斯皮熱古麗·阿布都卡地，阿里木·帕塔爾，古孜力克孜·阿布都克熱木

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院、2.中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊　830011)

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基于NMR的免疫抑制小鼠模型血清代謝組學(xué)研究

斯皮熱古麗·阿布都卡地1，阿里木·帕塔爾2，古孜力克孜·阿布都克熱木1

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院、2.中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830011)

摘要:目的采用核磁共振氫譜(1H-NMR)代謝組學(xué)技術(shù)分析免疫抑制小鼠血清代謝物變化特點(diǎn)。方法將20只KM小鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，模型組用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型，對(duì)其血清進(jìn)行1H-NMR檢測，采用正交偏最小二乘判別法(OPLS-DA)對(duì)NMR圖譜進(jìn)行分析，并確定兩組小鼠血清差異性代謝物。結(jié)果與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清谷氨酰胺、糖蛋白、不飽和脂類、VLDL、LDL、丙酮含量減少，亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、蛋氨酸、纈氨酸、β-羥丁酸和肉堿含量增多。結(jié)論免疫抑制小鼠體內(nèi)存在代謝網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)，具體表現(xiàn)為脂肪酸β-氧化、糖酵解和蛋白質(zhì)分解過程加劇，脂肪動(dòng)員被抑制。

關(guān)鍵詞:環(huán)磷酰胺；免疫抑制；特異性代謝物；代謝組學(xué)；小鼠；氫譜核磁共振

已有資料顯示，許多疾病的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能紊亂有關(guān)，免疫功能的失調(diào)往往導(dǎo)致機(jī)體各種組織器官的損傷[1]。目前，在免疫學(xué)研究領(lǐng)域上，常用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)復(fù)制免疫抑制動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)一些中西醫(yī)藥物對(duì)免疫功能紊亂性疾病的療效，但是Cy導(dǎo)致免疫抑制的物質(zhì)基礎(chǔ)及全身代謝變化特點(diǎn)還不清楚。代謝組學(xué)(metabonomic)是研究生物體內(nèi)源性某些特殊意義的代謝產(chǎn)物的質(zhì)和量的變化規(guī)律，從微觀角度區(qū)分不同的代謝狀態(tài)，并根據(jù)不同的代謝表型區(qū)分出不同的內(nèi)外因素對(duì)機(jī)體的作用方式，反映機(jī)體內(nèi)生理和病理變化過程[2-3]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用1H核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)，觀察Cy誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠血清中特異性代謝物，從代謝水平探討該模型的形成機(jī)制，期望能為以后的臨床診斷和療效評(píng)價(jià)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物6周齡SPF級(jí)♂昆明小鼠20只，平均體質(zhì)量為(20±2)g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2011-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施許可證號(hào)：SYXK(新)2011-0001。

1.1.2儀器設(shè)備Inova600 MHz 超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)；低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.1.3藥物與試劑Cy購自Sigma公司；重水(Deuterium oxide)購自北京百靈威科技有限公司；氯化鈉分析純(NaCl)購自天津永晟精細(xì)化工有限公司；磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；抗小鼠CD4(FITC標(biāo)記)、CD8(PE/cy5標(biāo)記)的熒光抗體，購自Biolegend公司；紅細(xì)胞裂解液購自Beckman Coulter公司；磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1分組與造模將20只♂ KM小鼠，隨機(jī)分成正常組和模型組，各組10只。動(dòng)物模型的建立參照文獻(xiàn)[4]，以小劑量多次給藥方式進(jìn)行，即正常組腹腔注射生理鹽水，模型組將Cy以50 mg·kg-1的量連續(xù)腹腔注射7 d造模，造模成功后，以40 mg·kg-1的量每5 d腹腔注射1次維持免疫低下模型，并連續(xù)到30 d。

1.2.2確認(rèn)造模成功

1.2.2.1T細(xì)胞亞群(CD4+T、CD8+T、CD4/CD8)的測定[5]采眼靜脈血至EDTA抗凝管中，并取100 μL抗凝血，分別加0.5 μL和1.25 μL的CD4、CD8熒光抗體，室溫孵育30 min后，加0.5 mL紅細(xì)胞裂解液作用5～10 min，血液變透明后加1 mL PBS溶液離心(1 000 r·min-1，5 min)，棄上清，再加0.5 mL PBS溶液重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3代謝組學(xué)檢測及分析[6]

1.2.3.1至樣品的采集與處理小鼠空腹12 h后，采眼靜脈血至離心管中，并以3 000 r·min-1的速度離心10 min分離血清，取200 μL血清，混于400 μL 的磷酸緩沖液(用重水將0.9 g的NaCl、0.8298 g的K2HPO4、0.1418 g的NaH2PO4配成100 mL，pH值為7.4)，室溫放置10 min后，低溫離心機(jī)4℃，10 000 r·min-1的速度離心10 min，取550 μL上清液加入到5 mm核磁管中。

1.2.3.2血清1H-NMR譜圖測定將Inova 600型核磁共振波譜儀調(diào)用弛豫編輯脈沖序列(Carr-Purcell-Meiboom-Gill,CPMG脈沖序列)(relaxation delay-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)進(jìn)行測定。測定條件與參考文獻(xiàn)推薦的步驟[6]一致，采用預(yù)飽和方式抑制水峰。選出在一維譜中質(zhì)量較好的樣品進(jìn)行二維譜測試，指認(rèn)譜網(wǎng)中各種峰。

1.2.3.3氫譜數(shù)據(jù)分析和代謝標(biāo)志物鑒定采用線寬為0.3Hz的指數(shù)窗函數(shù)，對(duì)血清1H-NMR圖譜進(jìn)行傅里葉變換后，用Topspin2.0軟件進(jìn)行基線校正，并以a-D葡萄糖5.233 ppm的質(zhì)子信號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)。對(duì)CPMG數(shù)據(jù)將范圍為δH=9.0～0.5 ppm區(qū)域的所有圖譜以每0.003 ppm段設(shè)為一個(gè)積分段進(jìn)行自動(dòng)積分，并刪掉在5.21～4.68 ppm范圍內(nèi)的水峰區(qū)域。將剩余積分值進(jìn)行歸一化處理之后，用SIMCA-P+11軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA分析)，并通過自動(dòng)規(guī)格化處理(UV)進(jìn)行模式質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體用R2X、R2Y、Q2等指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，其中R2X表示X的變異百分比，R2Y表示Y的變異百分比，Q2表示累計(jì)預(yù)測結(jié)果的真實(shí)性，即Q2>0.4時(shí)認(rèn)為預(yù)測結(jié)果可接受，Q2>0.9時(shí)預(yù)測結(jié)果更可靠。根據(jù)最小樣本量(本次實(shí)驗(yàn)中由于模型組中3只小鼠死亡，最小樣本量定為7只)將OPLS-DA分析所得相關(guān)系數(shù)|r|值的顯著性閾值定為0.707，如|r|>0.707可視為該代謝物在兩組間差異有顯著性(P<0.05)，|r|越接近于l表示其差異性越大，反之越小，相關(guān)系數(shù)的正值或負(fù)值表示代謝物的增多或減少趨勢。

2結(jié)果

2.1兩組小鼠T細(xì)胞亞群的比較

Tab 1結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠CD4+T細(xì)胞百分率和CD4/CD8比值明顯降低(P<0.05)，提示造模成功。

GroupCD4+T/%CD8+T/%CD4/CD8Control38.44±3.718.59±1.414.57±0.81Model25.44±3.939.71±2.112.73±0.68t7.6051.3995.511P0.0000.1790.000

2.2兩組小鼠血清1H-NMR譜的OPLS-DA分析結(jié)果

從OPLS-DA分析得到的平面分布圖和3D空間分布圖可見，所有樣本均分布在95%的置信區(qū)間內(nèi)，兩組分布區(qū)域完全分開，而且該分析模型具有很好的可解釋性(R2X=0.375，R2Y=0.921)及可預(yù)測性(Q2=0.616)，因此認(rèn)為兩組的血清代謝物有一定差異性(Fig 1)。根據(jù)OPLS-DA分析所得的相關(guān)系數(shù)，確定兩組小鼠血清差異性代謝成分的化學(xué)位移與差異程度，即與正常組比較，有差異代謝物的相關(guān)系數(shù)正值表示該代謝物在模型組小鼠血清中為升高的代謝物，反之亦然。從Tab 2可看出，與正常組比較，模型組小鼠血清中亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、蛋氨酸、纈氨酸、β-羥丁酸、肉堿、色氨酸等代謝物含量增多，糖蛋白、不飽和脂類、丙酮、VLDL、LDL、谷氨酰胺含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的治療惡性腫瘤的一種烷化劑，其通過與DNA非特異性的結(jié)合，使DNA變形、失活，表現(xiàn)出非特異性細(xì)胞毒性作用，特別是對(duì)骨髓造血組織、淋巴組織等增殖分化較快組織的細(xì)胞毒性作用較大，能通過影響DNA合成進(jìn)而抑制RNA和蛋白質(zhì)合成，此外，還具有很強(qiáng)的肝腎毒性[7]。本次實(shí)驗(yàn)中免疫抑制模型小鼠體內(nèi)谷氨酰胺、糖蛋白、不飽和脂類、VLDL、LDL、丙酮、亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、蛋氨酸、纈氨酸、β-羥丁酸和肉堿等17種代謝物均發(fā)生變化，而這些代謝物的改變一定程度上反映了Cy在小鼠體內(nèi)誘發(fā)的一系列病理變化過程。

Fig 1　OPLS-DA score plot(A) and 3D plot (B) derived from1H-NMR spectra of serum in normal group(■) and Cy model group(●)

Tab 2　Main differences of serous metabolites and their correlation coefficient in two groups of mice

S:singlet; d:doublet; dd:doublet of doublets; m:multiplet; q:quartet

谷氨酰胺是體內(nèi)許多組織合成的非必需氨基酸，其具有減少組織、器官的自由基損傷，提高機(jī)體的抗氧化能力和保護(hù)腸道黏膜的作用[8]。因此，體內(nèi)谷氨酰胺含量的下降能加劇機(jī)體的氧化損傷和免疫力的進(jìn)行性下降。糖蛋白參與細(xì)胞識(shí)別功能的同時(shí)，也是細(xì)胞造血等機(jī)體生理功能中必不可少的蛋白質(zhì)，具有保護(hù)上皮細(xì)胞的完整性、增加淋巴細(xì)胞數(shù)和增強(qiáng)免疫力的功能[9]。糖蛋白的下降表示上皮細(xì)胞受到損傷?？偟膩碇v，血清中谷氨酰胺、糖蛋白含量的下降是細(xì)胞膜受到損傷，機(jī)體自由基損傷加重，免疫力下降的預(yù)示。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠血清谷氨酰胺和糖蛋白含量降低，明確顯示出Cy的免疫抑制作用。另外，模型組小鼠血清中亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、色氨酸和丙氨酸含量增多，提示這些氨基酸是在機(jī)體免疫力降低等高分解狀態(tài)下形成量增多[10]，表明Cy引起的細(xì)胞損傷加速了蛋白質(zhì)的分解而抑制了蛋白質(zhì)的合成。

β-羥丁酸和丙酮是脂肪酸在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)β-氧化所產(chǎn)生的中間物，肉堿是脂肪酸β-氧化過程中將活化的脂酰CoA從細(xì)胞液轉(zhuǎn)入到線粒體必不可少的轉(zhuǎn)運(yùn)體[11-12]。丙酮可在一系列酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)楸峄蛉樗?，也可隨尿排出或經(jīng)肺呼出體外，而β-羥丁酸是酸性物質(zhì)，其含量的增多能導(dǎo)致酮癥酸中毒。因此，β-羥丁酸和肉堿含量的升高可預(yù)示體內(nèi)脂肪酸β-氧化過程的加劇。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠血清中β-羥丁酸、肉堿含量升高，丙酮含量減少，可認(rèn)為免疫抑制小鼠體內(nèi)脂肪酸β-氧化過程加劇。血清中的不飽和脂類、VLDL、LDL是脂肪分解的產(chǎn)物，其中VLDL是在肝細(xì)胞中生成，LDL是在血漿內(nèi)由VLDL轉(zhuǎn)變而產(chǎn)生[13]。分析血清中不飽和脂類、VLDL、LDL含量的降低可能是由于以下原因引起：① 體內(nèi)載脂蛋白質(zhì)合成減少，使肝細(xì)胞合成的三酰甘油不能及時(shí)釋放出血液內(nèi)；② 小鼠對(duì)脂類化合物利用率的下降；③ 肌酸具有降低膽固醇、極低密度脂蛋白和甘油三酯的作用[14]，因此肌酸含量的增多與VLDL和LDL含量的下降有關(guān)；④ 脂肪酸β-氧化過程的加劇使VLDL、LDL合成原料減少[15]。而體內(nèi)不飽和脂類、VLDL、LDL水平是反映機(jī)體脂肪動(dòng)員水平的重要指標(biāo)，因此模型組小鼠血清中不飽和脂類、VLDL、LDL含量的下降提示免疫抑制小鼠體內(nèi)脂肪動(dòng)員的抑制。

乳酸是糖酵解過程的終產(chǎn)物，在炎癥、吞噬細(xì)胞侵入、嚴(yán)重貧血、呼吸障礙、循環(huán)障礙、腎或肝等組織局部損傷或缺氧時(shí)，由于血管明顯擴(kuò)張，血管內(nèi)皮受損，大量的液體從血管內(nèi)滲出到組織間隙，產(chǎn)生局部供血不足和缺氧，導(dǎo)致機(jī)體糖酵解加速[16-17]。本次實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠體內(nèi)乳酸含量增多，可能是由于Cy骨髓抑制作用所誘發(fā)的貧血和肝腎組織損傷而引起的。當(dāng)然，脂肪酸β-氧化產(chǎn)物丙酮含量降低也對(duì)乳酸含量增多有一定影響。另外，脂肪、糖類和氨基酸均是通過各種反應(yīng)參與能量代謝，本實(shí)驗(yàn)中脂肪酸β-氧化和糖酵解過程的加劇[15]、脂肪動(dòng)員的抑制[18]可能預(yù)示免疫抑制小鼠體內(nèi)能量產(chǎn)生不足，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體長時(shí)間處于耗能狀態(tài)，這可能是Cy免疫抑制小鼠形體消瘦、懶怠的原因之一。

綜上，Cy引起免疫抑制的病理機(jī)制涉及到機(jī)體的氨基酸代謝、脂肪代謝、糖代謝和能量代謝的紊亂，表現(xiàn)出整體機(jī)能的平衡失調(diào)，使機(jī)體處于免疫功能紊亂的狀態(tài)。

(致謝：本次實(shí)驗(yàn)在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心和新疆醫(yī)科大學(xué)核磁共振實(shí)驗(yàn)室完成，在此特別感謝支持經(jīng)濟(jì)和學(xué)術(shù)指導(dǎo)方面的阿里木·帕塔爾教授，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的王忠老師和核磁共振實(shí)驗(yàn)室的巴吐爾·買買提明老師。)

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Metabolic analysis of immune suppression mice based on NMR

SIPIREGULI Abudoukadi1, ALIMU Pataer2, GUZILIKEZI Abudoukeremu1

(1.CollegeofPublicHealth, 2.CentralLaboratory,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:AimTo analyze the characteristics of serum metabolites in immune suppression mice by using1H NMR-based metabonomics.MethodsTwenty male Kunming(KM) mice were randomly divided into two groups: normal group and cyclophosphamide(Cy) model group. Cy model group was given Cy to induce immune suppression. NMR technology was used to find out the variability of serum metabolites by the method of OPLS-DA.ResultsCompared with normal group, Cy model group showed a significant decrease in the serum levels of glutamine, glycolprotein, unsaturated lipid, VLDL, LDL, acetone and showed a significant increase in the serum levels of leucine, alanine, tyrosine, histidine, lactate, glycine, creatine, metheionine, valine, β-hydrocxy butyrate and carnitine.ConclusionsImmune suppression mice are imbalanced in metabolic network. These findings indicate that lipid metabolism-related metabolites are decreased, however, β-oxidation of fatty acid, proteolysis and glycolysis level are increased.

Key words:cyclophosphamide; immune suppression;characteristic metabolites; metabonomics;; mice;1H-nuclear magnetic resonance

收稿日期:2016-01-28,修回日期:2016-02-27

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81360425)

作者簡介：斯皮熱古麗·阿布都卡地(1989-)，女，碩士生，研究方向：營養(yǎng)與健康，E-mail:416690633@qq.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.022

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0853-05

中國圖書分類號(hào)：R-332；R349.1；R363-332；R445.2；R446.11；R979.1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.044.html

阿里木·帕塔爾(1962-)，男，博士，教授， 研究方向：營養(yǎng)與健康,通訊作者,E-mail:alimpatar@sina.com