李　艷 ，王　嶺 ，孫　麗，陳　晶 ，李海燕 ，王　超 ，房　雷

黃芪注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷VEGF及VEGFR2表達的影響

李艷 ，王嶺 ，孫麗，陳晶 ，李海燕 ，王超 ，房雷

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(山東青島 266042)

摘要：目的探討黃芪注射液對大鼠腦缺血/再灌注損傷后細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR2)表達的影響。方法應(yīng)用線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO/R)模型，經(jīng)腹腔注射黃芪注射液(6 mL/kg)干預(yù)治療。Longa法評價大鼠神經(jīng)行為功能，蘇木精-伊紅染色觀察大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)，原位末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡，免疫組化和蛋白印跡法定性和定量檢測VEGF及VEGFR2蛋白表達，熒光定量PCR檢測VEGF及VEGFR2基因的表達。結(jié)果經(jīng)黃芪注射液治療后，大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)VEGF及VEGFR2蛋白和VEGF及VEGFR2 mRNA表達較對照組明顯增強，細(xì)胞凋亡顯著減少，動物神經(jīng)行為功能顯著改善。結(jié)論黃芪注射液可通過上調(diào)VEGF及VEGFR2的表達而抑制細(xì)胞凋亡，促進受損的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，改善動物的神經(jīng)行為功能。

關(guān)鍵詞：腦缺血；再灌注損傷；凋亡；黃芪注射液；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子受體；大鼠

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有促進內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和新血管生成的作用[1]。何佳等[2]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷時VEGF活化刺激VEGF受體(VEGFR2) 表達上調(diào)，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速新生血管形成。許多證據(jù)表明，VEGF具有神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護、抗凋亡、促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活等生物學(xué)作用[3-4]。Yang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，缺血3 h以內(nèi)應(yīng)用VEGF治療能夠減少腦缺血/再灌注后神經(jīng)元損傷，可用于人類急性腦卒中的治療。Li等[6]研究指出，VEGFR2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路在促進缺血后神經(jīng)血管的重塑中起著重要作用，并且將血管發(fā)生和神經(jīng)形成聯(lián)系在一起。因此，增加腦缺血/再灌注損傷后VEGF及VEGFR的表達，可能成為缺血缺氧性腦損傷治療的重要途徑。

中藥黃芪具有補氣升陽、利水退腫等功效，黃芪甲苷是中藥黃芪中提取皂苷的主要成分，在臨床上用于治療冠心病、心肌炎等疾病具有良好的療效[7]。黃鑫等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以促進內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的增殖和黏附能力，對EPCs具有保護作用。余勤等[9]研究指出，黃芪注射液能夠誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞并能協(xié)同骨髓干細(xì)胞促進脊髓損傷的修復(fù)。曲友直等[10-11]研究表明，黃芪注射液的主要成分黃芪甲苷能減少大鼠腦缺血/再灌注后腦組織中細(xì)胞浸潤，減輕炎癥反應(yīng)和腦水腫，但腦保護作用的機制還不十分清楚[12-13]。本實驗擬觀察黃芪注射液對腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡和VEGF及其受體VEGFR2表達的影響，進一步探討其神經(jīng)保護作用機制。

1材料與方法

1．1動物模型和分組成年雄性Wistar大鼠40只(SPF級，體重230 g～250 g)，由青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供(SCXK20090007)。動物置實驗室環(huán)境適應(yīng)7 d，自由飲食。隨機選擇10只為對照組，其余30只應(yīng)用線栓法經(jīng)右側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立MCAO/R模型[14]，缺血2 h后退出插線實現(xiàn)再灌注。對照組手術(shù)步驟相同，但插線進入頸內(nèi)動脈10 mm后即刻退出。動物蘇醒后出現(xiàn)右側(cè)Horner征，提尾左前肢內(nèi)收屈曲、爬行時向右側(cè)劃圈者為成功模型。將造模不成功及術(shù)后2 h死亡的10只動物剔除，成功的20只再隨機分為模型組(10只)和治療組(10只)。

1．2治療方案黃芪注射液(國藥準(zhǔn)字Z31020084)。在劉莎莎等[15]報道的劑量上加以改進，治療組動物在造模成功后2 h，經(jīng)腹腔注射黃芪注射液6 mL/kg，之后每隔24 h給藥1次，給藥2次。對照組和模型組同步給予等量生理鹽水。

1．3評級指標(biāo)

1．3．1神經(jīng)行為功能評分末次給藥24 h后，所有大鼠(n=30)參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)[16]進行神經(jīng)行為功能評分，評分越高表示神經(jīng)行為功能損傷越嚴(yán)重。

1．3．2蘇木精-伊紅(HE)染色末次給藥24 h后，每組隨機選取5只動物以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，依次經(jīng)心臟灌注生理鹽水250 mL和4%多聚甲醛溶液250 mL，斷頭取腦，置4%多聚甲醛溶液固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木精伊紅染色。顯微鏡下觀察皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)改變。

1．3．3TUNEL檢測細(xì)胞凋亡按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，中國)說明操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，以新配制的1%TritonX-100通透液促滲(3～5)min，新配制的3% HO2封閉液室溫下封閉10 min。每個樣本上滴加100 μL稀釋的蛋白酶K工作液(Proteinase K)，37 ℃消化10 min。滴加TdT酶反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)60 min，滴加Streptavidin-FITC標(biāo)記工作液，37℃避光反應(yīng)30 min，進行熒光標(biāo)記。配制POD-conjugated Anti-FITC 工作液，滴加到每張切片上37 ℃避光反應(yīng)30 min，進行POD標(biāo)記。DAB顯色1 min，光學(xué)顯微鏡(Olympus CK2，Japan)下觀察。細(xì)胞核呈棕黃色為陽性細(xì)胞，陰性對照不加TdT，不出現(xiàn)陽興著色。每只動物取4張切片，高倍鏡下(400倍)隨機選取皮質(zhì)區(qū)不重疊的4個視野細(xì)胞計數(shù)，以陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例為凋亡指數(shù)。

1．3．4免疫組化檢測VEGF、VEGFR2蛋白表達應(yīng)用兔抗鼠VEGF單克隆抗體(Millipore)、VEGFR2單克隆抗體(abcam)和SABC試劑盒(武漢博士德生物工程公司，中國)。鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性染色。紫外分光光度儀測定細(xì)胞VEGF和VEGFR2表達產(chǎn)物的吸光度值。以細(xì)胞層吸光度值減去背景吸光度值表示神經(jīng)細(xì)胞VEGF和VEGFR2表達強度。每只大鼠選取4張切片，每張切片選取腦組織4個不重疊視野。

1．3．5Western blot定量檢測VEGF、VEGFR2蛋白表達末次給藥24 h后，取腦組織100 mg，按100 mg組織1 mL RIPA組織裂解液∶1 μL PMSF的比例加入組織裂解液(北京蓋寧科技有限公司)，取上清液于EP管中，取100 μL用BCA蛋白濃度試劑盒(北京索萊寶公司)測定樣品總蛋白濃度。以凝膠成像系統(tǒng)顯影，Quantity one軟件分析條帶灰度值。以同一標(biāo)本β-actin的灰度值作為內(nèi)參照，校正目的蛋白的灰度值，按公式計算相對值，重復(fù)測定3次。

1．3．6熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測VEGF、VEGFR2基因表達取上述缺血側(cè)腦組織100 mg，Trizol法抽提總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度。由軟件分析目的基因(VEGF、VEGFR2)和GAPDH基因的擴增曲線，得到各試驗孔的Ct值，并以同一樣本中的GAPDH Ct值作為內(nèi)參，按照公式2-ΔΔCt=2-[(實驗組目的基因Ct-實驗組GAPDH Ct)-(對照組目的基因Ct-對照組GAPDH Ct)]計算各實驗組的2-ΔΔCt值，將對照組的2-ΔΔCt值設(shè)為1，實驗組與之相比，進行相對定量。

2結(jié)果

2．1神經(jīng)行為功能評分對照組動物L(fēng)onga法評分0分，模型組動物評分(2．33±0．52)分，較對照組顯著升高(t=11．06，P<0．05)，治療組動物L(fēng)onga法評分(1．67±0．41)為較模型組顯著降低(t=2．24，P<0．05)。

2．2組織病理改變HE染色顯示，對照組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列整齊，層次清楚，著色均勻。模型組神經(jīng)元排列紊亂，部分細(xì)胞固縮、著色加深，變性壞死。治療組變性神經(jīng)元數(shù)量較模型組明顯減少。

2．3神經(jīng)元凋亡TUNEL染色顯示，對照組大腦皮質(zhì)可見少量凋亡神經(jīng)元，模型組神經(jīng)元凋亡指數(shù)較對照組明顯增高(t=6．20，P<0．05)，藥物干預(yù)治療后神經(jīng)元凋亡指數(shù)較模型組明顯減低(t=5．18，P<0．05)。詳見表1。

表1　各組大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和VEGF、VEGFR2表達強度比較(±s)

2．4免疫組化檢測VEGF、VEGFR2蛋白表達免疫組化顯示VEGF主要在皮質(zhì)區(qū)表達，對照組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞VEGF呈微弱表達，缺血/再灌注損傷后VEGF表達較對照組明顯增強(t=5．94，P<0．05)；治療組VEGF表達較模型組明顯增強(t=4．83，P<0．05)。 對照組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞VEGFR2呈微弱表達，缺血/再灌注損傷后VEGFR2表達較對照組明顯增強(t=4．29，P<0．05)；治療組VEGFR2表達較模型組明顯增強(t=3．87，P<0．05)。詳見表1。

2．5Western blot法檢測VEGF、VEGFR2蛋白表達Western blot法顯示，對照組VEGF蛋白形成較弱55kD片段；模型組VEGF蛋白表達較對照組增強(t=6．77，P<0．05)；治療組VEGF蛋白表達較模型組明顯增強(t=3．42，P<0．05)。對照組VEGFR2蛋白形成較弱152kD片段；模型組VEGFR2蛋白表達較對照A組增強(t=5．81，P<0．05)；治療組VEGFR2蛋白表達較模型組明顯增強(t=2．92，P<0．05)。詳見圖1。

與對照組比較，1)P<0．05；與模型組比較，2)P<0．05。

圖1Western blot法檢測VEGF、VEGFR2蛋白表達

2．6VEGF、VEGFR2基因的表達RT-PCR顯示，對照組VEGF mRNA(154 bp)表達較弱，將對照組的2-ΔΔCt值設(shè)為1，模型組和治療組分別與之相比，進行相對定量，模型組VEGF mRNA表達較對照組顯著增強(t=4．86，P<0．05)，治療組VEGF mRNA表達較模型組顯著增強(t=3．21，P<0．05)。對照組VEGFR2 mRNA(151bp)表達較弱，將對照組的2-ΔΔCt值設(shè)為1，模型組和治療組分別與之相比，進行相對定量，模型組VEGFR2 mRNA表達較對照組顯著增強(t=3．20，P<0．05)，治療組VEGFR2 mRNA表達較模型組顯著增強(t=2．40，P<0．05)。詳見表2。

表2　各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞VEGFmRNA和

3討論

缺血再灌注性腦損傷是導(dǎo)致死亡和殘疾的重要原因，黃芪注射液具有抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護的作用，可能成為治療缺血性腦損傷的一種新途徑[17-18]。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液能通過下調(diào)JNK3基因的表達，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減少梗死面積，改善神經(jīng)行為功能。Zhang等[20]研究證實，黃芪注射液可通過促進內(nèi)皮細(xì)胞依賴的與VEGF受體相關(guān)的磷脂酰肌醇3激酶/Akt途徑，刺激體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE)增殖，促進血管生成。Jin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是一種具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的血管生成蛋白，通過與VEGFR2受體相互作用刺激神經(jīng)發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，大鼠大腦缺血再灌注損傷后，大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元變性，神經(jīng)細(xì)胞凋亡，大鼠表現(xiàn)為行為功能障礙。同時大腦皮質(zhì)區(qū)VEGF及其受體VEGFR2蛋白和VEGF mRNA及VEGFR2 mRNA表達均增強，經(jīng)黃芪注射液治療后，大腦皮質(zhì)區(qū)VEGF及其受體VEGFR2蛋白和VEGF mRNA及VEGFR2 mRNA表達較對照組明顯增加，細(xì)胞凋亡顯著減少，動物神經(jīng)行為功能明顯改善。

黃芪注射液可通過增強VEGF和VEGFR2的表達，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善動物的神經(jīng)行為功能，這可能與VEGF、VEGFR2以及VEGF和VEGFR2之間的相互作用，誘導(dǎo)EPCs增殖與遷移，抑制缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或壞死，促進神經(jīng)和血管新生，改善神經(jīng)細(xì)胞的生存環(huán)境，促進神經(jīng)細(xì)胞的功能恢復(fù)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化成熟的功能有關(guān)，有望為治療腦缺血/再灌注損傷提供新的方法和途徑。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Astragalus Injection on the Expression of VEGF and VEGFR2 in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion Injury

Li Yan，Wang Ling，Sun Li，Chen Jing，Li Haiyan，Wang Chao，F(xiàn)ang Lei

The Second Affiliated Hospital of Medical College，Qingdao University，Qingdao 266003，Shandong，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of astragalus injection on neuronal apoptosis and the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) in rats with cerebral ischemia reperfusion injury． MethodsThe middle cerebral artery occlusion reperfusion (MCAO/R) rat models were established by inserting a filament suture from right external-internal carotid artery and treated with injecting astragalus injection (6 mL/kg) intraperitoneally． The neurobehavioral function of rats was evaluated with Longa’s test，the structural changes of neurons in the cortex was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining，neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining． Using immunohistochemistry as the quality analysis method and Western blot as the quantity analysis method to detect the expressions of VEGF and VEGFR2． The expressions of VEGF and VEGFR2 mRNA was determined by real-time PCR． ResultsAfter the treatment with astragalus injection，the expressions of VEGF and VEGFR2 proteins，VEGF and VEGFR2 mRNA in the cortex increased significantly than those in the control group，neuronal apoptosis was significantly reduced and the animal neurobehavioral function improved significantly． ConclusionAstragalus injection could inhibit apoptosis，promote the nerve repair and improve the neurobehavioral function of animas by up-regulated the expressions of VEGF and VEGFR2．

Key words：cerebral ischemia；reperfusion injury；apoptosis；astragalus injection；vascular endothelial growth factor；vascular endothelial growth factor receptor 2；rats

基金項目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(No．2011HW034)

通訊作者：孫麗，E-mail：sunli_qd@163．com

中圖分類號：R743R289

文獻標(biāo)識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．01．007

文章編號：1672-1349(2016)01-0025-04

Corresponding Author：Sun Li

(收稿日期：2015-01-25)