陳美華　張　燕　陳　偉　馬　健

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東　泰安　271016)

秦皮素對腦缺血再灌注損傷小鼠的保護作用

陳美華張燕陳偉馬健

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016)

〔摘要〕目的觀察秦皮素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。 方法采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型，秦皮素高、中、低3個劑量于造模前分別腹腔注射給藥，術(shù)后24 h及48 h,用跳臺法分別測定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，測定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)含量及髓過氧化物酶(MPO)活性，并測定Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性，HE染色觀察腦組織的病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低，秦皮素各劑量組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高(P<0.05)。秦皮素高、中、低劑量組可提高腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性，降低MDA含量和MPO活性，與模型組差異顯著(P<0.05)。秦皮素各劑量組可明顯提高腦組織Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性(P<0.05)。結(jié)論秦皮素對腦缺血再灌注損傷小鼠有保護作用，其機制與抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)及改善細(xì)胞能量代謝有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕秦皮素；腦缺血再灌注;氧化應(yīng)激：髓過氧化物酶;ATPase

腦缺血再灌注后自由基生成增多和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷的主要原因〔1〕。近年來，有研究表明香豆素類化合物有很好的抗炎作用及保護腦缺血性損傷的作用〔2〕。秦皮素是傳統(tǒng)中藥秦皮中的香豆素類化合物，來源于木犀科植物白蠟樹的樹皮。現(xiàn)代藥理研究表明，秦皮具有抗氧化，抗炎，抗菌，抗凝血和防治骨質(zhì)疏松等多種生物學(xué)活性〔3〕。近年來的研究主要集中在秦皮素的抗腫瘤和神經(jīng)保護作用〔4,5〕，本研究觀察秦皮素對腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織生化代謝的影響。

1材料與方法

1.1材料秦皮素，購自南京郎澤醫(yī)藥有限公司,純度98%；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒、ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;DT-200小鼠跳臺儀，成都泰盟科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物與分組實驗前1 d用跳臺法對小鼠進行篩選，淘汰對電擊反應(yīng)過于遲鈍或敏感的小鼠。將篩選合格小鼠隨機分成五組，每組10只，即假手術(shù)組，模型組及秦皮素高劑量組(20 mg/kg)，中劑量組(10 mg/kg)，低劑量組(5 mg/kg)，腹腔注射給藥，連續(xù)7 d，假手術(shù)組，模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2.2腦缺血再灌注模型的制備根據(jù)文獻〔6〕制備腦缺血再灌注小鼠模型，10%水合氯醛(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，將小鼠仰臥固定，切開頸部皮膚，分離兩側(cè)頸總動脈，縫合線牽拉，阻斷血流，每牽拉10 min松開10 min，反復(fù)3次后縫合皮膚，適宜條件飼養(yǎng)，假手術(shù)組只分離兩側(cè)頸總動脈但不阻斷血流。

1.2.3學(xué)習(xí)記憶能力測定〔7〕實驗時將小鼠放入跳臺儀內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境3 min,調(diào)節(jié)電壓為36 V，通電后小鼠受到電擊的正常反應(yīng)是跳上跳臺逃避電擊。學(xué)習(xí)成績用反應(yīng)時間(小鼠受到電擊后跳上跳臺的時間)和錯誤次數(shù)(5 min內(nèi)小鼠受到電擊的次數(shù))表示，24 h 后再次測試，將小鼠放在平臺上，開始通以電流，記錄小鼠的潛伏期(通電后第1次跳下平臺的時間)和錯誤次數(shù)(5 min 內(nèi)跳下平臺的次數(shù))作為記憶成績。

1.2.4腦組織生化指標(biāo)的測定取腦組織，用冰生理鹽水制備10%勻漿液，4℃、2 500 r/min,離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作步驟進行測定，蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.5腦組織形態(tài)學(xué)觀察 取視交叉部位腦組織，依次經(jīng)4%多聚甲醛固定，蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm,常規(guī)HE染色，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1學(xué)習(xí)記憶能力測試 缺血再灌注損傷組小鼠的跳臺測試中反應(yīng)時間延長，受到的電擊次數(shù)(錯誤次數(shù))增加，學(xué)習(xí)能力降低。記憶能力測定顯示，模型組小鼠記憶潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加，與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.05)，與模型組相比，秦皮素高，中劑量組均可改善腦缺血再灌注小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.05)，而秦皮素低劑量組效果不明顯，見表1。

表1　各組小鼠學(xué)習(xí)記憶成績

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；表2同

2.2腦組織SOD活性、MDA 含量和MPO活性模型組小鼠腦組織SOD活性降低，MDA 含量和MPO活性明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。與模型組比較，秦皮素高、中、低劑量組小鼠腦組織SOD活性升高，MDA 含量和MPO活性降低(P<0.05)，秦皮素各劑量組差別無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3秦皮素對小鼠腦組織Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影響與假手術(shù)組相比，模型組Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯降低，表明腦組織能量代謝異常。與模型組相比，秦皮素各劑量組腦組織Na+-K+-ATPase活性升高，秦皮素高、中劑量組腦組織Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高(P<0.05)，見表3。

2.4腦組織HE染色HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元排列正常，核仁明顯，未見神經(jīng)元壞死及中性粒細(xì)胞浸潤等明顯病理改變，模型組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，排列紊亂，出現(xiàn)程度不同的核深染，核固縮，核體不規(guī)則，秦皮素給藥組能減輕神經(jīng)元及細(xì)胞核的損傷，抑制局部組織壞死，提示秦皮素對腦缺血再灌注海馬區(qū)神經(jīng)元有保護作用，見圖1。

表2　秦皮素對小鼠腦組織中SOD活性，MDA

表3　各組小鼠Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

假手術(shù)組

模型組

高劑量組

中劑量組

低劑量組

圖1各組小鼠海馬HE染色(×400)

3討論

學(xué)習(xí)記憶功能障礙是缺血性腦血管疾病患者常見的臨床表現(xiàn)，本研究顯示，腦缺血再灌注損傷小鼠在跳臺測試中反應(yīng)時間延長，受到的電擊次數(shù)增加，記憶潛伏期縮短，學(xué)習(xí)記憶能力降低，預(yù)先給予秦皮素可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生是由多種機制參與的復(fù)雜病理生理過程，其中自由基的毒性作用和炎癥反應(yīng)是產(chǎn)生缺血再灌注損傷的關(guān)鍵性病理環(huán)節(jié)〔8〕。SOD具有顯著抗脂質(zhì)過氧化的作用，其活性與機體的抗氧化能力相關(guān)，MDA為脂質(zhì)過氧化過程中的最終分解產(chǎn)物。研究表明，秦皮素通過抗凋亡和抗氧化作用,具有保護魚藤酮誘導(dǎo)的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用〔9〕。本研究顯示，秦皮素能降低MDA含量，提高SOD活性，支持秦皮素的神經(jīng)保護作用與其抗氧化作用密切相關(guān)。中性粒細(xì)胞含有MPO，其活性程度主要反映中性粒細(xì)胞的浸潤程度，因而間接提示局部組織的炎性反應(yīng)程度，MPO可誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，促進炎癥效應(yīng)細(xì)胞的增殖與活化〔10〕。秦皮素預(yù)處理后腦組織MPO活性降低，提示秦皮素對缺血再灌注損傷后中性粒細(xì)胞浸潤為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)有明顯改善作用。能量代謝障礙是缺血性腦細(xì)胞損傷發(fā)生的另一關(guān)鍵環(huán)節(jié),而ATP酶活性的改變是神經(jīng)元損傷的重要環(huán)節(jié)〔11〕。Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase是存在于生物膜上的一種蛋白酶,在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要的作用,可維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡,維持細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性,已成為評價神經(jīng)元質(zhì)膜功能狀態(tài)的標(biāo)志之一〔12〕。模型組小鼠腦組織ATPase活性下降,神經(jīng)元質(zhì)膜的功能異常,引起細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+增加,從而誘發(fā)一系列病理生理反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明，秦皮素能明顯提高腦缺血小鼠腦組織Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase活性，提示秦皮素可改善腦組織的能量代謝，對腦缺血再灌注損傷起保護作用。本研究證實，秦皮素對腦缺血再灌注造成的學(xué)習(xí)記憶減退和組織損傷有明顯的保護作用，其機制涉及抗氧化，抑制炎癥反應(yīng)和改善腦組織能量代謝。

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〔2014-12-07修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：泰山醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金項目(No.2010ZR080)

〔中圖分類號〕R285

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2350-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.016

第一作者：陳美華(1977-)，女，講師，碩士，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究 。