楊超一　馮婷婷　張雪峰　盧金輝　王　斌

(原子高科股份有限公司，北京102413)

血管緊張素Ⅰ化學發(fā)光免疫分析方法的建立

楊超一馮婷婷張雪峰盧金輝王斌

(原子高科股份有限公司，北京102413)

[摘要]目的：建立人血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)化學發(fā)光免疫分析方法，通過測定血漿中血管緊張素Ⅰ的含量計算腎素活性。方法：用生物素標記Ang Ⅰ抗原，熒光素標記AngⅠ抗體，將抗熒光素抗體包被于化學發(fā)光板，以鏈親和素酶為催化劑，采用競爭法建立Ang Ⅰ化學發(fā)光免疫分析方法。結(jié)果：本方法的測量范圍為100～7 800 pg/ml，靈敏度為24.3 mU/ml，批內(nèi)變異為5.6%～8.7%，批間變異為6.8%～10.4%，回收率為95.4%～105.3%，稀釋實驗測定值與理論值呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.999。與放射免疫分析試劑盒的相關(guān)性方程分別為y=0.95x+235.70，相關(guān)系數(shù)r=0.973。包被板、生物素標記AngⅠ抗原以及熒光素標記AngⅠ抗體在37℃存放一周穩(wěn)定性良好。結(jié)論：方法學鑒定結(jié)果符合免疫分析的基本要求。

[關(guān)鍵詞]血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)；生物素；熒光素；鏈親和素酶；化學發(fā)光免疫分析

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)是人體血壓、水和電解質(zhì)平衡的重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著十分重要的作用。腎素在生理和許多病理情況下，其數(shù)量和活性決定了整個體系的活性，因此測定腎素活性對判斷RAAS活性是非常重要的。實際臨床中腎素活性是通過人血漿中AngⅠ產(chǎn)生的速率測定的，即37℃條件下1 h腎素原被腎素催化轉(zhuǎn)化為Ang Ⅰ的量。目前檢測血漿中腎素活性、血管緊張素Ⅱ和醛固酮含量已經(jīng)成為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓、原發(fā)性醛固酮增多癥等疾病的診斷、治療及研究的重要指標[1-5]。此外對一些相關(guān)慢性心力衰竭、腎病、肝硬化等疾病的診斷、治療以及發(fā)病機理的探討有著重要的臨床意義[6-8]。

化學發(fā)光免疫分析技術(shù)是近十幾年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)[9]，在實際應(yīng)用中具有無放射性污染、較高靈敏度和特異性免疫反應(yīng)、易普及推廣等優(yōu)點。本工作采用競爭法建立了血管緊張素Ⅰ化學發(fā)光免疫分析方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器化學發(fā)光檢測儀(1420 Multilabled Counter)為芬蘭Wallac產(chǎn)品；伽瑪計數(shù)器(GAMMA-C12)為美國DP公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑熒光素、生物素、血管緊張素Ⅰ抗原為Sigma產(chǎn)品； 96孔化學發(fā)光板為Nunc產(chǎn)品；抗熒光素抗體為北京華信行科技有限公司產(chǎn)品；鏈親和素酶為Xema產(chǎn)品；血管緊張素Ⅰ抗體、發(fā)光底物、放射免疫分析試劑盒均由原子高科股份有限公司提供。實驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1標準品的配制用標準品稀釋液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB溶液)將AngⅠ配制成0、100、250、625、1 560、3 900、7 800 pg/ml，然后以 1.0 ml/瓶分瓶凍裝，-20℃保存，使用前用1.0 ml標準稀釋液進行復溶。

1.2.2固相抗體的制備用0.05 mol/L pH9.5碳酸緩沖液(CB)稀釋包被抗熒光素抗體至5 μg/ml，并加入發(fā)光板中(200 μl/孔)，置4℃ 過夜。次日，倒去包被液，拍干。每孔加入250 μl封閉液，37℃溫育1 h。倒掉封閉液后自然晾干備用。

1.2.3生物素標記AngⅠ抗原的制備[10]首先用DMSO溶解生物素濃度為1 mg/ml，然后取100 μg生物素加入到200 μg AngⅠ抗原(溶于200 μl 0.5 mol/L的Na2HPO4溶液)中，混合搖勻，用0.02 mol/L的磷酸緩沖溶液(PB)透析3 d，取出后加入等量甘油置于-20℃保存。

1.2.4熒光素標記AngⅠ抗體的制備[11]首先用DMSO溶解熒光素為濃度10 mg/ml，然后取16 μg熒光素加入到200 μg AngⅠ抗體(溶于400 μl 0.1mol/L 的CB)中，搖勻混合后，室溫避光攪拌4 h，再用0.02 mol/L的PB透析3 d，取出后加入等量甘油置于-20℃保存。

1.2.5化學發(fā)光免疫分析程序?qū)?00 μl標準品、血漿樣品(一份4℃存放，一份37℃保溫1 h)加入已包被好抗熒光素抗體的微孔板中；每孔中加入50 μl生物素標記的AngⅠ抗原和50 μl熒光素標記的AngⅠ抗體； 輕搖混勻，37℃下水浴2 h；傾去微孔中反應(yīng)液，用稀釋好的洗滌液洗滌5次(300 μl/孔)，拍干；每孔再加入200 μl鏈親和素酶，37℃下水浴30 min；傾去微孔中反應(yīng)液，洗滌。將發(fā)光底物A和B按1∶1(體積比)混勻(臨用前新配)。然后分別向每個微孔中加入200 μl發(fā)光底物溶液，在發(fā)光測量儀上測量各孔的發(fā)光強度(cps)，測量時間0.1秒/孔。以標準品濃度為橫坐標，以發(fā)光計數(shù)值為縱坐標，以Logit-log直線回歸制作標準曲線。最后計算出：PRA(pg/ml/h)=37℃ 1 h條件AngⅠ濃度值-4℃條件AngⅠ濃度值。

2結(jié)果

2.1方法學優(yōu)化

2.1.1生物素標記抗原工作濃度的選擇用稀釋液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB溶液)將生物素標記抗原濃度分別稀釋為1∶10、1∶20、1∶50、1∶100倍，觀察不同生物素標記抗原濃度對免疫分析結(jié)果的影響。結(jié)果如表1所示。根據(jù)其曲線B/B0%和線性相關(guān)系數(shù)，選定生物素標記抗原工作濃度為1∶50。

2.1.2熒光素抗體濃度的選擇用稀釋液(含0.1%BSA的 0.05 mol/L pH7.4 PB 溶液)將熒光素標記抗體濃度分別稀釋為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，觀察不同生物素標記抗原濃度對免疫分析結(jié)果的影響。結(jié)果如表2所示。根據(jù)其曲線B/B0%和線性相關(guān)系數(shù)，選定熒光素標記抗體工作濃度為1∶200。

2.2方法學鑒定

2.2.1標準曲線通過方法學建立，得到的血管緊張素Ⅰ化學發(fā)光免疫分析方法的標準曲線示于圖1。標準曲線方程為y=-2.14x+6.75，r=0.999。

2.2.3精密度對3份含低、中、高不同濃度的血漿樣品分別在一次實驗中平行多孔測定和在不同實驗中重復測定，得出PRA的平均值和SD以及變異系數(shù)，結(jié)果列于表3。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)為5.6%～8.7%，批間變異系數(shù)為6.8%～10.4%?？梢姳痉椒ǖ木芏容^好，符合免疫分析的要求。

表1生物素標記抗原濃度選擇

Tab.1Selection of concentration in biotin labeled antigen

Dilution1∶101∶201∶501∶100B/B0%95%84%77%69%rvalue0.9950.9970.9990.996

表2熒光素標記抗體濃度選擇

Tab.2Selection of concentration in fluoresce in labeled antibody

Dilution1∶501∶1001∶2001∶400B/B0%94%81%79%79%rvalue0.9960.9980.9990.995

圖1　血管緊張素Ⅰ化學發(fā)光免疫分析標準曲線Fig.1　Standard curve of chemiluminescence immunoass-ay for AngⅠ

2.2.4健全性將一份高濃度血漿樣品進行倍比稀釋后測定，稀釋度與測定值的線性相關(guān)曲線如圖2所示。經(jīng)計算測定值和稀釋度的相關(guān)性方程為：y=3 642x+10.90，相關(guān)系數(shù)r=0.999。

2.2.5回收率將不同濃度的血管緊張素Ⅰ標準品分別以等體積加入到同一份血漿樣品中測定，測定結(jié)果列于表4。將測定結(jié)果與理論值進行對比，計算得出本方法的回收率為95.4%～105.3%，說明本方法準確度較好。

2.3方法學比較用本方法分別與放射免疫分析

表3精密度測定結(jié)果(pg/ml/h，n=10，%)

Tab.3Precision measurement results (pg/ml/h，n=10，%)

SampleIntra-assayvariationxSDCVInter-assayvariationxSDCV1573.3532.115.6570.8759.3710.421767.26106.046.01719.45116.926.833851.68335.108.73776.92351.259.3

表4回收率測定

Tab.4Recovery test

Additionamount(pg/ml/h)PRAmeasuredvalue(pg/ml/h)PRAtheoreticalvalue(pg/ml/h)Recoveryrate%01125.32100645.13612.66105.3625890.55875.66101.739002397.082512.6695.4

圖2　稀釋實驗Fig.2　Dilution test

方法同時測量63份血漿樣品，并對計算得出的PRA值進行比較，其相關(guān)性結(jié)果見圖3。可知本方法與放射免疫分析方法的相關(guān)性方程為y=0.95x+235.70，相關(guān)系數(shù)r=0.973。說明本方法與放射免疫分析方法具有良好的相關(guān)性。

2.4穩(wěn)定性

2.4.1抗熒光素抗體包被板的穩(wěn)定性將抗熒光素抗體包被板分別置于37℃ 1、3、5、7 d，然后進行化學發(fā)光免疫分析考查其穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如圖4所示?？芍篃晒馑乜贵w包被板在37℃存放一周能保持良好的穩(wěn)定性。

2.4.2生物素標記AngⅠ抗原的穩(wěn)定性將生物素標記AngⅠ抗原工作液分別置于37℃ 1、3、5、7 d，然后進行化發(fā)光免疫分析考查其穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如圖5所示?？芍锼貥擞汚ngⅠ抗原在37℃存放一周穩(wěn)定性良好。

2.4.3熒光素標記AngⅠ抗體的穩(wěn)定性將熒光素標記抗體工作液置于37 ℃ 1、3、5、7 d，經(jīng)免疫分析考查其隨時間的變化情況。結(jié)果見圖6 。可知熒光素標記抗體37℃存放一周穩(wěn)定性良好。

圖3　本方法與放射免疫分析方法的相關(guān)性Fig.3　Correlation between this method and radioimmunoassay

圖5　生物素標記AngⅠ抗原的穩(wěn)定性Fig.5　Stability of biotin labeled Ang Ⅰ antigen

圖6　熒光素標記AngⅠ抗體的穩(wěn)定性Fig.6　Stability of fluorescein labeled Ang Ⅰ antibody

3討論

腎素是一種水解蛋白酶，由腎臟入球小動脈的近球細胞合成，貯存并釋放到血液中，它直接作用于肝臟所分泌的血管緊張素原，使血管緊張素原轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)移酶催化作用下轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅱ，并可引起醛固酮分泌，以此發(fā)揮對機體血壓的調(diào)節(jié)作用[12]。

目前測定腎素活性在臨床上應(yīng)用較為廣泛，臨床檢測值降低見于原發(fā)性高血壓低腎素型、原發(fā)性醛固酮增多癥、假性醛固酮增多癥、糖皮質(zhì)素抑制性醛固酮增多癥等；升高見于原發(fā)性高血壓高腎素型、巴特綜合征、血管性高血壓、肝硬化、腎上腺功能減退、心力衰竭等。腎素活性的測定對于臨床評估高血壓病人的身體狀況是非常有意義的，尤其可用于診斷腎性高血壓、原發(fā)性醛固酮增多癥，并且可以幫助治療和管理其他類型的高血壓患者。

本工作建立了血管緊張素Ⅰ化學發(fā)光免疫分析方法，經(jīng)方法學鑒定符合免疫分析的基本要求。此外本方法還具有良好的靈敏度、重復性和穩(wěn)定性。用本方法與放射免疫分析方法對樣品的測量值具有良好的線性相關(guān)。目前臨床高血壓等疾病診斷多采用國外進口試劑，其中測定腎素活性試劑有德國DRG和德國IBL公司的ELISA試劑盒，標準曲線范圍都為0.2～60 ng/ml，相對較窄，而且價格較貴。本工作建立的血管緊張素Ⅰ化學發(fā)光免疫分析方法的標準曲線范圍為100～7 800 pg/ml，而且方法建立中使用的抗血管緊張素Ⅰ抗體為本公司自制產(chǎn)品，可以節(jié)約成本，同時也為其診斷試劑盒的國產(chǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Giles TD,Bakris G,Oparil S,etal.Correlations of plasma renin activity and aldosterone concentration with ambulatory blood pressure responses to nebivolol and valsartan,alone and in combination,in hypertension[J].J Am Soc Hypertens,2015,9(11):845-854.

[2]劉洋，姜曼，陳麗震，等.血管緊張素Ⅱ1型受體基因rs3772622位點多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病發(fā)病風險的相關(guān)性分析[J].臨床肝膽病雜志，2015,31(7)：1082-1087.

[3]姜娟,孫寧玲,王鴻懿,等.原發(fā)性高血壓患者血漿腎素活性水平與血壓和尿鈉的關(guān)系[J].中華老年心腦血管病雜志,2012,14(8):810-813.

[4]郭媛博,閆朝麗.血醛固酮與腎素活性比值篩查原發(fā)性醛固酮增多癥的流程及意義[J].廣東醫(yī)學,2013,34(8):1290-1292.

[5]Fischer E,Reuschl S,Quinkler M,etal.Assay characteristics influence the aldosterone to renin ratio as a screening tool for primary aldosteronism: results of the German Conn's registry[J].Horm Metab Res,2013,45(7):526-531.

[6]王愛紅,郭琳琳.老年慢性心力衰竭患者血漿腦利鈉肽、腎素活性及其血鈉水平的相關(guān)性探討[J].山東醫(yī)藥,2009 ,49(43):92-93.

[7] UC Brewster,MA Perazella.The renin-angiotensin-aldosterone system and the kidney: effects on kidney disease[J].Am J Med,2004,116(4):263-272.

[8] 霍穎,朱亞林,劉云.PRA、AT-Ⅱ和Ald在病毒性肝炎、肝硬化患者中的表達[J].放射免疫學雜志,2008,21(6): 537-538.

[9]Roda A,Pasini P,Mirasoli M，etal.Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence[J].Trends Biotechnol,2004,22(6):295-303.

[10]Bratthauer GL.The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods[J].Methods Mol Biol,2010,588(1):257-270.

[11]Kelly KA,Reynolds F,Weissleder R，etal.Fluorescein isothiocyanate-hapten immunoassay for determination of peptide-cell interactions[J].Anal Biochem,2004,330(2):181-185.

[12]符春暉,嚴華,陸永光,等.腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與原發(fā)性高血壓病的關(guān)系[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2012,12(5):948-950.

[收稿2015-10-30修回2015-12-02]

(編輯倪鵬)

Establishment of chemiluminescence immunoassay for AngiotensinⅠ

YANG Chao-Yi,FENG Ting-Ting,ZHANG Xue-Feng,LU Jin-Hui,WANG Bin.

Atomic High Technology Limited Liability Company,Beijing 102413,China

[Abstract]Objective:The chemiluminescence immunoassay for AngiotensinⅠ (AngⅠ ) was developed by the competition method.The renin activity was calculated by the determination of Ang Ⅰ. Methods: AngⅠ antigen was labeled with biotin and fluorescein labeled AngⅠ antibody,and anti fluorescein antibody was used to coated with the microporous plate .Results: The standard range of the method was 100-7 800 pg/ml.The assay sensitivity was 24.3 pg/ml.The intra- and inter-assay coefficients of variance were 5.6%-8.7% and 6.8%-10.4% respectively.Analytical recovery was 95.4%-105.3%.The correlation coefficients between measured and expected values were 0.999 after serial diluted.Compared with radioimmunoassay kit,the correlative equation was y=0.95x+235.70,correlation coefficient was 0.973.Coated microporous plate and biotin labeled Ang Ⅰ antigen,and fluorescein labeled Ang Ⅰantibody at 37℃ for a week with good stability. Conclusion: The results of the method were in accord with the basic requirements of immunoassay.

[Key words]AngiotensinⅠ;Biotin;Fluorescein;Streptavidin-enzyme;Chemiluminescence immunoassay

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.015

作者簡介：楊超一(1982年-)，女，碩士，助理研究員，主要從事免疫分析診斷試劑開發(fā)工作，同時就職于中國原子能科學研究院，E-mail:chaoyi_2008@163.com。

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0838-04