），干擾組RI表達(dá)（0.6119±0.048）明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)果表明人核糖核酸酶抑制因子干涉載體pLKO.1-dsRNH1構(gòu)建成功。

人核糖核酸酶抑制因子；siRNA；慢病毒載體

人核糖核酸酶抑制因子（human ribonuclease inhibitor，hRI）是一種廣泛存在于細(xì)胞的可溶性酸性糖蛋白，分子量為50kD，能緊密結(jié)合血管形成因子（Angionenin,Ang）[1,2]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RI可能有效地抑制腫瘤誘導(dǎo)血管生成[3,4]。因此人們推測hRI可能為抗腫瘤血管活性的抑制基因，有望應(yīng)用于腫瘤的基因治療中。以往的工作將靶向RI基因構(gòu)建于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，但是該載體在分裂不活躍的細(xì)胞中如神經(jīng)元細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率較低，因而本研究構(gòu)建了RNA干擾人RI基因的慢病毒載體，旨在利用RNAi技術(shù)沉默分裂不活躍的細(xì)胞中的RI基因，為下一步深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

慢轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLKO.1-TRC（圖1）、E.coli DH5α由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存；針對(duì)人核糖核酸酶抑制因子siRNA表達(dá)載體Simple T-dsRI由大連Takara生物公司構(gòu)建[3]。限制性內(nèi)切酶EcoR1、DNA Marker、T4DNA連接酶購自TaKaRa；限制性內(nèi)切酶Age1購自NEB；DNA快速凝膠產(chǎn)物回收試劑盒購自博大泰克公司；瓊脂糖、氨芐青霉素和鏈霉素購自華美生物公司；LB培養(yǎng)基購自Invitrogen/GIBCO。

圖1 pLKO.1質(zhì)粒圖譜

1.2 方法

1.2.1 重組載體pLK0.1-dsRI的的構(gòu)建、鑒定及測序

質(zhì)粒 pLK0.1-TRC經(jīng) Agel單酶切、Klenow Fragment和dNTP補(bǔ)平后，用乙醇沉淀法回收得到約7.1 kb的pLKO.1-TRC的線性大片段，再用EcoRⅠ酶切，經(jīng)瓊脂糖電泳回收，得到約7 kb的一端平頭、一端黏性的線性載體大片段。針對(duì)人核糖核酸酶抑制因子的siRNA表達(dá)載體Simple T-dsRI質(zhì)粒用SmaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，經(jīng)2%瓊脂糖電泳回收，獲得約84bp目的片斷（dsRI）。將線性載體片段與目的片段用T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化，涂布于氨芐青霉素抗性平板，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和NcoⅠ進(jìn)行雙酶切pLK0.1-dsRI，篩選得到正向連接的陽性克隆。

1.2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞在含100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。按4×104個(gè)/孔將細(xì)胞鋪板于24孔板，至60%～70%匯片時(shí)，按CellfectinR說明書轉(zhuǎn)染，分為3組：正常細(xì)胞組（空白組）、pLKO.1-dsRI（干擾組）、pLKO.1-TRC（空載體組），2個(gè)平行復(fù)孔。每組質(zhì)粒共用0.8μg、脂質(zhì)體2μL。轉(zhuǎn)染后24 h，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 hrs后收獲。

1.2.3 Western blotting檢測核糖核酸酶抑制因子的表達(dá)

各組取60 μg總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜、RI一抗（1:1000稀釋）過夜，然后再用HRP標(biāo)記的二抗IgG（1:2000稀釋）室溫反應(yīng)1～2 h。用ECL發(fā)光試劑盒反應(yīng)液發(fā)光。曝光時(shí)間30 s～5 min。由Bio-Rad凝膠成像儀攝取凝膠圖像，用Image LAbTM軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組載體pLK0.1-dsRI的構(gòu)建

質(zhì)粒dsRI-T Simple為本實(shí)驗(yàn)室以往構(gòu)建的克隆載體，長約3042 bp，經(jīng)SmaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到約 2.7 Kb和 84 bp兩條帶（圖 2）。質(zhì)粒pLK0.1-TRC經(jīng)Agel單酶切和Klenow Fragment和dNTP補(bǔ)平后，獲得約8.9 kb的線性載體大片段（圖2）；再用EcoRⅠ單酶切后，得到7 Kb和2 Kb兩條帶（圖3），然后切膠回收7 Kb條帶（圖4）。

圖2 質(zhì)粒pKD-dsRI-T Simple的雙酶切和質(zhì)粒pLKO.1-TRC用AgeⅠ單酶切/Klenow補(bǔ)平電泳圖

圖3 EocRⅠ酶切經(jīng)Klenow補(bǔ)平的pLKO.1-TRCF片段凝膠電泳圖

圖4 回收約7 kb的片段凝膠電泳圖

2.2 質(zhì)粒酶切鑒定

質(zhì)粒pLK0.1-dsRI分別用EcoRⅠ和NcoⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測到大小約為5000 bp和1900 bp兩條片段，與預(yù)期結(jié)果符合，表明酶切正確（見圖5）。

圖5 質(zhì)粒pLKO.1-dsRI雙酶切凝膠電泳圖

2.3 Western blotting檢測核糖核酸酶抑制因子的表達(dá)

Western blotting顯示，與空白組和空載體組對(duì)比，干擾組中hri基因被顯著下調(diào)（P<0.05），抑制率大于60%：空白組的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為1.1578±0.015，空載體的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為1.1216±0.027，干擾組的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度為0.6119±0.048?？梢?，hri基因在蛋白水平上被沉默（見圖6）。

圖6 Western blotting檢測HepG2細(xì)胞中hRI的表達(dá)

3 討論

人核糖核酸酶抑制因子是體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)。其一級(jí)結(jié)構(gòu)富含亮氨酸和大量的游離巰基[9]，空間結(jié)構(gòu)由富含亮氨酸殘基重復(fù)區(qū)（Leucin-rich reapeat，LRR）的α/β螺旋折疊結(jié)構(gòu)重復(fù)多次形成的彎曲的馬蹄形結(jié)構(gòu)。而含有這樣重復(fù)順序的一百多種蛋白質(zhì)顯示了廣泛的功能，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用等。且游離巰基是RI保持活性的必要因素[10-13]。因此，RI功能是多方面的。

本研究旨在成功構(gòu)建人核糖核酸酶抑制因子干涉載體pLKO.1-dsRI。本研究所選載體為一種慢病毒表達(dá)載體，其優(yōu)點(diǎn)是能夠感染多種難感染的細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，干細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞等，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。而且慢病毒能夠?qū)⑼庠椿虿迦爰?xì)胞基因組內(nèi)，既可轉(zhuǎn)染分裂期活躍的細(xì)胞，也可轉(zhuǎn)染分裂緩慢或處于分裂終末期的細(xì)胞[14,15]，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示產(chǎn)物都位于約192 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相符；再用EcoRⅠ和NcoⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳條帶顯示：一條在2 kb，另一條在5 kb，與理論值相符；同時(shí)將質(zhì)粒送寶生物測序，各項(xiàng)結(jié)果共同顯示慢病毒pLKO.1-dsRI載體構(gòu)建成功。

本研究成功構(gòu)建了人核糖核酸酶抑制因子干涉載體pLKO.1-dsRI，其能在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)，這為后續(xù)觀測人核糖核酸酶抑制因子干涉載體的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and Identification of Human Ribonuclease Inhibitor siRNA Lentiviral Vector

DING Ning,QIU Jing-jian,WANG Ding-you,LI Shao-heng,ZHANG Yun,LI Kun
(College of Medicine,Dalian University,Dalian 116622,China)

To construct the interference expression vector of human ribonuclease inhibitor pLKO.1-dsRI which express in tumor cells can lay the foundation for the subsequent observations.The purpose fragments of dsRI from the plasmid of Simple T-dsRI was subcloned into the lentiviral vector of pLKO.1-TRC.The vector was identified by enzyme digested.And then the shRNA-RI lentiviral vector of pLKO.1-dsRNH1 transfected into HepG2 cells with CellfectinR,using the cells transfected with empty vector of pLKO.1-TRC as blank groups and those untransfected cells as controls.After72hrs,the silencing effect of the siRNA plasmid was identified by Western blotting on the HepG2 cells.Restriction enzyme digestion proved that the construction of the retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene was correct.Western blotting showed that the expression of hRI were significantly reduced in the cells transfected with shRNA-hRI retroviral vector as compared with the blank and the empty vector group,and the ratio value of hri/β-actin is 0.6119±0.048 vs 1.1578±0.015,1.1216±0.027（P<0.05）.The human ribonuclease inhibitor interference vector pLKO.1-dsRI was constructed successfully.

Human ribonuclease inhibitor;siRNA;lentiviral vector

Q782

：A

：1008-2395(2016)06-0062-04

2016-10-31

大連大學(xué)本科生創(chuàng)新課題（2015125）；大連大學(xué)本科生創(chuàng)新課題。

丁寧(1977-)，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。