徐永吉,李文楷,劉　杰,陸遠(yuǎn)富

(遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義　563000)

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利福平對小鼠的肝毒性及膽酸代謝基因的影響

徐永吉,李文楷,劉杰,陸遠(yuǎn)富

(遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義563000)

摘要：目的觀察利福平長期給藥引起小鼠的肝損傷及其對膽汁酸代謝通路相關(guān)基因的影響。方法1 d 1次灌胃給予♂昆明種小鼠180 mg·kg-1利福平連續(xù)30 d與90 mg·kg-1利福平連續(xù)90 d；麻醉取血、肝臟，稱肝重，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，觀察肝臟組織的病理變化；提取肝臟總RNA并采用RT-PCR法檢測膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA的表達情況，提取肝臟總蛋白并采用Western blot 法檢測相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果連續(xù)給予利福平180 mg·kg-130 d和90 mg·kg-190 d，小鼠肝重系數(shù)增加，肝臟發(fā)生明顯病理改變，表現(xiàn)為肝細(xì)胞水腫、羽毛樣變性與脂肪變性，且利福平180 mg·kg-130 d病理改變較嚴(yán)重；連續(xù)給藥180 mg·kg-1利福平30 d可使膽酸代謝基因膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)、法尼醇受體(FXR)、小分子異源二聚體伴侶(SHP)表達增加，膽鹽輸出泵(BSEP)的表達降低；連續(xù)給藥90 mg·kg-1利福平90 d，僅可發(fā)現(xiàn)膽酸代謝基因膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)表達增加。結(jié)論利福平對小鼠具有明顯肝毒性，引起膽汁淤積性肝損傷；其影響CYP7A1與BSEP的基因表達可能是其導(dǎo)致膽汁淤積性肝損傷的機制之一。

關(guān)鍵詞：利福平;肝毒性;膽酸代謝;膽汁淤積;CYP7A1;BSEP

利福平(rifampicin,RFP)做為目前預(yù)防和治療結(jié)核病的一線藥物，在臨床上常與異煙肼合用以增強療效。正常劑量短期服用利福平其肝毒性較小，而長期或大劑量則具有明顯的肝毒性，利福平引起的肝損害是由于與蛋白結(jié)合、藥物的肝腸循環(huán)延長、競爭性抑制膽紅素的排泄、引起肝細(xì)胞緊密連接蛋白被破壞、肝內(nèi)膽汁淤積[1]，導(dǎo)致黃疽和肝細(xì)胞的壞死，但其分子機制未見有文獻明確的闡述。本文通過給予小鼠180 mg·kg-130 d與90 mg·kg-190 d的利福平，觀察利福平的肝毒性，并且檢測其對肝臟膽汁酸代謝通路上相關(guān)基因的影響。

1材料與方法

1.1藥品與儀器

利福平膠囊(成都錦華，批號：131006)；ALT測定試劑盒(南京建成，批號：20140615)；TRIzol(大連寶生物公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems公司)；SYBR Green預(yù)混液(美國BIO-RAD公司)；實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司，型號：CFX connect)；多功能梯度PCR儀(德國Eppendoff)；ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；CYP7A1抗體(abcam公司，ab65596，兔多克隆抗體)；BSEP抗體(abcam公司，ab112494，兔多克隆抗體)；Thermo Bis-Tris凝膠等。

1.2實驗動物與分組

健康♂昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，于遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理學(xué)實驗室SPF級動物房飼養(yǎng)(許可證號：SYXK黔2014-003)；自由進食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始給藥，每天灌胃給藥1次：設(shè)利福平180 mg·kg-1組,連續(xù)給藥30 d；利福平90 mg·kg-1組，連續(xù)給藥90 d；對照組給予相應(yīng)體積的蒸餾水。

1.3動物給藥及取材

小鼠按分組灌胃給藥0.1 mL·10 g-1；分別給藥30 d與90 d，末次給藥后1 h麻醉，收集血清和肝臟組織。

1.4Real time PCR檢測基因表達

檢測肝組織中CYP7A1、FXR、SHP和BSEP mRNA的表達：肝組織100 mg采用TRIzol提取總RNA，通過紫外分光光度計檢測總RNA的濃度與質(zhì)量，以260/280的比值(1.8～2.0)確認(rèn)RNA質(zhì)量后再用于下一步實驗：調(diào)整總RNA濃度為100 mg·L-1進行逆轉(zhuǎn)錄(37℃，15 min；85℃，5 sec)，所得cDNA 進行SYBR Green PCR反應(yīng)(退火溫度60℃)，PCR反應(yīng)以β-actin作為內(nèi)參照，所用特異性引物如Tab 1；結(jié)果采用相對定量法進行分析。

Tab 1　Primer sequences used for RT-PCR reaction

1.5Western blot檢測蛋白表達

取100 mg肝組織，加入1 mL RIPA裂解液與PMSF，勻漿后離心取上清，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液95℃變性。10% Bis-Tris凝膠進行電泳，使用PVDF膜進行蛋白轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉后，4℃孵育一抗過夜，TBST緩沖液洗膜后孵育二抗1 h，洗膜滴加化學(xué)發(fā)光液曝光顯影。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2實驗結(jié)果

2.1利福平對小鼠肝重系數(shù)的影響

如Fig 1所示，小鼠30 d連續(xù)給予180 mg·kg-1利福平與90 d給予90 mg·kg-1利福平，給藥組組肝重系數(shù)明顯增加。

Fig 1　The liver index of rifampicin 180 mg·kg-1for 30 days and 90 mg·kg-1for 90 days

2.2利福平對小鼠ALT的影響

如Fig 2所示，小鼠連續(xù)給予利福平180 mg·kg-130 d后，利福平組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)明顯增加；而連續(xù)給予利福平90 mg·kg-190 d，血清ALT含量雖有增加，但增加不多。

2.3連續(xù)給予利福平180 mg·kg-130 d肝臟病理切片

與空白組相比，肝臟細(xì)胞明顯病變損傷，表現(xiàn)為肝細(xì)胞水腫、羽毛樣變性與脂肪變性。見Fig 3。

Fig 2　The level of ALT by rifampicin 180 mg·kg-1for 30 days and 90 mg·kg-1for 90 days in serum.

Fig 3　Photomicrography of liver sections from the mice in the Rifampicin 180 mg·kg-1for 30 days group

Histopathology showed dramatically steatosis and spotted feathery-like degeneration.↑ feathery-like degeneration.A:Control(original magnification×100);B:Control(original magnification×200);C:Rifampicin(original magnification×100);D:Rifarmpicin(original magnification×200)

2.4連續(xù)給予利福平90 mg·kg-190 d肝臟病理切片

與空白組相比，利福平組有明顯肝細(xì)胞病理學(xué)改變：可見細(xì)胞腫漲，羽毛樣變性；可發(fā)現(xiàn)其病理改變較利福平180 mg·kg-130 d組輕。見Fig 4。

2.5利福平180 mg·kg-130 d肝臟中膽酸代謝相關(guān)基因CYP7A1、FXR、SHP和BSEP mRNA的表達

與空白組相比，利福平180 mg·kg-130 d組CYP7A1、FXR與SHP均呈現(xiàn)基因高表達現(xiàn)象，BSEP呈現(xiàn)低表達，見Fig 5。Western blot檢測蛋白表達也證實CYP7A1表達增加，BSEP表達降低。見Fig 6。

2.6正常劑量利福平90 d肝臟中膽酸代謝相關(guān)基因CYP7A1、FXR、SHP和BSEP mRNA的表達

與空白組相比，利福平90 mg·kg-190 d組CYP7A1基因呈高表達，F(xiàn)XR、SHP與BSEP未出現(xiàn)明顯變化，見Fig 7。Western blot檢測蛋白表達也證實CYP7A1表達增加，BSEP表達無改變。見Fig 8。

3討論

抗結(jié)核藥物引起的肝損害是藥物性肝損害最常見的原因之一，一線抗結(jié)核藥物利福平最常見的不良反應(yīng)為肝毒性[2]；利福平可導(dǎo)致以膽汁淤積為主的肝損傷[3]，利福平作為肝藥酶強誘導(dǎo)劑之一，與其他具有一定肝毒性的藥物合用，可使發(fā)生致命性肝毒性的危險明顯增加[4]。

Fig 4　Photomicrography of liver sections from the mice in the Rifampicin 90 mg·kg-190 days group

Histopathology showed steatosis and spotted feathery-like degeneration.↑ feathery-like degeneration.A:Control(original magnification×100);B:Control(original magnification×200);C:Rifampicin(original magnification×100);D:Rifarmpicin(original magnification×200)

Fig 5　The relative expression of CYP7A1, FXR, SHP and BSEP mRNA in the mice liver of rifampicin 180 mg·kg-130 days group

Fig 6　Protein expression of CYP7A1 and BSEP in the mice liver of rifampicin 180 mg·kg-130 days group

Fig 7　The relative expression of CYP7A1, FXR, SHP and BSEP mRNA in the mice liver of rifampicin 90 mg·kg-190 days group

結(jié)核病人一般需服用利福平半年以上，成人口服劑量為10～20 mg·kg-1：10 mg·kg-1為長期服用正常劑量，20 mg·kg-1為短時間大劑量給藥。根據(jù)人與小鼠給藥劑量體表面積換算法，本實驗中設(shè)利福平180 mg·kg-130 d組與90 mg·kg-190 d組。

Fig 8　Protein expression of CYP7A1 and BSEP in the mice liver of rifampicin 90 mg·kg-190 days group

本實驗中，小鼠口服利福平180 mg·kg-130 d，小鼠生理狀態(tài)較差，皮毛黯淡無光，肝指數(shù)增加，血清ALT水平明顯增高，肝細(xì)胞水腫、羽毛樣變性，提示肝細(xì)胞膽汁淤積[5]，證實利福平180 mg·kg-130 d具有肝毒性。服用90 mg·kg-1利福平90 d后，其肝重系數(shù)亦增加，血清ALT水平雖有增加但仍在正常范圍，肝組織病理切片發(fā)現(xiàn)90 d 90 mg·kg-1利福平亦可引起肝細(xì)胞內(nèi)膽汁淤積狀病理改變。長期服用利福平，會引起小鼠膽汁淤積性肝損傷，但90 mg·kg-190 d利福平損傷較小，可能與其長期服藥肝損傷自適應(yīng)有關(guān)[6]。

膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)是肝細(xì)胞合成膽汁酸經(jīng)典途徑唯一的限速酶[7]，CYP7A1的活性與膽汁酸的疏水程度呈明顯負(fù)相關(guān)，而疏水性膽汁酸的肝內(nèi)聚積是膽汁淤積性肝病肝損傷的主要原因；CYP7A1 基因位點上具有多個受體結(jié)合位點, 多種核受體參與了針對 CYP7A1 基因結(jié)合位點的調(diào)控, 其中包括法尼醇受體(FXR)與小分子異源二聚體伴侶(SHP)；FXR 是一個孤兒核受體,研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)源性膽酸可以激活 FXR，因此FXR也稱為膽汁酸受體。SHP的表達可抑制膽汁酸合成相關(guān)基因及SHP自身的表達[8]，SHP表達的增加還會減少膽汁酸被肝細(xì)胞再攝取[9]。FXR與膽酸結(jié)合后被激活，激活的FXR通過與SHP的反應(yīng)元件單位結(jié)合，抑制其他核受體，進而抑制膽汁酸合成關(guān)鍵酶CYP7A1的表達，減少膽汁酸合成。

檢測各組肝臟組織膽汁酸代謝相關(guān)基因表達情況，發(fā)現(xiàn)連續(xù)給予利福平180 mg·kg-130 d與90 mg·kg-190 d均可增加CYP7A1 mRNA表達，且180 mg·kg-130 d引起CYP7A1 mRNA表達增加更明顯，檢測蛋白表達情況也證實此現(xiàn)象；CYP7A1表達增加會引起肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸合成增加，疏水性膽汁酸的肝內(nèi)聚積，肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸池過大則會引起機體肝臟的負(fù)反饋調(diào)節(jié)FXR/SHP 通路被激活，本實驗也證實：FXR、SHP的mRNA表達增加。而連續(xù)給藥90 mg·kg-190 d，F(xiàn)XR、SHP的mRNA表達未見明顯變化，提示機體肝臟的FXR/SHP 負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路未被激活。BSEP是肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上重要的膽汁酸排泄載體[10]?？梢蕾嘇TP將膽汁酸通過肝細(xì)胞的小管膜分泌至膽汁中。抑制BSEP是藥物性肝損傷的機制之一[11]，其對利福平所致的肝損傷具有重要影響[12-13]。利福平180 mg·kg-130 d后可明顯降低BSEP表達，90 mg·kg-190利福平未引起B(yǎng)SEP表達變化，提示180 mg·kg-1利福平給藥30 d可引起B(yǎng)SEP介導(dǎo)的膽汁酸排泄減少。

小鼠口服利福平180 mg·kg-130 d與90 mg·kg-190 d均引起肝細(xì)胞合成膽汁酸經(jīng)典途徑的限速酶CYP7A1表達增加，引起膽汁淤積性肝損傷；180 mg·kg-130 d利福平還會引起膽汁酸排泄主要載體BSEP的表達降低，使肝損傷明顯加重。

綜上所述，利福平對小鼠具有明顯的肝毒性，會引起的膽汁淤積性肝損傷；且其毒性與劑量的關(guān)系比給藥時間的長短更為明顯。利福平會引起膽汁代謝相關(guān)基因CYP7A1、BSEP的基因表達變化，可能是其導(dǎo)致膽汁淤積性肝損傷的機制之一。研究利福平引起的肝損傷機制將有助于減少利福平應(yīng)用過程中的不良反應(yīng)并為治療不良反應(yīng)提供依據(jù)[14-15]。

(致謝：本實驗在陸遠(yuǎn)富教授與劉杰教授指導(dǎo)下，由徐永吉和李文楷完成。實驗完成于貴州省遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室；感謝實驗室各位老師的支持與幫助；感謝王洋碩士研究生在實驗過程中的幫助；感謝國家自然科學(xué)基金(81460632)的資助。)

參考文獻：

[1]Chen X, Zhang C, Wang H, et al. Altered integrity and decreased expression of hepatocyte tight junctions in rifampicin-induced cholestasis in mice[J].ToxicolApplPharmacol, 2009, 240(1): 26-36.

[2]賈忠，吳晶，馬建軍，等. 一線抗結(jié)核藥物肝損害的研究現(xiàn)狀[J]. 中國防癆雜志, 2013, 35(6): 468-71.

[2]Jia Z, Wu J, Ma J J, et al. Research of anti-tuberculosis drugs′ hepatotoxicity[J].ChinJAntTuberc, 2013, 35(6): 468-71.

[3]曹云海，陳熙，張程，等. 利福平對小鼠肝細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運體 Bsep 和 Mrp2 表達與定位的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2010, 26(12): 1581-6.

[.3]Cao Y H, Chen X, Zhang C, et al. Change of expression and localization of canalicular Bsep and M rp2 in rifampicin-induced cholestasis in mice[J].ChinPharmacolBull, 2010, 26(12): 1581-6.

[4]侯相瑜, 金晶, 李宏亮，等. SIRT1 在丙戊酸對肝細(xì)胞毒性中的作用研究[J]. 中國藥理學(xué)通報,2015, 31(1): 31-4.

[4]Hou X Y, Jin J, Li H L, et al. Valproic acid suppresses SIRT1 inducing hepatotoxicity[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(1): 31-4.

[5]Li M K, Crawford J M. The pathology of cholestasis[J].SeminLiverDis, 2004, 24(1): 21-42.

[6]蔡軼, 任曉非, 王巍, 等. 利福平致大鼠膽汁淤積性肝損傷適應(yīng)性現(xiàn)象的研究[J]. 胃腸病學(xué), 2013, 18(3): 134-8.

[6]Cai Y, Ren X F, Wang W, et al. Adaptation Phenomenon of Cholestatic Hepatic Injury Induced by Rifampicin in Rats[J].ChinJGastroenterol, 2013, 18(3): 134-8.

[7]Chiang J Y. Bile acid metabolism and signaling[J].ComprPhysiol, 2013, 3(3): 1191-212.

[8]Lee Y K, Moore D D. Dual mechanisms for repression of the monomeric orphan receptor liver receptor homologous protein-1 by the orphan small heterodimer partner[J].JBiolChem, 2002, 277(4): 2463-7.

[9]Zollner G, Wagner M, Fickert P, et al. Role of nuclear receptors and hepatocyte-enriched transcription factors for Ntcp repression in biliary obstruction in mouse liver[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol, 2005, 289(5): G798-805.

[10]牛璐, 金晶, 陳攀, 黃民. 黃芩素對膽汁外排轉(zhuǎn)運體MRP2和BSEP的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015, 31(1): 147-8.

[10]Niu L, Jin J, Chen P, Huang M. Effect of baicalein on expression of M RP2 and BSEP in HepG2 cells[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(1): 147-8.

[11]Kis E, Ioja E, Rajnai Z, et al. BSEP inhibition: in vitro screens to assess cholestatic potential of drugs[J].ToxicolInVitro, 2012, 26(8): 1294-9.

[12]王莉, 宋育林,何雪. PPARα激活可改善利福平合用異煙肼所致的大鼠肝損傷[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014, 49(8): 1057-61.

[12]Wang L, Song Y L, He X. Activation of peroxisome proliferator activated receptor alpha ameliorates Isoniazid and Rifampin induced liver injury in rats[J].ActaUnivMedAnhui, 2014, 49(8): 1057-61.

[13]龐純, 蔣萍,季莉莉. 黃芩素激活核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2拮抗肝毒性的研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014, 30(4): 546-9.

[13]Pang C, Jiang P, Ji L L. Baicalein induced Nrf2 activation and its protection against hepatotoxicity[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(4): 546-9.

[14]陳攀, 李晶潔,陳杰. 以核受體為靶標(biāo)的膽汁淤積治療藥物研究進展[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015, 31(9): 1195-8.

[14]Chen P, Li J J, Chen J. Nuclear receptors as drug targets in cholestasis[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(9): 1195-8.

[15]曹玲娟, 龔慧, 顏苗，等. Nrf2-ARE 信號通路參與肝臟疾病病理機制研究進展[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015, 31(8): 1057-61.

[15]Cao L J, Gong H, Yan M, et al. Research progress on Nrf2·ARE signaling pathway involved in liver disease pathological mechanism[J].ChinPharmacolBull,2015,31(8): 1057-61.

Effects of rifampicin on hepatotoxicity and genes related to bile acid metabolism in mice

XU Yong-ji, LI Wen-kai, LIU Jie, LU Yuan-fu

(KeyLabofBasicPharmacologyofMinistryofEducation,ZunyiMedicalCollege，ZunyiGuizhou563000，China)

Abstract：AimTo examine liver damage by rifampicin and hepatic gene expression related to bile acid metabolism in mice.MethodsAdult male mice were given rifampicin(180 mg·kg-1, po) daily for 30 days and(90 mg·kg-1, po) daily for 90 days, blood biochemistry, histopathology, and gene expression were examined.ResultsRifampicin increased animal liver index and serum enzyme activities. Histopathology showed steatosis and spotted feathery-like degeneration. Rifampicin increased the expression of CYP7A1 after 30 and 90 days of administration, along with increased FXR and SHP. Rifampicin reduced the expression of BSEP after 30 days of high dose administration.ConclusionRepeated administration of rifampicin may cause liver injury and intrahepatic cholestasis in mice, and these effects are associated with the alteration of gene expression related to bile acid metabolism.

Key words:rifampicin; hepatotoxicity; bile acid metabolism; cholestasis ; CYP7A1; BSEP

收稿日期：2016-01-22，修回日期：2016-04-01

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81460632)

作者簡介：徐永吉(1990-)，男，碩士生，研究方向：藥代動力學(xué)與藥物毒理學(xué)，E-mail：408968436@qq.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.020

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0841-05

中國圖書分類號：Q-485；R-332；R-333.4；R-961

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.040.html

陸遠(yuǎn)富(1971-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師,研究方向：藥物代謝與毒理學(xué),通訊作者，E-mail： yflu@zmc.edu.cn