陳美華　張　燕　陳　偉　馬　健

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東　泰安　271016)

秦皮素對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠的保護(hù)作用

陳美華張燕陳偉馬健

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016)

〔摘要〕目的觀察秦皮素對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。 方法采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型，秦皮素高、中、低3個(gè)劑量于造模前分別腹腔注射給藥，術(shù)后24 h及48 h,用跳臺(tái)法分別測定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，測定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)含量及髓過氧化物酶(MPO)活性，并測定Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性，HE染色觀察腦組織的病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低，秦皮素各劑量組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高(P<0.05)。秦皮素高、中、低劑量組可提高腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性，降低MDA含量和MPO活性，與模型組差異顯著(P<0.05)。秦皮素各劑量組可明顯提高腦組織Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性(P<0.05)。結(jié)論秦皮素對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠有保護(hù)作用，其機(jī)制與抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)及改善細(xì)胞能量代謝有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕秦皮素；腦缺血再灌注;氧化應(yīng)激：髓過氧化物酶;ATPase

腦缺血再灌注后自由基生成增多和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷的主要原因〔1〕。近年來，有研究表明香豆素類化合物有很好的抗炎作用及保護(hù)腦缺血性損傷的作用〔2〕。秦皮素是傳統(tǒng)中藥秦皮中的香豆素類化合物，來源于木犀科植物白蠟樹的樹皮。現(xiàn)代藥理研究表明，秦皮具有抗氧化，抗炎，抗菌，抗凝血和防治骨質(zhì)疏松等多種生物學(xué)活性〔3〕。近年來的研究主要集中在秦皮素的抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用〔4,5〕，本研究觀察秦皮素對(duì)腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織生化代謝的影響。

1材料與方法

1.1材料秦皮素，購自南京郎澤醫(yī)藥有限公司,純度98%；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒、ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;DT-200小鼠跳臺(tái)儀，成都泰盟科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組實(shí)驗(yàn)前1 d用跳臺(tái)法對(duì)小鼠進(jìn)行篩選，淘汰對(duì)電擊反應(yīng)過于遲鈍或敏感的小鼠。將篩選合格小鼠隨機(jī)分成五組，每組10只，即假手術(shù)組，模型組及秦皮素高劑量組(20 mg/kg)，中劑量組(10 mg/kg)，低劑量組(5 mg/kg)，腹腔注射給藥，連續(xù)7 d，假手術(shù)組，模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2.2腦缺血再灌注模型的制備根據(jù)文獻(xiàn)〔6〕制備腦缺血再灌注小鼠模型，10%水合氯醛(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，將小鼠仰臥固定，切開頸部皮膚，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合線牽拉，阻斷血流，每牽拉10 min松開10 min，反復(fù)3次后縫合皮膚，適宜條件飼養(yǎng)，假手術(shù)組只分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈但不阻斷血流。

1.2.3學(xué)習(xí)記憶能力測定〔7〕實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入跳臺(tái)儀內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境3 min,調(diào)節(jié)電壓為36 V，通電后小鼠受到電擊的正常反應(yīng)是跳上跳臺(tái)逃避電擊。學(xué)習(xí)成績用反應(yīng)時(shí)間(小鼠受到電擊后跳上跳臺(tái)的時(shí)間)和錯(cuò)誤次數(shù)(5 min內(nèi)小鼠受到電擊的次數(shù))表示，24 h 后再次測試，將小鼠放在平臺(tái)上，開始通以電流，記錄小鼠的潛伏期(通電后第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間)和錯(cuò)誤次數(shù)(5 min 內(nèi)跳下平臺(tái)的次數(shù))作為記憶成績。

1.2.4腦組織生化指標(biāo)的測定取腦組織，用冰生理鹽水制備10%勻漿液，4℃、2 500 r/min,離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行測定，蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.5腦組織形態(tài)學(xué)觀察 取視交叉部位腦組織，依次經(jīng)4%多聚甲醛固定，蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm,常規(guī)HE染色，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1學(xué)習(xí)記憶能力測試 缺血再灌注損傷組小鼠的跳臺(tái)測試中反應(yīng)時(shí)間延長，受到的電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))增加，學(xué)習(xí)能力降低。記憶能力測定顯示，模型組小鼠記憶潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加，與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.05)，與模型組相比，秦皮素高，中劑量組均可改善腦缺血再灌注小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.05)，而秦皮素低劑量組效果不明顯，見表1。

表1　各組小鼠學(xué)習(xí)記憶成績

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；表2同

2.2腦組織SOD活性、MDA 含量和MPO活性模型組小鼠腦組織SOD活性降低，MDA 含量和MPO活性明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。與模型組比較，秦皮素高、中、低劑量組小鼠腦組織SOD活性升高，MDA 含量和MPO活性降低(P<0.05)，秦皮素各劑量組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3秦皮素對(duì)小鼠腦組織Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影響與假手術(shù)組相比，模型組Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯降低，表明腦組織能量代謝異常。與模型組相比，秦皮素各劑量組腦組織Na+-K+-ATPase活性升高，秦皮素高、中劑量組腦組織Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高(P<0.05)，見表3。

2.4腦組織HE染色HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元排列正常，核仁明顯，未見神經(jīng)元壞死及中性粒細(xì)胞浸潤等明顯病理改變，模型組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，排列紊亂，出現(xiàn)程度不同的核深染，核固縮，核體不規(guī)則，秦皮素給藥組能減輕神經(jīng)元及細(xì)胞核的損傷，抑制局部組織壞死，提示秦皮素對(duì)腦缺血再灌注海馬區(qū)神經(jīng)元有保護(hù)作用，見圖1。

表2　秦皮素對(duì)小鼠腦組織中SOD活性，MDA

表3　各組小鼠Na+-K+-ATPase,Ca2+-Mg2+-

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

假手術(shù)組

模型組

高劑量組

中劑量組

低劑量組

圖1各組小鼠海馬HE染色(×400)

3討論

學(xué)習(xí)記憶功能障礙是缺血性腦血管疾病患者常見的臨床表現(xiàn)，本研究顯示，腦缺血再灌注損傷小鼠在跳臺(tái)測試中反應(yīng)時(shí)間延長，受到的電擊次數(shù)增加，記憶潛伏期縮短，學(xué)習(xí)記憶能力降低，預(yù)先給予秦皮素可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生是由多種機(jī)制參與的復(fù)雜病理生理過程，其中自由基的毒性作用和炎癥反應(yīng)是產(chǎn)生缺血再灌注損傷的關(guān)鍵性病理環(huán)節(jié)〔8〕。SOD具有顯著抗脂質(zhì)過氧化的作用，其活性與機(jī)體的抗氧化能力相關(guān)，MDA為脂質(zhì)過氧化過程中的最終分解產(chǎn)物。研究表明，秦皮素通過抗凋亡和抗氧化作用,具有保護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用〔9〕。本研究顯示，秦皮素能降低MDA含量，提高SOD活性，支持秦皮素的神經(jīng)保護(hù)作用與其抗氧化作用密切相關(guān)。中性粒細(xì)胞含有MPO，其活性程度主要反映中性粒細(xì)胞的浸潤程度，因而間接提示局部組織的炎性反應(yīng)程度，MPO可誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥效應(yīng)細(xì)胞的增殖與活化〔10〕。秦皮素預(yù)處理后腦組織MPO活性降低，提示秦皮素對(duì)缺血再灌注損傷后中性粒細(xì)胞浸潤為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)有明顯改善作用。能量代謝障礙是缺血性腦細(xì)胞損傷發(fā)生的另一關(guān)鍵環(huán)節(jié),而ATP酶活性的改變是神經(jīng)元損傷的重要環(huán)節(jié)〔11〕。Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase是存在于生物膜上的一種蛋白酶,在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞方面具有重要的作用,可維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡,維持細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性,已成為評(píng)價(jià)神經(jīng)元質(zhì)膜功能狀態(tài)的標(biāo)志之一〔12〕。模型組小鼠腦組織ATPase活性下降,神經(jīng)元質(zhì)膜的功能異常,引起細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+增加,從而誘發(fā)一系列病理生理反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，秦皮素能明顯提高腦缺血小鼠腦組織Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase活性，提示秦皮素可改善腦組織的能量代謝，對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。本研究證實(shí)，秦皮素對(duì)腦缺血再灌注造成的學(xué)習(xí)記憶減退和組織損傷有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制涉及抗氧化，抑制炎癥反應(yīng)和改善腦組織能量代謝。

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〔2014-12-07修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：泰山醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2010ZR080)

〔中圖分類號(hào)〕R285

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2350-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.016

第一作者：陳美華(1977-)，女，講師，碩士，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究 。