王瑞婷　董雅潔　左彥珍　關(guān)麗華　丁　實(shí)

(承德醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北　承德　067000)

黃芩莖葉總黃酮對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬神經(jīng)元Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

王瑞婷董雅潔左彥珍關(guān)麗華丁實(shí)

(承德醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北承德067000)

〔摘要〕目的探討黃芩莖葉總黃酮(SSTF)對(duì)大鼠海馬注射淀粉樣蛋白Aβ25～35所致神經(jīng)元Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法40只雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、SSTF 50 mg/kg、100 mg/kg組，每組10只。模型組、SSTF組大鼠于灌胃第8天雙側(cè)海馬注射Aβ 10 μg，對(duì)照組大鼠海馬注射生理鹽水，大鼠于灌胃20 d后處死。采用TUNEL法觀察大鼠海馬神經(jīng)元凋亡；免疫組化、Western印跡檢測(cè)海馬組織中Bax、Bcl-2的表達(dá)，采用光密度值(IOD)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果模型組大鼠海馬細(xì)胞凋亡IOD較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，50、100 mg/kg給藥組IOD較模型組明顯降低(P<0.01)；免疫組化及Western印跡結(jié)果顯示模型組Bax表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，SSTF 50、100 mg/kg組Bax表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.01)；模型組Bcl-2較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，SSTF 50、100 mg/kg組Bcl-2表達(dá)較模型組明顯升高(P<0.01)。結(jié)論大鼠海馬注射Aβ25～35可引起海馬神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與Aβ 上調(diào)凋亡基因Bax表達(dá)、降低抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)有關(guān)。SSTF可減輕Aβ引起的神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與其調(diào)控Bax、Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕阿爾茨海默??；淀粉樣蛋白；黃芩莖葉總黃酮；神經(jīng)元凋亡；Bax；Bcl-2

淀粉樣蛋白(Aβ)作為阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的始動(dòng)因子已得到廣泛的認(rèn)可〔1〕。前期研究已顯示黃芩莖葉總黃酮(SSTF)能減輕海馬注射Aβ引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退，減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的脫失和超微結(jié)構(gòu)損傷，且其效應(yīng)與SSTF的抗氧化作用有關(guān)〔2，3〕。體內(nèi)凋亡和抗凋亡失衡與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，有研究報(bào)道Aβ體內(nèi)、體外均可引起神經(jīng)元凋亡〔4，5〕，也有實(shí)驗(yàn)研究黃酮類化合物的體內(nèi)、體外抗神經(jīng)元凋亡作用〔6〕，但SSTF體內(nèi)對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響未見報(bào)道。本研究探討SSTF對(duì)Aβ致AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠40只，10～12周齡，體質(zhì)量(280±20)g，動(dòng)物證號(hào)0289310，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2009-0004，SPF級(jí)，全部實(shí)驗(yàn)在SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào)：SYXK(冀2009-0022)。動(dòng)物室溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%，自由攝食飲水。

1.2試劑Aβ25～35購(gòu)自Sigma公司，HPLC≥97%，SSTF由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供，純度61.88%。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司，山羊抗兔Bcl-2多抗(Lot：K2206)、山羊抗兔Bax多抗(Lot：E1607)、小鼠β-actin 單抗購(gòu)自 SANTA CRUZ公司。SP9000、SP9002免疫組化試劑盒、山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記(Lot：73399)購(gòu)自中杉金橋公司。RIPA強(qiáng)裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海炎彬化工科技有限公司。ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，PVDF膜Millipore 公司產(chǎn)品。

1.3試劑的配制Aβ25～351 mg溶于500 μl無(wú)菌生理鹽水(2 g/L)，-20℃保存，臨用前置于37℃孵育5～7 d成凝膠態(tài)。黃芩莖葉總黃酮溶于蒸餾水中，調(diào)pH值為中性，現(xiàn)用現(xiàn)配，用前置室溫，搖勻。

1.4方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及AD模型制作雄性Wistar 大鼠40只，隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、SSTF 50、100 mg/kg組，每組10只。對(duì)照組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃，給藥組灌胃總黃酮，1次/d，連續(xù)20 d，于大鼠前囟后(AP)-3.5 mm，左右旁開(ML)±2 mm，進(jìn)針深度(DV)2.7 mm定位海馬CA1區(qū)，灌胃第8天對(duì)照組雙側(cè)海馬各注射5 μl的無(wú)菌生理鹽水，其他組雙側(cè)海馬各注射Aβ25～355 μl含10 μg制作AD模型。所有動(dòng)物于灌胃第20天處死，每組取4只大鼠腦組織制作石蠟標(biāo)本。

1.4.2TUNEL檢測(cè)石蠟切片脫蠟、水合，細(xì)胞通透，加入TUNEL反應(yīng)液，加converter-POD，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以胞質(zhì)或胞核著棕黃色為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4.3免疫組化切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水合，95℃水浴抗原修復(fù)，滴加Ⅰ抗孵育37℃ 2.5 h，Ⅰ抗?jié)舛确謩e為兔抗Bax多抗(1∶100)、兔抗Bcl-2多抗(1∶75)。Ⅱ抗孵育37℃ 15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，用PBS液代替一抗為陰性對(duì)照。

1.4.4TUNEL、免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞累積光密度測(cè)定每組選取4只大鼠腦組織石蠟標(biāo)本，光鏡下每個(gè)標(biāo)本選注射部位附近海馬CA1區(qū)2張切片，400倍視野下采用image-pro plus軟件進(jìn)行光密度測(cè)定。

1.4.5Western印跡蛋白提取及定量：稱取每組6只大鼠的海馬組織0.15～0.2 g加1 ml PBS-NaF，研磨(冰上操作)、離心、裂解、蛋白定量采用BCA試劑盒，按說明書操作。制膠、上樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過夜，Ⅰ抗孵育，Ⅰ抗?jié)舛确謩e為兔抗Bax多抗(1∶200)、兔抗Bcl-2多抗(1∶100)、β-actin單抗(1∶1 000)，Ⅱ抗孵育2 h，Ⅱ抗?jié)舛壬窖蚩雇肐gG/辣根過氧化物酶標(biāo)記1∶3 000，顯影、定影。 光密度值測(cè)定：膠片掃描后采用Gelpro4軟件測(cè)定灰度值，每個(gè)組織每個(gè)指標(biāo)的灰度值與該組織的β-actin灰度值相比。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1SSTF對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬神經(jīng)元多數(shù)細(xì)胞核呈棕黃色，對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元核著色細(xì)胞少，著色淺，SSTF組較模型組著色淺，著色細(xì)胞少，見圖1。模型組IOD〔(40.41±9.1)×103〕較對(duì)照組〔(7.77±1.8)×103〕明顯升高(P<0.01)；SSTF 50 mg/kg和100 mg/kg組IOD〔(20.80±4.4)×103vs(12.56±4.5)×103〕明顯低于模型組(P<0.01)。

2.2SSTF對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元Bax、Bcl-2表達(dá)的影響(免疫組化)模型組大鼠海馬CA1區(qū)Bax免疫組化IOD較對(duì)照組明顯升高；SSTF組IOD較模型組明顯降低，見表1。Bax在大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，模型組海馬CA1區(qū)多數(shù)神經(jīng)元胞質(zhì)黃染，較對(duì)照組著色深，SSTF組較模型組著色淺，見圖2。Bcl-2在大鼠海馬神經(jīng)元胞質(zhì)中呈棕黃色，模型組海馬CA1區(qū)著色細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組少，著色淺，SSTF組較模型組著色細(xì)胞多，著色深，見圖3。模型組海馬CA1區(qū)Bcl-2免疫組化IOD明顯低于對(duì)照組，SSTF組IOD明顯高于模型組，見表1。

圖1　大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡(TUNEL，×400)

圖2　大鼠海馬CA1區(qū)Bax表達(dá)(DAB，×400)

組別BaxBcl-2對(duì)照組20.78±5.17115.24±24.56模型組144.51±30.451)21.45±5.271)SSTF50mg/kg組87.65±24.562)46.27±8.372)SSTF100mg/kg組52.17±12.782)76.74±18.192)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

圖3　大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)(IHC,×400)

2.3SSTF對(duì)大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2表達(dá)量的影響(Western印跡)模型組大鼠海馬組織中Bax/β-actin明顯高于對(duì)照組；SSTF組明顯低于模型組；模型組大鼠海馬組織中Bcl-2/β-actin明顯低于對(duì)照組，SSTF組明顯高于模型組；模型組Bax/bcl-2較對(duì)照組明顯升高，SSTF組較模型組明顯降低，見表2，圖4。

表2　黃芩莖葉總黃酮對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bax，Bcl-2

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

1～4:SSTF 50、100 mg/kg組、模型組、對(duì)照組圖4　大鼠海馬組織中Bax,Bcl-2 的表達(dá)(Western印跡)

3討論

線粒體凋亡途徑主要有P53蛋白、Bax蛋白、Bcl-2蛋白及caspase的參與〔7，8〕。Caspase-3是凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵因子，它的激活與細(xì)胞色素C(cyt-c)自線粒體釋放、線粒體損傷、神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)〔9〕。Bcl-2基因家族中Bcl-2蛋白與Bax蛋白是一對(duì)互相拮抗的蛋白，Bcl-2具有明顯抑制凋亡作用，而Bax則促進(jìn)凋亡，Bax，Bcl-2 通過影響線粒體外膜通透性來(lái)調(diào)節(jié)cyt-c 釋放，Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)，cyt-c自線粒體釋放，導(dǎo)致凋亡發(fā)生一系列瀑布反應(yīng)〔10〕。Aβ也可引起線粒體呼吸鏈的復(fù)合體Ⅲ(泛醌-細(xì)胞色素C-還原酶)、Ⅳ(細(xì)胞色素C氧化酶，COX)活性降低〔11〕，其活性降低會(huì)導(dǎo)致ATP產(chǎn)生下降，過多的電子直接使氧分子O2產(chǎn)生超氧陰離子O2-和其他ROS〔14〕，線粒體內(nèi)膜上的心肌磷脂作為線粒體膜的唯一磷脂也是ROS的靶點(diǎn)，ROS的升高引起心肌磷脂過氧化，氧化的心肌磷脂與cyt-c結(jié)合力下降，引起cyt-c完全釋放〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Aβ可能通過影響B(tài)ax，Bcl-2表達(dá)，影響線粒體外膜通透性，調(diào)節(jié)cyt-c釋放，引起神經(jīng)元凋亡；Silva等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者線粒體內(nèi)Aβ寡聚體含量增加，加速了線粒體損傷。TAT-XIAP可通過減少Aβ引起的海馬神經(jīng)元凋亡而改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔14〕。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Aβ可以引起ROS增多〔15〕，因此Aβ也可能通過ROS引起cyt-c釋放，誘導(dǎo)凋亡。本文結(jié)果顯示SSTF較模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡明顯減少，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2上調(diào)，Bax/Bcl-2比值明顯降低，提示SSTF通過對(duì)抗Aβ引起的凋亡相關(guān)基因改變來(lái)減輕神經(jīng)元凋亡。前期研究結(jié)果顯示SSTF具有明顯的抗氧化作用〔2〕，因此推測(cè)SSTF的抗凋亡作用也可能通過抗氧化，降低ROS產(chǎn)生而減輕神經(jīng)元凋亡。有研究報(bào)道通過上調(diào)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性可減少細(xì)胞的凋亡〔16〕。Zhu等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)一種黃酮糖苷Hibifolin能夠抑制Aβ引起的皮層神經(jīng)元中caspase-3，7的激活，抑制Ca2+流動(dòng)，減少DNA斷裂。丁振禹等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)三羥基異黃酮可影響APP695基因轉(zhuǎn)染PCI2細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。

黃酮類化合物除了從抗氧化、抗凋亡機(jī)制減輕Aβ引起的神經(jīng)毒性外，也有研究顯示通過影響Aβ生成、Aβ原纖維形成起到保護(hù)神經(jīng)元作用。Jung等〔19〕研究了從槐屬植物中提取的總黃酮能抑制β分泌酶活性，淀粉樣蛋白前體(APP)通過β、γ分泌酶裂解產(chǎn)生Aβ，因此抑制β分泌酶活性可減少Aβ生成。Naiki等〔20〕采用離體實(shí)驗(yàn)研究了五種黃酮類化合物的作用，能夠抑制Aβ原纖維的形成及增強(qiáng)原纖維的不穩(wěn)定性。Aβ在體內(nèi)以可溶性狀態(tài)存在時(shí)沒有毒性，形成原纖維絲后會(huì)產(chǎn)生毒性。Lemkul等〔21〕也證實(shí)桑黃素可以結(jié)合到原纖維的末端阻斷新的肽附著，能滲入到疏水中心在天冬氨酸與賴氨酸處裂解，干擾主鏈上的氫鍵而影響原纖維絲的形成。

本文顯示SSTF可減輕Aβ引起的神經(jīng)元凋亡，其作用機(jī)制與其影響凋亡相關(guān)基因表達(dá)、抗氧化作用有關(guān)，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研發(fā)黃芩莖葉總黃酮用于神經(jīng)退行型疾病的預(yù)防和治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。黃芩莖葉總黃酮的抗凋亡作用與凋亡通路中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：河北省科技廳資助項(xiàng)目(08276101D-21)

〔中圖分類號(hào)〕R962

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2337-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.011

第一作者：王瑞婷(1969-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物藥抗癡呆作用研究。