崔有為，林小媛，冀思遠(yuǎn)，施云鵬（北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京 100124）

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SRT對(duì)富集高聚PHA能力嗜鹽MMC的影響

崔有為，林小媛，冀思遠(yuǎn)，施云鵬
（北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京 100124）

摘要：調(diào)控菌群富集過(guò)程的工藝參數(shù)，富集具有高PHA積累能力的混合菌（MMC）是發(fā)酵生產(chǎn)PHA的第一步也是最重要的一步。采用批式培養(yǎng)條件，集中研究了污泥停留時(shí)間（SRT）對(duì)PHA積累菌群的富集作用。研究結(jié)果表明SRT影響富集MMC的底物降解速率（qS），微生物積累PHA的速率（qP）和PHA積累能力。長(zhǎng)SRT（SRT= 4 d）導(dǎo)致了較低的qS，qP和PHA細(xì)胞含量；過(guò)短的SRT（SRT= 1 d）則降低了MMC的PHA轉(zhuǎn)化率（YPHA/S）和PHA積累能力，刺激了非PHA積累菌群的快速增殖。研究確定的最佳SRT為2 d，在此條件下富集的MMC最大PHA積累量可達(dá)細(xì)胞干重的56%。研究證明了SRT在選擇嗜鹽MMC中的重要作用，為快速富集PHA積累能力MMC奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：SRT；PHA積累菌；聚合物；發(fā)酵；生物工程

2015-11-02收到初稿，2016-02-29收到修改稿。

聯(lián)系人及第一作者：崔有為（1977—），男，博士，副教授。

Received date: 2015-11-02.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (51478011, 51178004), the Natural Science Foundation of Beijing (8132013) and the Importation and Development of High-Caliber Talents Project of Beijing Municipal Institutions.

引　言

嗜鹽微生物是一類(lèi)分布廣泛的極端微生物。自從有生命現(xiàn)象以來(lái)，嗜鹽微生物在地球生物圈中已存在，適應(yīng)了地球早期極其惡劣的環(huán)境條件生存下來(lái)并在長(zhǎng)期的進(jìn)化和演化中形成了普通微生物沒(méi)有的生物特性。這些特性使得嗜鹽微生物在環(huán)境治理[1]、生物制藥、生物能源以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都有潛在的應(yīng)用[2-3]。作為重要的生物特性之一，研究發(fā)現(xiàn)很多嗜鹽菌可以積累高含量的聚羥基脂肪酸酯（PHA）。利用嗜鹽微生物生產(chǎn)PHA的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)為[4]：①嗜鹽微生物具有積累高含量PHA和特殊PHA組分的能力；②高鹽環(huán)境限制了其他非嗜鹽微生物的生長(zhǎng)，可以省略嚴(yán)格的滅菌程序；③嗜鹽微生物胞內(nèi)積累的PHA在淡水環(huán)境很容易通過(guò)溶胞釋放，便于下游回收PHA。這些優(yōu)勢(shì)對(duì)降低PHA生產(chǎn)成本具有重要的意義。很多淡水微生物發(fā)酵生產(chǎn)PHA的研究者認(rèn)為以混合菌（MMC）代替商業(yè)用的純菌（PC）作為發(fā)酵主體生產(chǎn)PHA會(huì)進(jìn)一步降低PC發(fā)酵過(guò)程中的滅菌工藝成本。而且對(duì)利用可再生碳源（淀粉，木質(zhì)素，小麥稈，半纖維素）、工業(yè)副產(chǎn)品（糖蜜，乳漿，麥糠）和廢水（生活廢水和工業(yè)廢水等）具有優(yōu)勢(shì)。MMC替代PC可以減少PHA生產(chǎn)成本近50%[5]。但是，由于嗜鹽微生物生產(chǎn)PHA的研究較晚，嗜鹽MMC合成PHA的研究未見(jiàn)報(bào)道。

目前，以MMC生產(chǎn)PHA普遍采用兩步法或者三步法工藝。這些工藝中提高M(jìn)MC積累PHA能力（包括存儲(chǔ)能力和容積產(chǎn)率）的關(guān)鍵在于通過(guò)施加選擇條件富集能夠積累PHA的菌種。在此基礎(chǔ)上，利用富集的MMC發(fā)酵生產(chǎn)PHA。為此，富集高積累PHA能力的MMC是工藝的基礎(chǔ)。富集PHA積累MMC的被廣泛接受的是好氧瞬時(shí)進(jìn)料工藝（ADF）[6]。在這個(gè)工藝中通過(guò)交替的盛宴期和饑餓期富集具有PHA積累能力的菌群，淘汰非PHA積累的菌群[7]。污泥停留時(shí)間（SRT）決定了微生物的世代更替，世代周期長(zhǎng)于SRT的微生物被淘汰出富集系統(tǒng)。另外，不同的SRT導(dǎo)致體系平衡生物量的不同，最終直接影響ADF的工藝選擇壓，即盛宴期/饑餓期（feast time /famine time, F/F）[8]。從這個(gè)意義上講，SRT是決定富集的MMC種群結(jié)構(gòu)的重要因素?；贏DF成功富集的案例中普遍采用較短的SRT[SRT =水力停留時(shí)間（HRT）]。Albuquerque等[9]和Johnson等[10]采用SRT= 1d成功富集了高積累PHA能力的淡水MMC。研究認(rèn)為較低的SRT會(huì)使富集體系的平衡污泥濃度處于較低的水平，這樣體系當(dāng)中的微生物有機(jī)會(huì)攝取更多的底物來(lái)合成PHA，提供給PHA積累菌群更多競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。Serafim等[11]和Marang等[12]認(rèn)為較短的SRT不利于PHA的合成和產(chǎn)PHA菌群的富集。較短的SRT會(huì)導(dǎo)致相對(duì)較長(zhǎng)的盛宴期，由于細(xì)胞的中間代謝產(chǎn)物諸如乙酰CoA轉(zhuǎn)化為PHA這一反應(yīng)的平衡常數(shù)要遠(yuǎn)小于其流向同化作用的平衡常數(shù)，因此，較長(zhǎng)的盛宴期會(huì)使細(xì)胞的同化響應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢(shì)[8]。這些研究結(jié)論針對(duì)的對(duì)象都是淡水MMC，嗜鹽MMC還未見(jiàn)報(bào)道。

基于以上分析，本文接種入海口底泥作為嗜鹽接種物以糖蜜酒精廢水作為底物研究了不同SRT對(duì)富集嗜鹽PHA積累能力MMC的影響。

1　材料和方法

1.1糖蜜酒精廢水

本研究采用的糖蜜酒精廢水參考Barrocal等[13]報(bào)道配制。配水濃縮液的碳源成分濃度分別為：乳酸鈉 194 ml·L?1，丙三醇 66.4 ml·L?1，葡萄糖9.82 g·L?1，乙酸鈉 19.4 g·L?1，進(jìn)水底物濃度為600 mg COD·L?1。以NH4Cl、KH2PO4濃縮液?jiǎn)为?dú)配制作為氮源和磷源。為了控制糖蜜酒精廢水中COD:N:P為100:5:1，每個(gè)SBR周期的投加的氮磷量按實(shí)驗(yàn)所需計(jì)算后投加。其他營(yíng)養(yǎng)元素和微量組成包括：KCl 4.97 mg·L?1，CaCl222.2 mg·L?1，MnCl2·4H2O 5.0 mg·L?1，F(xiàn)eSO4·6H2O 5.0 mg·L?1，MgSO4·7H2O 10.0 mg·L?1，CuSO4·5H2O 0.05 mg·L?1。在底物中加入0.02 g·L?1硫脲以抑制硝化作用。底物中鹽度（NaCl鹽）穩(wěn)定在50 g·L?1，為嗜鹽微生物提供高鹽生存環(huán)境，同時(shí)抑制非嗜鹽菌的生長(zhǎng)。

1.2選擇富集過(guò)程

實(shí)驗(yàn)接種的嗜鹽污泥來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)展的嗜鹽污泥。該嗜鹽污泥采自入?？诘啄?。采集的底泥經(jīng)過(guò)去除泥沙并清洗后接種在SBR反應(yīng)器內(nèi)，采集過(guò)程和處理見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。利用此接種污泥，在小試SBR系統(tǒng)內(nèi)，以實(shí)際生活污水為碳源發(fā)展成具有脫氮能力的嗜鹽活性污泥[14]。接種運(yùn)行穩(wěn)定的嗜鹽污泥到富集SBR系統(tǒng)中，接種的污泥濃度約為3000 mg·L?1。以人工配制的糖蜜酒精廢水為底物，采用ADF工藝進(jìn)行富集選擇。富集SBR總體積為6 L，有效容積為4 L。每個(gè)運(yùn)行周期包括：進(jìn)水0.5 h，曝氣12 h，沉淀1 h，排水0.5 h。在排水階段排掉2 L上清液，系統(tǒng)的沖排比為0.5。在曝氣末期進(jìn)行混合液的排出，分別控制SRT為2 d（phase 1，每次排出1/4泥水混合液），4 d（phase 2，每次排出1/8泥水混合液）和1 d（phase 3，每次排出1/2泥水混合液）。在每個(gè)階段運(yùn)行至少24個(gè)SRT以上，在穩(wěn)定后進(jìn)行下一個(gè)階段的轉(zhuǎn)化。反應(yīng)過(guò)程中溫度控制在（25±1）℃，DO≥1 mg·L?1，整個(gè)周期反應(yīng)過(guò)程中pH均在7～9之間。富集過(guò)程中詳細(xì)運(yùn)行參數(shù)如表1所示。

表1　SBR周期運(yùn)行參數(shù)Table 1　Operational parameters of SBR

1.3Pulse-fed實(shí)驗(yàn)確定最大PHA積累能力

為了確定不同SRT選擇富集MMC的最大PHA生產(chǎn)能力，采集每個(gè)階段富集穩(wěn)定后期的MMC用于pulse-fed實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)接種的污泥濃度為1200～1500 mg·L?1，以發(fā)酵復(fù)合糖蜜酒精廢水進(jìn)行PHA積累實(shí)驗(yàn)。為保證每次投加碳源足夠微生物積累PHA所用，將pulse-fed實(shí)驗(yàn)每次投加的糖蜜酒精廢水中的碳源濃度提升到900 mg COD·L?1，COD:P仍為100:1，其他營(yíng)養(yǎng)元素和微量組成不變。此外，發(fā)酵底物中不加氮源從而抑制微生物的增殖促進(jìn)PHA的積累。底物投加依據(jù)發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)的DO的躍升點(diǎn)作為指示進(jìn)行（WTW Multi 3420，德國(guó)）[7]。即在發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)DO的躍升點(diǎn)作為指示盛宴期是否結(jié)束的信號(hào)。一旦DO迅速躍升至平臺(tái)段，表明盛宴期結(jié)束，開(kāi)始進(jìn)行下一次的進(jìn)料。以此連續(xù)進(jìn)料，直到細(xì)胞內(nèi)的PHA含量不再增加，底物不再降解為止。

1.4PHA的提取和測(cè)定

PHA含量在樣本經(jīng)過(guò)前處理后采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行氣相色譜（Agilent 7890A氣相色譜儀）分析[15]。樣品前處理具體操作過(guò)程為：取45 ml左右的污泥混合液，離心分離后棄去上清液，向其中加入2 ml次氯酸鈉溶液以使微生物失活，使用蒸餾水清洗污泥樣品2～3次，主要去除污泥中的鹽分；將離心清洗后得到的污泥沉淀物置于冰箱?20℃中冷凍，冷凍后置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得到凍干的污泥樣品。稱取凍干后的污泥干樣品約25 mg于具塞玻璃管中，依次加入2 ml氯仿和2 ml苯甲酸鈉溶液，隨后在105℃烘箱中消解20 h；消解后的樣品，加入1 ml去離子水搖勻、離心，取1.6 ml下層有機(jī)相于2 ml塑料離心管中，離心管中盛有0.5 g左右無(wú)水硫酸鈉，以便進(jìn)一步去除殘留水分的影響，搖勻后以8000 r·min?1的轉(zhuǎn)速離心5 min，隨后取1 ml上層有機(jī)相到氣相瓶中于氣相色譜儀上進(jìn)行色譜分析。

1.5生物過(guò)程評(píng)價(jià)

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中pH、DO采用便攜式測(cè)定儀測(cè)定（WTW Multi3420，德國(guó)）。鹽度采用鹽度測(cè)定儀（GMK 510，韓國(guó)）測(cè)定。NH+4-N、COD、MLSS等常規(guī)的化學(xué)測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)方法[16]。采用蒸餾水反復(fù)沖洗濾紙方式避免MLSS測(cè)定過(guò)程中鹽度的干擾。

1.6參數(shù)計(jì)算

F/F是盛宴期與饑餓期時(shí)間長(zhǎng)度的比值。表觀動(dòng)力學(xué)計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[17]。

PHA轉(zhuǎn)化率

PHA 比合成速率

底物比吸收速率

生物質(zhì)轉(zhuǎn)化率

其中，Tfeast為盛宴期時(shí)間，h；PHA0為初始細(xì)胞內(nèi)的PHA含量，mg·L?1；PHAf為盛宴期末期細(xì)胞內(nèi)的PHA含量，mg·L?1；S0為初始COD濃度，mg·L?1；Sf為盛宴期末期COD濃度，mg·L?1；Xa為反應(yīng)器中平均生物量，mg·L?1。

2　結(jié)果與討論

2.1富集過(guò)程分析

接種河口底泥在SBR中實(shí)施了3個(gè)不同的SRT連續(xù)運(yùn)行了180 d。依據(jù)采用的SRT，系統(tǒng)運(yùn)行分為3個(gè)階段。在整個(gè)運(yùn)行期間連續(xù)監(jiān)測(cè)PHA的積累、COD消耗、NH4+-N消耗、F/F變化情況（圖1）。接種的河口底泥在階段1采用SRT為2 d進(jìn)行富集。接種物逐漸適應(yīng)反應(yīng)條件，表現(xiàn)為消耗的COD和氨氮逐漸增大。周期內(nèi)最大積累的PHA含量也逐漸升高，表明積累PHA的逐漸富集。在此階段，經(jīng)長(zhǎng)期富集篩選后，系統(tǒng)內(nèi)PHA積累菌逐漸富集起來(lái)，且適應(yīng)了系統(tǒng)的反應(yīng)條件。表現(xiàn)出較快的底物降解速率，F(xiàn)/F隨之逐漸下降。在連續(xù)運(yùn)行了30 d后，PHA的積累、COD消耗、消耗、F/F的變化保持穩(wěn)定，說(shuō)明系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)入到穩(wěn)態(tài)。從階段2升高SRT至4 d，變化初期（前50 d內(nèi)）系統(tǒng)消耗的COD和出現(xiàn)波動(dòng)。在連續(xù)運(yùn)行了50周期后逐漸穩(wěn)定，COD和消耗量高于階段1。但是相對(duì)階段1，階段2期間的最大PHA含量下降，暗示著系統(tǒng)PHA積累能力的降低，有更多的碳源用于生物的增殖，對(duì)比階段1，在階段2系統(tǒng)F/F從0.1升高到了0.15。在階段3，系統(tǒng)SRT降低至1 d，在經(jīng)歷了短暫的系統(tǒng)調(diào)整后，系統(tǒng)消耗的COD量保持不變但是消耗的氨氮量顯著升高，這一過(guò)程伴隨著周期最大PHA含量的顯著提升，在此階段穩(wěn)態(tài)下的F/F保持和階段2持平。相對(duì)SRT= 2 d，較長(zhǎng)的SRT和較短的SRT都增加了盛宴期的時(shí)間，從而增加了F/F。Albuquerque等[9]也發(fā)現(xiàn)了過(guò)低SRT導(dǎo)致盛宴期時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題，但是卻未發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)的SRT也具有相同的效果。以ADF模式運(yùn)行的富集系統(tǒng)中，盛宴期的長(zhǎng)度直接取決于底物消耗速率，即取決于進(jìn)水底物濃度、活性生物量濃度和比底物吸收速率[18]。F/F是富集系統(tǒng)中的重要選擇壓，F(xiàn)/F越小，盛宴期越短，饑餓期越長(zhǎng)，對(duì)非PHA合成菌群施加的選擇壓力就越大，同時(shí)PHA合成菌群產(chǎn)生的內(nèi)在生長(zhǎng)抑制效應(yīng)越顯著，從而富集系統(tǒng)內(nèi)表現(xiàn)出的PHA合成能力越強(qiáng)。已有研究[18]表明富集體系中存在F/F低于0.28可以實(shí)現(xiàn)有效的PHA積累菌群的選擇。本實(shí)驗(yàn)中不同SRT下系統(tǒng)內(nèi)的F/F均在0.21以下，和報(bào)道的最佳F/F閾值相同。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，SRT變化雖然沒(méi)有顯著地改變F/F，但是，監(jiān)測(cè)選擇過(guò)程中的周期動(dòng)力學(xué)可以發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)表現(xiàn)出的性能呈現(xiàn)顯著差異。

圖1　在整個(gè)富集期間COD、消耗、最大PHA含量以及F/F的變化情況Fig.1　Variation of COD and ammonium consumption, maximal PHA content and F/F ratio during all enrichment periods● consumption of COD; ▲ maximal PHA content; ★ consumption of; ■ F/F

2.2富集MMC最大PHA積累能力

不同SRT富集條件下系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定后，分別取其富集階段末期的剩余污泥進(jìn)行pulse-fed實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最大PHA積累能力的測(cè)定。投加底物依據(jù)DO的突躍點(diǎn)作為指示，每次投加的底物濃度相同，避免了底物的抑制作用。由于3個(gè)系統(tǒng)污泥的底物利用速率不同，每次投加碳源的時(shí)間也不相同，達(dá)到最大PHA含量的投加的碳源次數(shù)也存在差異（圖2）。階段1的富集MMC的pulse-fed實(shí)驗(yàn)持續(xù)10.5 h，間歇進(jìn)水6次后系統(tǒng)內(nèi)的最大PHA合成量不再增加，最大PHA積累量達(dá)56%細(xì)胞干重。階段2富集MMC的pulse-fed實(shí)驗(yàn)持續(xù)14 h，間歇進(jìn)水7次后系統(tǒng)內(nèi)的最大PHA合成量不再增加，最大PHA積累量達(dá)48%細(xì)胞干重。階段3的富集MMC的pulse-fed實(shí)驗(yàn)持續(xù)12.5 h，間歇進(jìn)水7次后系統(tǒng)內(nèi)的最大PHA合成量不再增加，最大PHA積累量達(dá)44%細(xì)胞干重。在采用ADF工藝選擇富集具有PHA積累能力MMC的研究中，F(xiàn)/F被認(rèn)為是最重要的選擇壓。已有研究表明F/F＜0.28是富集篩選MMC最佳的選擇壓[19]。在本研究中，全部選擇過(guò)程保持F/F＜0.21，在最佳選擇壓范圍內(nèi)。但是由于實(shí)施的SRT不同，選擇富集的MMC的最大PHA積累能力呈現(xiàn)出明顯差異，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)短的SRT不利于富集高聚PHA能力的MMC。研究結(jié)果證明在采用ADF工藝富集PHA積累MMC過(guò)程中，除了F/F外，SRT作為富集PHA高聚MMC的重要參數(shù)，需要在選擇過(guò)程中優(yōu)化選擇。

圖2　Pulse-fed模式下3個(gè)富集MMCs中最大PHA積累能力測(cè)試Fig.2　Determination of maximal PHA storage in three enriched MMCs by pulse-fed mode

2.3富集過(guò)程中的表觀動(dòng)力學(xué)

圖3列出了各運(yùn)行階段的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)。SRT= 1 d的底物降解速率（qS）是SRT= 2 d的2.5倍，是SRT= 4 d的3.4倍。qS隨著SRT的升高而降低，SRT越短越有利于富集具有快速底物降解能力的微生物。對(duì)比3個(gè)SRT的運(yùn)行可以發(fā)現(xiàn)，SRT影響最顯著的是微生物的增殖速率（qX），在階段1和階段2， qX基本相同，但是，降低SRT為1d，qX升高了近6倍?？梢?jiàn)，采用短SRT促進(jìn)了微生物的快速增殖。SRT對(duì)微生物增殖速率的影響也直接決定了微生物對(duì)碳源的利用。在對(duì)碳源分配上，微生物轉(zhuǎn)化率（YX/S）在SRT= 2 d，4 d時(shí)基本持平，在0.3 mg X·(mg COD)?1。但是，YX/S在SRT= 1 d時(shí)迅速升高至0.58 mg X·(mg COD)?1，升高了近1倍。由于低SRT微生物消耗了大量碳源用于微生物的快速增殖，也直接影響了內(nèi)源PHA的積累，主要表現(xiàn)在微生物積累PHA的速率（qP）和PHA轉(zhuǎn)化率（YPHA/S）。SRT= 2 d和SRT= 1 d的qP均為0.1 mg PHA·(mg X·h)?1，在SRT= 4 d時(shí)qP降至0.08 mg PHA·(mg X·h)?1左右，SRT對(duì)qP的影響較小。但是，YPHA/S在SRT = 2 d，4 d時(shí)保持0.3 mg PHA·(mg COD)?1。當(dāng)SRT降至1 d時(shí)，YPHA/S迅速降低為0.13 mg PHA·(mg COD)?1，下降了近一半。評(píng)價(jià)PHA合成菌群能力的最重要指標(biāo)是底物向PHA的轉(zhuǎn)化率。YPHA/S在低SRT的降低說(shuō)明系統(tǒng)積累PHA能力迅速下降。短SRT不利于PHA積累菌群的選擇和富集。對(duì)比其他成功選擇PHA積累MMC的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，采用ADF方式富集PHA積累MMC主要采用HRT = SRT[7,12,20]或者HRT=SRT[9,11]兩種方式（表2）。富集的MMC積累PHA效果和動(dòng)力學(xué)參數(shù)受到參數(shù)F/F、底物類(lèi)型、SRT的影響。對(duì)比HRT = SRT（SRT = 1 d）[7]和HRT=SRT（SRT= 10 d）[11]兩種方式的選擇結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在以乙酸為底物的條件下，SRT直接影響了富集MMC積累PHA的能力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。短SRT選擇的MMC具有較大的PHA細(xì)胞含量，但是YPHA/S卻較低[7]。但是，本研究卻得出了不同結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)采用短的SRT導(dǎo)致YPHA/S和PHA最大積累量均較低。說(shuō)明短SRT不利于富集具有高聚PHA積累能力的MMC。此外，MMC積累PHA的動(dòng)力學(xué)參數(shù)還受到底物類(lèi)型的影響。采用乙酸為底物的YPHA/S普遍高于采用可再生廢水和復(fù)合底物的YPHA/S。本研究采用復(fù)合糖蜜酒精廢水作為選擇底物，其YPHA/S整體偏小。比較不同的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)采用過(guò)短SRT富集的MMC的YPHA/S變小而YX/S增高是造成其積累能力下降的主要原因。

表2　本研究與其他研究參數(shù)的比較Table 2　Parameter comparison of some research with this study

圖3　富集期間qS、qX、qP、YPHA/S以及YX/S的動(dòng)力學(xué)計(jì)算Fig.3　Dynamics of qS, qX, qP, YPHA/Sand YX/Sduring enriched periods

2.4SRT在MMC富集中的作用SRT作為富集反應(yīng)器的重要運(yùn)行參數(shù)，也會(huì)對(duì)混合菌群施加一種選擇作用。這種作用將基于微生物世代時(shí)間對(duì)MMC實(shí)施選擇壓。微生物世代時(shí)間高于特定的SRT的微生物菌群會(huì)在富集的過(guò)程中被淘汰掉，低于這一特定值的菌群則會(huì)留存下來(lái)。此外，SRT還決定了微生物的增殖速率。采用較長(zhǎng)SRT富集的MMC中更容易積累惰性微生物，其多為一些處于內(nèi)源呼吸期或衰亡期的菌群。這類(lèi)菌群的存在將會(huì)使盛宴期混合菌群的比底物利用速率下降，并且具有PHA合成能力的惰性微生物會(huì)在盛宴期儲(chǔ)存更多的物質(zhì)，從而在饑餓期用于內(nèi)源呼吸而非細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中SRT為4 d的富集系統(tǒng)中隨著富集時(shí)間的推移，富集系統(tǒng)內(nèi)的比底物利用速率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。而采用SRT為2 d和1 d的系統(tǒng)中，隨著富集時(shí)間的延長(zhǎng)，富集系統(tǒng)內(nèi)的比底物利用速率是呈上升趨勢(shì)。這說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)SRT導(dǎo)致富集系統(tǒng)中積累了較多的惰性微生物，致使富集系統(tǒng)中PHA合成菌群所占比例下降。但是，值得注意的是過(guò)短的SRT導(dǎo)致混合菌群更新?lián)Q代快，系統(tǒng)內(nèi)世代時(shí)間短，活性強(qiáng)的微生物保留下來(lái)。所以在SRT= 1 d的富集系統(tǒng)中微生物具有最大增殖速率和最大底物降解速率。過(guò)短的SRT刺激了微生物的快速增殖而非PHA積累菌群的篩選，因此弱化了選擇的效果。此外，SRT越低，每周期排出的污泥量越大，系統(tǒng)內(nèi)的微生物濃度越低（圖4）。在低生物量濃度的條件下，單位生物量所獲得的碳源和氮源較多，此時(shí)高活性的非PHA合成菌群將利用足夠的碳源和氮源快速進(jìn)行細(xì)胞增殖，成為優(yōu)勢(shì)菌群，無(wú)法將其從系統(tǒng)內(nèi)淘汰掉。PHA合成菌群所占比例越來(lái)越少，即使系統(tǒng)內(nèi)存在高活性高PHA合成能力的PHA菌群，但由于其基數(shù)小，使得富集得到的混合菌群的整體PHA合成能力很低，這一點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)（圖3）。本實(shí)驗(yàn)中在SRT 為2 d時(shí)，富集所得混合菌群的微生物活性高并且具有很高的PHA合成能力。充分證明了SRT為2 d時(shí)，富集系統(tǒng)內(nèi)既淘汰掉了混合菌群中的惰性微生物菌群，也防止了長(zhǎng)SRT的對(duì)富集系統(tǒng)有消極影響的微生物種群的產(chǎn)生，同時(shí)將具有PHA合成能力的微生物菌群保存了下來(lái)，并且使其利用碳源優(yōu)勢(shì)擴(kuò)大了其在混合菌群中的比例，成為優(yōu)勢(shì)菌群。

圖4　整個(gè)富集期間MLSS的變化Fig.4　MLSS variation during all enriched periods

3　結(jié)　論

ADF是選擇富集具有高聚PHA積累能力微生物普遍采用的工藝，在這個(gè)工藝中，F(xiàn)/F被認(rèn)為是唯一的選擇壓。但是，在此過(guò)程中SRT作為生物選擇重要選擇壓沒(méi)有被重視。以往成功富集高聚PHA積累能力的研究普遍以短污泥齡（HRT= SRT）和長(zhǎng)污泥齡（HRT=SRT）兩種方式進(jìn)行。本研究以批式培養(yǎng)條件富集嗜鹽MMC為例，考察了SRT對(duì)ADF選擇過(guò)程的影響。研究發(fā)現(xiàn)SRT作為重要的選擇壓，影響了ADF的選擇結(jié)果和富集MMC的PHA積累能力。過(guò)高的SRT導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)惰性物質(zhì)升高，qS和qP很低，細(xì)胞的活性和增殖能力降低；過(guò)低的SRT增加了微生物的代謝和增殖活性，但是卻刺激了非PHA積累菌群的生長(zhǎng)，導(dǎo)致qS、qP和YX/S明顯提高。YPHA/S降到最低值，富集MMC的PHA積累能力降低。本研究明確了SRT在ADF選擇中的重要作用，對(duì)實(shí)現(xiàn)快速富集高聚PHA能力MMC具有重要意義。

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Influence of SRT on enriching halophilic MMC with capacity of PHA storage

CUI Youwei, LIN Xiaoyuan, JI Siyuan, SHI Yunpeng
(College of Environmental and Energy Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

Abstract:Enriching mixed microbial culture (MMC) with capacity of PHA storage via controlling the enrichment process parameters is the first and the most important step for the fermentation production of PHA. This paper elucidated the role of sludge retention time (SRT) in the enrichment process under batch culture conditions. The results showed that SRT influenced the specific substrate degradation rate (qS), specific PHA accumulation rate (qP) and the PHA storage capacity of enriched MMC. The long SRT (SRT= 4 d) led to the decreased qS, qPand PHA accumulation ability. The short SRT reduced the PHA conversion rate (YPHA/S) and PHA accumulation ability of MMC. The optimal SRT was determined as 2 d for enriched MMC in this study, which presented 56% cell dry weight PHA content. The study proved that the SRT played the important role in enriching halophilic MMC, which laid the foundation on enriching PHA-storage MMC rapidly.

Key words:SRT; PHA storage bacteria; polymers; fermentation; biological engineering

中圖分類(lèi)號(hào)：X 703

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438—1157（2016）06—2575—08

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151644

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51478011，51178004)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8132013)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目。

Corresponding author:CUI Youwei, cyw@bjut.edu.cn