彭志鋒，　王喜英，　楊靖輝

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生理教研室， 2微生物與免疫學(xué)研究所，山西 大同 037009)

小鼠腦缺血時自噬相關(guān)基因5的抗損傷作用*

彭志鋒1△，王喜英2，楊靖輝1

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院1生理教研室，2微生物與免疫學(xué)研究所，山西 大同 037009)

[摘要]目的： 觀察自噬相關(guān)基因5(Atg5)在小鼠腦缺血再灌注損傷中的抗損傷作用。方法：將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組、Atg5 siRNA組和control siRNA組。I/R組采用大腦中動脈阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Atg5 siRNA組和control siRNA組將5 μL Atg5 siRNA或scrambled siRNA在MCAO前24 h側(cè)腦室注射。實時熒光定量PCR和Western blot檢測Atg5的表達(dá)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測抑制Atg5對缺血再灌注損傷后腦梗死面積和水腫率的影響；神經(jīng)行為學(xué)評分法檢測抑制Atg5對缺血再灌注損傷后神經(jīng)癥狀的影響。結(jié)果：MCAO后再灌24 h，缺血半影區(qū)Atg5 mRNA和蛋白水平顯著增高(P<0.05)；Atg5 siRNA明顯降低缺血再灌后Atg5 mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)；側(cè)腦室給予Atg5 siRNA能顯著增加腦梗死面積和水腫率，并加重神經(jīng)行為學(xué)損傷(P<0.05)。結(jié)論：沉默Atg5加重小鼠腦缺血再灌損傷，提示MCAO后誘導(dǎo)的 Atg5 可減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷。

[關(guān)鍵詞]自噬相關(guān)基因5； 自噬； 缺血再灌注損傷

缺血性腦血管疾病因其發(fā)病急，而且致殘致死率高，已經(jīng)成為危害人類健康的一類重大疾病[1]。在缺血性腦血管病治療過程中不可避免會出現(xiàn)再灌注損傷。然而，臨床上仍然缺乏有效的治療再灌注損傷的藥物和措施。

自噬是通過自噬溶酶體系統(tǒng)對自身細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異物、損傷和衰老細(xì)胞器進(jìn)行吞噬降解的過程，它可以使蛋白等能量物質(zhì)循環(huán)再利用，對細(xì)胞生長、器官正常發(fā)育具有重要的作用[2]。大量的研究顯示，在哺乳動物腦缺血模型中，包括缺氧-缺血和局灶或全腦缺血模型，都可誘發(fā)神經(jīng)元自噬[3-4]。自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5，Atg5)是參與自噬調(diào)控的重要基因，位于人類染色體6q21，編碼276個氨基酸[5]。Atg5定位于自噬體膜的表面，促進(jìn)了自噬體膜的伸展擴(kuò)張，誘導(dǎo)自噬體形成，是自噬體形成所須的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Atg5可導(dǎo)致小鼠自噬功能不全而于出生后數(shù)小時內(nèi)死亡[6]。最近我們的研究證實下調(diào)miR-181b減輕小鼠腦缺血性損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能是通過上調(diào)其靶基因Atg5發(fā)揮作用的[7]。然而Atg5在小鼠再灌注損傷中的作用未見相關(guān)報道。因而，本研究借助大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)致小鼠腦缺血模型，探討Atg5在小鼠再灌性損傷中的作用。

材料和方法

1動物和分組

健康成年(12～14周)、雄性BALB/c小鼠，體重18～22 g，購自首都醫(yī)科大學(xué)動物部，許可證號為SCXK-(軍)2007-004。將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)組、Atg5 siRNA組和control siRNA組。

2儀器和試劑

小鼠腦立體定位儀(北京沙東生物有限公司)；Mx3000PTM實時熒光定量PCR儀(Agilent)；Atg5 si-RNA和control siRNA(Ribobio)；兔抗Atg5多克隆抗體、鼠抗β-actin多克隆抗體(Sigma)；熒光定量PCR試劑盒(上海敏科生物科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)購自Sigma；基因特異性引物由上海生工合成。

3主要方法

3.1MCAO誘導(dǎo)局部腦缺血再灌模型制備腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.06 g/kg)麻醉小鼠，自頸部行1 cm長的正中縱切口，鈍性分離下頜下腺，暴露胸鎖乳突肌。手術(shù)顯微鏡下暴露左側(cè)頸動脈鞘并游離出頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，然后用5/0縫合絲線雙重結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠(yuǎn)心端；在頸總動脈上兩線結(jié)間打一松結(jié)并輕輕提起以阻斷血流，在頸外動脈遠(yuǎn)端的動脈壁上用針頭扎一個小口，將制備好的線栓(頭端直徑0.23 mm、主干直徑0.18 mm)從小孔插入頸總動脈至頸內(nèi)動脈并進(jìn)而向上到達(dá)大腦中動脈(直至遇到輕微阻力，深度約12.0 mm)，固定線栓，將下頜下腺歸位，60 min 后拔出線栓，縫合皮膚。模型成功的標(biāo)志是小鼠麻醉清醒后出現(xiàn)手術(shù)側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，小鼠可存活1周。MCAO手術(shù)成功率約為70%。Sham組只進(jìn)行手術(shù)操作，不插入線栓。整個手術(shù)過程平均20 min完成，此間保持小鼠體溫，術(shù)后放入有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進(jìn)食。

3.2側(cè)腦室給藥小鼠在MCAO手術(shù)前先經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于小鼠腦立體定位儀上，局部用利多卡因局麻后行正中切口，按Munoz側(cè)腦室注射方法[8]，以前囟為零點，在前囟后0.5 mm，左側(cè)1.0 mm和3.5 mm深度將5 μL的Atg5 siRNA(2 g/L)或scramble siRNA分別5 min內(nèi)注入小鼠左側(cè)腦室，注射完畢靜待5 min后輕輕地拔出微量注射器，注射結(jié)束后縫合頭部皮膚24 h再進(jìn)行MCAO模型制備。

3.3Western blot分析提取大腦缺血半影區(qū)[9]總蛋白，取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h后，并用磷酸鹽緩沖液(PBS-T)洗膜3次，每次10 min。用兔抗Atg5多克隆抗體(1∶1 000)和鼠抗β-actin多克隆抗體(1∶2 000) 4 ℃孵育3 h，PBS-T洗3次，每次10 min。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的 II 抗(1∶25 000)，室溫孵育1 h。PBS-T洗3次，每次5 min。洗膜后用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測并攝片，以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用圖像分析軟件Quantity One進(jìn)行吸光度積分值分析。

3.4實時熒光定量PCR首先用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取大腦缺血半影區(qū)總RNA，應(yīng)用miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再用特異性引物進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Atg5的上游引物序列為5’-TGGCCTACTGTTCGATCTTCT-3’， 下游引物序列為5’-ACAGTGCAGAAGGTCCTTTTC-3’；beclin-1的上游引物序列為5’-CTGATGGTGGCACCATGGA-3’， 下游引物序列為5’-GCCAGACATGATGTCAAAAAG-3’。通過分析軟件得到每組的Ct值，其中U6 RNA作為內(nèi)參照；參照文獻(xiàn)報道的方法，按下述公式進(jìn)行比較不同處理后基因相對表達(dá)的計算：相對基因表達(dá)=2-(ΔCt sample-ΔCt control)[10]。

3.5神經(jīng)行為學(xué)評價 MCAO后再灌24 h，根據(jù)文獻(xiàn)報道方法[11]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，觀察性評價指標(biāo)包括運動減少、姿勢側(cè)傾、拖地步態(tài)、共濟(jì)失調(diào)等；操作性評分指標(biāo)包括低反應(yīng)性、前肢屈曲、肌肉強(qiáng)度降低、身體旋轉(zhuǎn)和運動失調(diào)等。分值越高，代表損傷越嚴(yán)重。

3.6TTC染色神經(jīng)行為學(xué)評分后，將小鼠迅速斷頭取腦，-20 ℃冷凍約15 min后行厚1.5 mm的冠狀切片，將腦片迅速置于1%的TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光孵育約10 min，正常腦組織染為深紅色，腦梗死區(qū)不著色(灰白色)。根據(jù)文獻(xiàn)報道計算腦梗死體積以及水腫率[12]。

4統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1小鼠腦缺血再灌注損傷后自噬調(diào)節(jié)基因表達(dá)的變化

與sham組相比，I/R組的Atg5和beclin-1 mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.05)。Atg5 siRNA組小鼠Atg5 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而beclin-1 mRNA的表達(dá)無明顯變化，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of Atg5 and beclin-1 in defferent groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖1不同組間Atg5和beclin-1的mRNA表達(dá)情況

2小鼠腦缺血再灌注損傷后Atg5蛋白水平表達(dá)的變化

與sham組相比，I/R組Atg5表達(dá)顯著增高(P<0.05)；MCAO手術(shù)前側(cè)腦室注射Atg5 siRNA后， Atg5蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；control siRNA組Atg5蛋白表達(dá)與sham組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

Figure 2.The protein expression of Atg5 in defferent groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖2不同組間Atg5蛋白的表達(dá)情況

3Atg5 siRNA對MCAO后小鼠神經(jīng)行為損傷的影響

缺血再灌24 h后對小鼠的神經(jīng)行為表現(xiàn)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)sham組小鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)基本正常，神經(jīng)行為學(xué)評分為2.1±0.9。缺血再灌性損傷使小鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，具體表現(xiàn)為活動減少、側(cè)傾、轉(zhuǎn)圈、低反應(yīng)性、前肢屈曲和運動失調(diào)等，神經(jīng)行為學(xué)評分上升為8.5±0.2(P<0.05)。MCAO手術(shù)前側(cè)腦室注射Atg5 siRNA使行為學(xué)損傷進(jìn)一步加重，行為學(xué)評分上升至11.5±0.3，與I/R組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　各組神經(jīng)行為學(xué)評分

The percentage indicated the proportion of the positive behaviors showed up in different groups.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

4Atg5 siRNA對MCAO后小鼠腦梗死體積和水腫率的影響

TTC染色發(fā)現(xiàn)，sham組全腦切片染色為均勻紅色，無缺血灶。I/R組有明顯的小鼠局灶性腦缺血[(36.3±0.9)%]，此外，小鼠缺血側(cè)皮層發(fā)生了明顯的水腫[(11.2±0.5)%]。與前述神經(jīng)評分檢測結(jié)果一致，側(cè)腦室注射Atg5 siRNA后，抑制自噬的保護(hù)作用并使梗死體積[(47.2±1.3)%]和水腫率[(17.1±0.8)%]明顯增加(P<0.05),見圖3。

Figure 3.The effects ofAtg5 siRNA on infarct volume and edema ratio in the mouse brain after MCAO. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsI/R.

圖3沉默Atg5對MCAO后小鼠腦梗死體積和水腫率的影響

討論

本研究結(jié)果顯示，小鼠腦缺血再灌注損傷后半影區(qū)Atg5和beclin-1 mRNA的表達(dá)增加，Atg5 siRNA降低Atg5 mRNA的表達(dá)。與此同時，缺血再灌后Atg5蛋白表達(dá)水平增高，Atg5 siRNA也可降低Atg5蛋白表達(dá)。Atg5 siRNA使MCAO后神經(jīng)行為學(xué)損傷進(jìn)一步加重。Atg5 siRNA也使缺血再灌后腦梗死體積和水腫率明顯增加。上述結(jié)果表明Atg5在小鼠腦缺血再灌性損傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用。

缺血性腦損傷，包括缺血核心區(qū)及其周圍的缺血半影區(qū)。缺血半影區(qū)是由側(cè)枝循環(huán)提供的血液低灌注區(qū)域，部分地維持了神經(jīng)細(xì)胞代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，主要以細(xì)胞凋亡、自噬等為主，但在一定時間內(nèi)仍具有代謝活性，其損害是可逆的，能夠通過及時治療得到挽救[13]。有研究報道，新生大鼠缺氧缺血后beclin-1蛋白水平和陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增高和增加，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤和渥曼青霉素可加速神經(jīng)細(xì)胞壞死，而應(yīng)用自噬激活劑雷帕霉素可減少細(xì)胞壞死并減輕腦損傷，提示自噬具有神經(jīng)元保護(hù)作用[14]。Koike等[15]在新生和成年小鼠缺氧缺血模型中發(fā)現(xiàn)，LC3-II蛋白水平顯著升高，電子顯微鏡顯示海馬錐體細(xì)胞層自噬體形成以及海馬神經(jīng)元廣泛死亡，而Atg7基因缺陷小鼠的神經(jīng)元死亡顯著減少，說明自噬參與了缺氧缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。而本實驗中Atg5蛋白水平顯著升高，干擾Atg5后小鼠腦梗死體積和水腫率顯著增加。結(jié)果的差異可能是由于實驗動物、缺血模型及對自噬的抑制靶點不同。

Atg5是參與自噬調(diào)控的重要基因，Atg5在自噬體形成前期參與形成了自噬共軛連接體Atg12～Atg5從而促進(jìn)了自噬體膜結(jié)構(gòu)的延伸和自噬體的形成。在酵母和哺乳動物中敲除Atg5基因能阻滯自噬進(jìn)程[16]。也有研究對自噬基因Atg5缺陷鼠實施中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血-缺氧實驗，與無基因缺陷鼠進(jìn)行比較，結(jié)果顯示基因缺陷鼠不發(fā)生自噬并且大腦和小腦大部分皮質(zhì)神經(jīng)元死亡，說明Atg5可能通過調(diào)節(jié)自噬對神經(jīng)元起保護(hù)作用[17]。我們的研究通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)缺血小鼠腦內(nèi)Atg5的表達(dá)，可以減輕MCAO后再灌注腦損傷。這是首次明確Atg5在小鼠再灌注腦損傷中的作用。

總之，我們的研究證實Atg5 siRNA可能通過抑制自噬而加重小鼠再灌注腦損傷。然而，由于缺血時間、部位以及干預(yù)時間窗的影響，自噬在腦缺血后神經(jīng)元死亡中的作用仍需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]郭倩，余音，潘乾廣，等. 白藜蘆醇保護(hù)腦缺血轅再灌注損傷與自噬關(guān)系的研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2013, 29(7):995-998.

[2]蘇靜緣，趙瑞波. 腦缺血自噬研究進(jìn)展[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 29(1):151-153.

[3]Su J, Zhang T, Wang K, et al. Autophagy activation contributes to the neuroprotection of remote ischemic perconditioning against focal cerebral ischemia in rats[J]. Neurochem Res, 2014, 39(11):2068-2077.

[4]Zhang X, Yan H, Yuan Y, et al. Cerebral ischemia-reperfusion induced autophagy protects against neuronal injury by mitochondrial clearance[J]. Autophagy, 2013, 9(9):1321-1333.

[5]Yousefi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis[J]. Nat Cell Biol, 2006, 8(10):1124-1132.

[6]Kuma A, Hatano M, Matsui M, et al. The role of autophagy during the early neonatal neonatal starvation period[J]. Nature, 2004, 432(7020):1032-1036.

[7]彭志鋒. 下調(diào)miR-181b在小鼠缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(2):224-228.

[9]Ashwal S,Tone B,Tian HR, et al.Core and penumbral nitric oxide synthase activity during cerebral ischemia and reperfusion[J]. Stroke,1998,29(5):1037-1046.

[10]Rogaev EI. Small RNAs in human brain development and disorders[J]. Biochemistry (Mosc), 2005, 70(12):1404-1407.

[11]劉旭，封素娟，張彩艷，等. 低氧預(yù)適應(yīng)對小鼠缺血腦的保護(hù)及其p38 MAPK機(jī)制的實驗研究[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2009, 30(5):643-647.

[12]江君，楊巍巍，張楠，等. 低氧預(yù)適應(yīng)減輕腦中動脈阻塞所致小鼠缺血性腦損傷[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2009, 29(2):113-118.

[13]Xu M, Zhang HL. Death and survival of neuronal and astrocytic cells in ischemic brain injury: a role of autophagy[J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(9): 1089-1099.

[14]Carloni S, Buonocore G, Balduini W. Protective role of antophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury[J]. Neurobiol Dis, 2008, 32(3):329-339．

[15]Koike M, Shibata M, Tadakoshi M,et al. Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic-ischemic injury[J]. Am J Pathol, 2008, 172(2):454-469.

[16]Mizushima N, Su ta H, Yoshimori T, et al. A new protein conjugation system in human: the counterpart of the yeast Apg12p conjugation system essential for autophagy[J]. Biol Chem, 1998, 273(51):33889-33892.

[17]Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice[J]. Nature, 2006, 441(7095):885-889.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Knockdown of Atg5 aggravates cerebral ischemia and reperfusion injury in mice

PENG Zhi-feng1, WANG Xi-ying2, YANG Jing-hui1

(1DepartmentofPhysiology,2InstituteofMicroorganismandImmunology,SchoolofMedicine,ShanxiDatongUniversity,Datong037009,China.E-mail:pzf181@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the role of autophagy-related gene 5 (Atg5) in cerebral ischemia and reperfusion injury in mice. METHODS: BALB/c male mice (weighing 18～22 g) were randomly divided into sham group, ischemia/reperfusion (I/R) group, Atg5 siRNA group and control siRNA group. Focal cerebral ischemia was performed using the method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 60 min and reperfusion for 24 h. In siRNA group and control group, 5 μL Atg5 siRNA or scrambled siRNA was administered by intracerebroventricular injection 24 h before MCAO. The expression of Atg5 at mRNA and protein levels in ischemic cortex at 24 h after reperfusion was determined by real-time PCR and Western blot. The infarct volume and edema were evaluated by TTC staining, and motor deficits were evaluated by neurological scoring. RESULTS: The expression of Atg5 at mRNA and protein levels was significantly increased 24 h after reperfusion in I/R group compared with sham group. Atg5 siRNA obviously decreased the expression of Atg5 at mRNA and protein levels induced by I/R. Inhibition of Atg5 exacerbated the infarct volume and ameliorated the neurological symptoms. CONCLUSION: Atg5 has neuroprotective effect on focal cerebral ischemia and reperfusion injury.

[KEY WORDS]Autophagy-related gene 5; Autophagy; Ischemia-reperfusion injury

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0064- 05

[收稿日期]2015- 06- 25[修回日期] 2015- 10- 11

*[基金項目]山西大同大學(xué)博士科研啟動經(jīng)費;山西省基礎(chǔ)研究項目(No.2015021178)

通訊作者△Tel: 0352-6205665; E-mail: pzf181@126.com

[中圖分類號]R363.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.011