韓鵬黎，孫　蕾，呂朋舉，龔芬芬，馬　超，陳　國，朱怡然，夏　天，曹　巍

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，河南 鄭州　450007；2.華中師范大學生命科學學院，湖北 武漢　430000)

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納米顆粒對人食管癌EC-9706、EC-109細胞增殖和凋亡的影響

韓鵬黎1，孫蕾1，呂朋舉1，龔芬芬1，馬超1，陳國1，朱怡然2，夏天1，曹巍1

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，河南 鄭州450007；2.華中師范大學生命科學學院，湖北 武漢430000)

摘要：目的研究氧化銅(CuO)、氧化鋅(ZnO)、二氧化鈦(TiO2)納米顆粒在體外對人食管鱗狀癌細胞系EC-9706和EC-109增殖的影響及其部分作用機制。方法使用透射電鏡(TEM)、動態(tài)光散射(DLS)鑒定納米顆粒物的理化性質，然后將不同濃度的TiO2、CuO、ZnO(5～80 mg·L-1)與體外培養(yǎng)的EC-9706和EC-109細胞孵育，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞生長抑制率，流式細胞術(FCM)法檢測細胞周期及凋亡率，Transwell小室法檢測細胞侵襲能力，蛋白免疫印跡法檢測細胞中Bcl-2和caspase-3蛋白表達情況。結果實驗所用的納米CuO、ZnO、TiO2顆粒為球形，粒徑分別為12、20.6、12 nm。在水中與細胞培養(yǎng)液中聚集成較大顆粒并帶負電。隨著納米顆粒濃度的增加，納米CuO和ZnO顆?？蓜┝恳蕾囆砸种剖彻荀[癌細胞的增殖，G0/G1期細胞的比率上調，G2/M期的比率下降，并促進凋亡率增加，侵襲力下降；納米顆粒處理48 h后，與對照組相比，活化caspase-3表達量明顯升高，Bcl-2表達量明顯下降(P<0.05)。納米TiO2顆粒對食管鱗癌細胞的增殖、凋亡和侵襲能力無明顯的影響。結論與納米TiO2相比，一定濃度的CuO和ZnO納米顆粒可有效抑制食管鱗癌細胞的生長，阻滯細胞周期于G0/G1期，并誘導其凋亡，這可能是其抑制食管癌細胞功能的作用機制之一。

關鍵詞：食管癌；氧化銅納米顆粒；氧化鋅納米顆粒；二氧化鈦納米顆粒；細胞增殖；凋亡

食管癌是我國最為高發(fā)的惡性腫瘤之一，世界范圍內食管癌的發(fā)生率位列惡性腫瘤的第8位，死亡率為第6位[1]，5年生存率低于15%[2]。在我國大部分地區(qū)，尤其是高發(fā)區(qū)河南省林州市，仍然是導致人死亡的主要原因之一[3]。而我國食管癌的發(fā)病率居世界第1位，發(fā)病人數占世界總數的60%。研究表明，基因突變、抑癌基因失活、等位基因高頻率雜合性缺失等都可促進食管癌的發(fā)生發(fā)展[4]。近年來，雖然人們對食管癌的分子發(fā)生機制有了不少的認識，對食管癌的治療方法也不斷進步，但是，其5年治愈率仍在10%～15%。因此，研究食管癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋求新的治療方法顯得尤為重要。

納米顆粒在人們的生活中隨處可見，由于它們具有獨特的理化性質，有別于微米級的顆粒，可以明顯提高產品功能。目前，納米顆粒已經在日常用品、醫(yī)療衛(wèi)生、電子產品、食品藥物中廣泛應用。例如，ZnO和TiO2納米顆粒被應用在防曬霜中，CuO被用于殺蟲劑與油漆中。然而，這些獨特的理化性質一方面有可能在接觸人體后會對人體造成危害，另一方面可以應用它們的這些理化特性來治療疾病，如癌癥。ZnO、TiO2和CuO對細胞的毒性作用已有研究報道，例如氧化銅納米顆粒通過誘導自噬反應，誘導非小細胞肺癌A549細胞死亡[5]，氧化銅納米顆?？膳c自噬抑制劑結合并誘導乳腺癌MCF-7細胞的凋亡[6]，二氧化鈦納米顆粒在急性照射下會對A549細胞產生毒性[7]等，但是對食管癌細胞的影響目前還研究甚少。因此，研究納米顆粒對食管癌的殺傷機制顯得極為重要。本研究將探討3種不同納米顆粒CuO、ZnO、TiO2在體外對人食管鱗狀細胞癌EC-9706和EC-109細胞增殖及凋亡的影響，并探討部分的作用機制，為進一步開發(fā)納米顆粒為抗食管癌藥物提供理論依據。

1材料與方法

1.1細胞

人食管癌細胞株EC-9706和EC-109購自中國科學院上海細胞庫，EC-9706和EC-109都是人食管高分化鱗狀細胞株。

1.2試劑

3種納米CuO、ZnO、TiO2顆粒購自Sigma Aldrich；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購自HyClone公司； DMSO和四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；Annexin-Ⅴ-FITC 凋亡試劑盒和PI單染周期試劑盒購自上海碧云天公司；蛋白提取試劑盒和ECL 發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Bcl-2、caspase-3、β-actin抗體、 山羊抗兔 IgG均購于Abcam公司。

1.3納米CuO、ZnO、TiO2懸液的制備

稱取一定量的3種納米CuO、ZnO、TiO2顆粒，用不含內毒素的無菌水溶解納米干粉材料，超聲處理30 s，制成顆粒儲備液(8 g·L-1)，應用此儲備液配制所需的細胞培養(yǎng)懸浮液，配置之前用超聲處理后立即用于細胞實驗。

1.4CuO、ZnO、TiO2納米顆粒的表征

透射電鏡(TEM)用于確定納米材料初級顆粒的大小和形態(tài)，動態(tài)光散射(DLS)描述納米顆粒在水中及細胞培養(yǎng)液中的流體動力學大小、同時檢測納米材料懸浮液的zeta電位。

1.5MTT法檢測細胞生長抑制率

取對數生長期的細胞，調整細胞密度為5×107·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，實驗組分別加入CuO、ZnO、TiO2溶液，每個濃度均設3個復孔。同時設空白組、陰性對照組。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄上清液，加入DMSO每孔150 μL，震蕩混勻后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測570 nm波長下各孔的吸光度(A)值，按以下公式計算細胞的生長抑制率。

細胞生長抑制率/%=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。

1.6碘化丙啶PI單染法檢測細胞周期

取對數生長期的細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，實驗組分別加入CuO、ZnO、TiO2(殺傷率均為75%的劑量)，對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，1 000×g離心5 min，棄上清液。加入預冷的70%乙醇固定，于4℃下保存過夜。用流式細胞儀分析，按Cell Quest軟件檢測并分析細胞周期情況。

1.7AnnexinⅤ-FITC/PI 雙染色法檢測細胞凋亡

實驗分組同上，培養(yǎng)48 h后收集細胞，按Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，于1 h內上流式細胞儀，用Cell Quest軟件檢測并分析細胞凋亡和死亡的情況。結果判斷：FITC-/PI-為活細胞，FITC-/PI+為壞死細胞，FITC+/PI-為凋亡細胞，FITC+/PI+為凋亡后繼發(fā)死亡的細胞。按以下公式計算細胞凋亡率。

細胞凋亡率/%=(凋亡細胞數+繼發(fā)死亡細胞數)/全部細胞數×100%。

1.8Transwell小室法檢測細胞侵襲力

用預冷不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，鋪于8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的培養(yǎng)小室內，接種200 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的各組EC-9706、EC-109細胞(1×108·L-1)，下室加入900 μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)液。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)小室，用甲醇固定20 min。風干，0.1%結晶紫染色20 min，用濕棉簽擦去上室底部基質膠及未侵襲細胞，將培養(yǎng)小室倒置，在光學顯微鏡下觀察，并隨機選取5個視野計數每高倍視野濾膜底面的平均細胞數。

1.9Western blot檢測細胞中Bcl-2和caspase-3蛋白的表達

實驗分組同上，提取作用48 h后的EC-9706、EC-109細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白含量。取蛋白 30 μg,12% SDS-PAGE 凝膠電泳，恒壓80 V電泳至分離膠，恒壓120 V至電泳結束，電轉印至甲醇激活的硝酸纖維素膜(PVDF)上(25 V、10 min)；TBST配制5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗β-actin、抗Bcl-2、抗caspase-3一抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min；二抗(1 ∶1 000) 室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每10 min；ECL發(fā)光，CCD成像。圖像用 Image J 1.48軟件對各蛋白條帶進行光密度值定量分析，用各目的蛋白條帶光密度值同內參蛋白條帶光密度值比較，得到的比值統(tǒng)計分析各蛋白的相對表達水平。實驗重復3 次。

1.10統(tǒng)計學處理

2結果

2.1CuO、ZnO、TiO2納米顆粒的表征

用TEM表征納米CuO、ZnO、TiO2的粒徑大小及晶體形狀(Fig 1)，結果說明納米CuO、ZnO、TiO2的單一晶體顆粒的主要粒子大小為12、20.6、12 nm，呈球狀；用DLS和激光粒度分布儀表征納米CuO、ZnO、TiO2顆粒的流體動力學大小及懸浮液的zeta電位。見Tab 1。

Fig 1　Photos of CuO, ZnO and TiO2nanoparticles by TEM

2.23種不同納米顆粒對EC-9706、EC-109細胞增殖的抑制作用

CuO和ZnO納米顆粒在作用細胞EC-9706和EC-109 48 h后，隨著納米顆粒劑量的增大，細胞的增殖抑制率明顯增加(P<0.05)；而TiO2納米顆粒對EC-9706和EC-109細胞的增殖無明顯的抑制作用。見Fig 2。

Tab 1　Hydrodynamic size and zeta potential of CuO, ZnO and TiO2nanoparticles

Fig 2　Inhibitory effects of three different nanoparticles in EC-9706 and EC-109 cells by MTT

*P<0.05vs5 mg·L-1

2.33種不同納米顆粒對EC-9706、EC-109細胞周期的影響

選取抑制率75%左右的納米顆粒濃度作用于EC-9706和EC-109細胞48 h后，PI單染法檢測結果顯示，CuO和ZnO納米顆粒G0/G1期的細胞比率上升、G2/M期比率下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義；TiO2納米顆粒G0/G1期細胞比例、S期細胞比例、G2/M期細胞比例均變化不大，與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。見Fig 3。

2.43種不同納米顆粒對EC-9706、EC-109細胞凋亡的影響

選取抑制率75%左右的納米顆粒濃度作用于EC-9706和EC-109細胞48 h后，Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染色法檢測結果顯示，CuO和ZnO納米顆粒處理后與對照組相比，細胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TiO2納米顆粒組細胞凋亡率變化不大，與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。見Fig 4。

2.5Transwell體外侵襲實驗

EC-9706和EC-109對照組侵襲細胞數分別為(152.70±15.64)和(126.58±20.37)個，和正常對照組相比，CuO和ZnO納米顆粒處理組穿越Matrigel膠的細胞數明顯減少(P<0.05)，而TiO2納米顆粒處理組與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見Fig 5。

2.6Western blot檢測凋亡相關蛋白表達

3種納米顆粒作用EC-9706和EC-109細胞 48 h后，Western blot 檢測caspase-3和Bcl-2的表達。分析結果顯示，與對照組相比，實驗組caspase-3表達量明顯升高(P<0.05)，Bcl-2表達量明顯降低(P<0.05)。見Fig 6。

3討論

納米顆粒是一種人工制造的、大小不超過100納米的微型顆粒。近年來，納米科學的發(fā)展極大地促進了科學的進步，也給醫(yī)學帶來新的生機和挑戰(zhàn)。納米醫(yī)學作為納米科學與醫(yī)學的交叉學科，給疾病的診療帶來新的思路和方法。德國環(huán)境健康研究中心Moschini等[7]研究開發(fā)出了一種新型納米顆粒載體，其可以在人類和小鼠的肺部腫瘤位點實現位點選擇性地釋放藥物分子，這種方法或可增加當前癌癥藥物對肺癌的作用效果，提高藥物的作用效率，而且可降低藥物濃度，繼而降低副作用。本研究發(fā)現，TiO2對食管癌細胞無明顯毒性，表明可以作為藥物載體治療ESCC。

細胞增殖是通過細胞周期的運轉來實現的，細胞周期調控異常與腫瘤的發(fā)生密切相關。在細胞周期進程中有兩個限制點：G1/S期限制點和G2/M期限制點。G1/S期限制點作用主要是控制細胞從G1期進入S期，能防止受損的堿基復制，修復染色體中的突變。本實驗結果顯示，隨著CuO和ZnO納米顆粒濃度的增加，細胞EC-9706和EC-109的G0/G1期細胞比率上升，S期細胞百分比率逐漸下降。結果提示，納米CuO和ZnO顆粒可以使細胞阻滯在G0/G1期，導致進入S期細胞數減少，不能進行DNA的合成，最終導致生長抑制。而納米TiO2顆粒對細胞EC-9706和EC-109的G0/G1期細胞比率無明顯影響。有研究證實，納米Fe3O4顆?？芍录毎⒐芎臀⒔z的破裂[10-11]，將會直接影響細胞的有絲分裂，這可能是造成細胞阻滯的中心環(huán)節(jié)，我們推測這也可能是納米CuO和ZnO顆粒影響細胞周期進程的一個重要途徑，下一步我們將進行驗證。

Fig 3　Effects of three different nanoparticles on cell cycle of EC-9706 and EC-109 cells

Fig 4　Effects of three different nanoparticles on cell apoptosis of EC-9706 and EC-109 cells

細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，細胞凋亡被視為評估腫瘤治療療效的一項指標。誘導細胞凋亡的刺激信號有很多，如DNA損傷、離子穩(wěn)態(tài)失衡等。有研究證實，超順磁氧化鐵納米材料可造成細胞線粒體膜電位下降，從而引起線粒體膜內外一系列的生化改變，如釋放細胞色素C、Bcl-2家族及caspase活化等，引起細胞凋亡的級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡[12]，這可能將是納米ZnO和CuO誘導細胞凋亡的一個重要途徑。caspase 家族是一類半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中起著重要的作用[9],caspase-3是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶。當接收到細胞凋亡信號的刺激，Bcl-2表達降低，線粒體外膜通透性升高，引起細胞色素C釋放到胞質中，激活Apaf-1，裂解相應的胞質胞核底物，活化 caspase-3，最終導致細胞凋亡。本實驗證實，納米顆粒處理細胞48 h后，與對照組相比，活化caspase-3表達量明顯升高，抑凋亡基因Bcl-2表達下降，從而造成細胞凋亡增加，這與流式檢測凋亡結果也是一致的。提示誘導腫瘤細胞凋亡可能是CuO和ZnO納米顆?？鼓[瘤的作用機制。納米CuO和ZnO顆粒誘導細胞凋亡可能是一個多途徑參與的復雜過程，其中許多調控環(huán)節(jié)有待進一步研究。

Fig 5　Effects of three different nanoparticles on invasive ability of EC-9706 and EC-109 cells by Transwell

*P<0.05vscontrol

本研究所用ZnO和CuO殺傷細胞機制主要是溶解和釋放有毒的Zn和Cu離子，這些離子可以對細胞有殺傷作用，作用機制涉及氧化應激。低水平的氧化應激引發(fā)細胞表達抗氧化蛋白如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等；中等水平的氧化應激引發(fā)促炎癥因子的表達，如細胞因子等；高水平的氧化應激引發(fā)線粒體依賴的細胞凋亡[13-14]。本研究中ZnO和CuO對兩種食管癌細胞的毒性作用機制包括細胞凋亡，同時一個新發(fā)現是它們同時抑制食管癌細胞的侵襲能力，顯示可能對癌癥轉移有抑制作用。

綜上所述，CuO和ZnO顆粒有抑制EC-9706和EC-109細胞增殖的作用，并可誘導細胞凋亡，降低細胞侵襲，可作為潛在的抗食管癌化合物；TiO2對食管癌細胞無明顯毒性，考慮可以作為新型納米顆粒載體治療腫瘤，如裝載化療藥物或核酸片段靶向殺死腫瘤細胞，以達到治療ESCC的作用，本研究為食管癌的治療提供了新的思路。有關CuO和ZnO顆粒殺傷腫瘤細胞的作用機制有待進一步研究。

Fig 6　Effects of three different nanoparticles on expression levels of Bcl-2 and caspase-3 proteins in EC-9706 and EC-109 cells

*P<0.05vscontrol

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Effects of three kinds of nanoparticles on proliferation and apoptosis of esophageal squamous carcinoma cells

HAN Peng-li1, SUN Lei1, LYU Peng-ju1, GONG Fen-fen1,MA Chao1, CHEN Guo1,ZHU Yi-ran2, XIA Tian1, CAO Wei1

(1.TranslationalMedicineCenter,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007，China;2.SchoolofLifeScience,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430000,China)

Abstract:AimTo study the effects of CuO, ZnO and TiO2nanoparticles on the viability and metastatic potential of EC-9706 and EC-109 esophageal squamous carcinoma cell lineinvitro. MethodsCharacteristics of CuO, ZnO and TiO2nanoparticles were detected using transmission electron microscope(TEM) and dynamic light scattering(DLS). EC-9706 and EC-109 cells were treated with different concentrations of CuO, ZnO and TiO2(5～80 mg·L-1). The cell proliferation was analyzed by MTT assay. The cell cycle and apoptotic rates were determined by flow cytometry(FCM). The cell invasion was assayed in Transwell chambers. The expression of Bcl-2 and caspase-3 protein in cells was detected by Western blot method.ResultsCuO, ZnO and TiO2nanoparticles were spherical with primary particle size 12, 20.6, 12 nm. The particles were agglomerated in water and cell culture medium with negative charge. CuO and ZnO nanoparticles induced decreases in EC-9706 and EC-109 cell viability dose-dependently. After exposed to increasing concentrations of CuO and ZnO nanoparticles, the cell cycle analysis revealed a decreasing proportion of cells in G2/M and S phase, and up-regulation of the cells in G0/G1phase. Apoptotic cells also increased along with decreased cell invasion upon CuO and ZnO treatment. Nanoparticles treatment after 48 h, the activated caspase-3 expression quantity increased significantly and the Bcl-2 expression quantity decreased obviously(P<0.05) compared with control group. TiO2nanoparticles had no obvious effect on the EC-9706 and EC-109 cell proliferation, cell cycle, apoptosis and invasion.ConclusionCompared with TiO2, CuO and ZnO nanoparticles can inhibit EC-9706 and EC-109 cell viability and metastatic potential, the mechanism of action involves cell cycle arrest in G0/G1phase and apoptosis. These findings can help the development of nanoparticles as anti-cancer therapeutics for esophageal cancer.

Key words:esophageal cancer; CuO nano; ZnO nano; TiO2nano; cell proliferation; apoptosis

收稿日期:2016-01-21,修回日期:2016-03-02

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 31570899)；河南省醫(yī)學科技攻關計劃項目(No 201403273)

作者簡介：韓鵬黎(1987-)，女，碩士，研究方向：腫瘤藥理學，E-mail：hanpengli2013@163.com； 曹巍(1963-)，男，博士，教授，研究方向：腫瘤病理學，通訊作者，E-mail：caoweiyu@hotmail.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.011

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0789-06

中國圖書分類號：R329.24；R329.25；R735.102.2；R916.3

網絡出版時間：2016-5-25 15:39網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.022.html