韋花媚　劉坤平　羅春英　盧運(yùn)龍　黃永秩　蘇群英　陸海善

(暨南大學(xué)附屬清遠(yuǎn)人民醫(yī)院病理科，清遠(yuǎn)511500)

MMP-9及HIF-1α在鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)中的作用研究

韋花媚①劉坤平羅春英①盧運(yùn)龍①黃永秩①蘇群英①陸海善①

(暨南大學(xué)附屬清遠(yuǎn)人民醫(yī)院病理科，清遠(yuǎn)511500)

[摘要]目的：研究鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧誘導(dǎo)因子-1ɑ(HIF-1ɑ)的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。方法：選取右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診為鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，收集病理組織蠟塊標(biāo)本46例(病例組)、同期內(nèi)鏡檢查取鼻甲黏膜組織經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為黏膜慢性炎癥標(biāo)本20例(對(duì)照組)，分別采用HE染色法和免疫組織化學(xué)法處理兩組標(biāo)本，觀察兩組標(biāo)本的病理形態(tài)、MMP-9及HIF-1ɑ的表達(dá)差異，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：病例組的HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率67.39%(31/46)、對(duì)照組表達(dá)陽(yáng)性率為6.52%(3/20)，病例組的HIF-1ɑ表達(dá)顯著的高于對(duì)照組(P<0.05)。病例組的MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率71.74%(33/46)、對(duì)照組表達(dá)陽(yáng)性率為6.52%(3/20)，病例組的MMP-9表達(dá)顯著的高于對(duì)照組(P<0.05)。HIF-1ɑ、MMP-9在陽(yáng)性表達(dá)在Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的患者組織中出現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者組織中HIF-1α、MMP-9呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與患者發(fā)生Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)具有一定的關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；臨床病理特征

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤是惡性淋巴瘤分類中較為獨(dú)立的一種，曾稱為中線特殊類型外周T淋巴瘤、中線致死性肉芽腫，其細(xì)胞類型來(lái)源主要來(lái)自于外周成熟的NK細(xì)胞，少部分來(lái)源于NK樣T細(xì)胞，故稱為NK/T細(xì)胞淋巴瘤。臨床上主要累及部分為鼻腔，病理類型改變多為鼻腔以及面中線損毀性病變，伴有血管的破壞和灶性壞死[1,2]。對(duì)于其相關(guān)病因的探討認(rèn)為EB病毒的參與可能較為顯著地促進(jìn)了NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展，而部分學(xué)者認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)以及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)可能在此過(guò)程中發(fā)揮了血管侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)破壞以及缺氧性應(yīng)答等作用[3,4]，但對(duì)于其在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)以及其與相關(guān)臨床特征關(guān)系之間的研究較少，本次研究重在分析鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料選取右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收集的經(jīng)病理檢查確診為鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤的患者的病理組織蠟塊標(biāo)本46例(病例組)、同期內(nèi)鏡檢查取鼻甲黏膜組織經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為黏膜慢性炎癥標(biāo)本20例(對(duì)照組)。所有納入對(duì)象均經(jīng)臨床病理檢查確診；研究對(duì)象的臨床資料完整，可進(jìn)行本次研究相關(guān)分析。病例組46例患者，年齡19～72歲，平均年齡(49.2±11.5)歲；其中男29例、女17例；病變部位分別位于：鼻腔34例、鼻咽部4例、硬腭3例、軟腭2例、扁桃體3例；根據(jù)Ann Arbor分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期14例、Ⅲ期16例、Ⅳ期8例；出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，血管浸潤(rùn)24例。對(duì)照組20例患者，年齡22～58歲，平均年齡(46.1±10.7)歲，其中男12例、女8例。兩組患者的年齡、性別構(gòu)成差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.2方法

1.2.1HE染色方法石蠟切片放置于二甲苯溶液中10 min，采用乙醇水化，蘇木紫染色5 min，1%鹽酸酒精分化20 s，0.1%胺水溶液返藍(lán)30 s，伊紅溶液浸染3～5 min，之間采用流水常規(guī)沖洗30 s，之后采用中性樹(shù)膠封片。

1.2.2免疫組織化學(xué)法標(biāo)本放置于90℃烤箱中烘烤25 min，二甲苯溶液浸泡兩次，每次5 min，采用不同濃度的乙醇水化后PBS洗滌3次，每次5 min，過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10 min，檸檬酸緩沖鹽進(jìn)行熱抗原修復(fù)，之后分別加入一抗和二抗(抗體均采用PBS緩沖液1∶100稀釋配置，一抗以及二抗均購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司)。DAB顯色后，采用蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3免疫組化法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)MMP-9及HIF-1α免疫組化陽(yáng)性表達(dá)均為胞漿或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒，HIF-1α以胞核及胞核部分胞質(zhì)呈淡黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，MMP-9以胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。免疫組織化學(xué)法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，按照著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)，0分：無(wú)色；淡黃色：1分；棕黃色：2分，褐色：3分；顯微鏡下染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：未見(jiàn)黃色顆粒細(xì)胞為0分；<10%：1分；10%～50%：2分；51%～80%：3分；>80%:4分；兩個(gè)得分項(xiàng)目相加為最終評(píng)分，(-)為總分1～2分，陰性表達(dá)；(+)為3分，弱陽(yáng)性表達(dá)；(++)為4～5分，中陽(yáng)性表達(dá)；(+++)為6～7分，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

2結(jié)果

2.1兩組患者的組織標(biāo)本中HIF-1α及MMP-9 表達(dá)情況比較病例組的HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率67.39%(31/46)、對(duì)照組表達(dá)陽(yáng)性率為6.52%(3/20)，病例組的HIF-1α表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1，HE染色見(jiàn)圖1A，免疫組化染色見(jiàn)圖2A。

表1兩組患者的組織標(biāo)本中HIF-1ɑ表達(dá)比較

Tab.1Comparison of HIF-1α expression in tissues of two groups of patients

Groupsn-++++++ZPCasegroup461571212-4.142<0.001Controlgroup2017300

圖1　HE染色(HE，×100)Fig.1　Result of HE staining(HE，×100)Note: A.Control group;B.Case group.

圖2　免疫組化(SP，×400)Fig.2　Expression of Immunohistochemical(SP，×400)Note: A.HIF-1α;B.MMP-9.

表2兩組患者組織標(biāo)本中MMP-9的表達(dá)比較

Tab.2Comparison of MMP-9 expression in tissues of two group of patients

Groupsn-++++++ZPCasegroup461381312-4.42<0.001Controlgroup2017300

表3組織標(biāo)本中HIF-1α表達(dá)與患者的臨床病理特征關(guān)系

Tab.3Relationship between HIF-1α expression and clinicopathological characteristics of patients

ProjectPositiveNegativeThepositiverate(%)χ2PSex0.9010.343Male21872.41%Female10758.82%Age(years)0.110.741<6017965.38%≥6014670.00%Lactatedehydrogenase1.3220.25Normal13959.09%Increase18675.00%AnnArborStage9.2340.002Ⅰ-ⅡStage101245.45%Ⅲ-ⅣStage21387.50%Cervicallymphnodemetastasis5.3310.021Yes15288.24%No161355.17%Vascularinvasion5.8040.016Yes20483.33%No111150.00%

表4組織標(biāo)本中MMP-9表達(dá)與患者的臨床病理特征關(guān)系

Tab.4Relationship between MMP-9 expression and clinicopathological charocteristics of patients

ProjectPositiveNegativeThepositiverate(%)χ2PSex0.6580.417Male22775.86%Female11664.71%Age(years)0.1860.667<6018869.23%≥6015575.00%Lactatedehydrogenase1.3660.243Normal14863.64%Increase19579.17%AnnArborStage9.8290.002Ⅰ-ⅡStage111150.00%Ⅲ-ⅣStage22291.67%Cervicallymphnodemetastasis6.6610.01Yes16194.12%No171258.62%Vascularinvasion9.8290.002Yes22291.67%No111150.00%

病例組的MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率71.74%(33/46)、對(duì)照組表達(dá)陽(yáng)性率為6.52%(3/20)，病例組的MMP-9表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2，HE染色見(jiàn)圖1B，免疫組化染色見(jiàn)圖2B。

2.2鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的組織標(biāo)本中HIF-1ɑ及MMP-9 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系HIF-1ɑ、MMP-9在陽(yáng)性表達(dá)在Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的患者組織中出現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)表3、4。

3討論

近年來(lái)對(duì)于NK/T細(xì)胞淋巴瘤的相關(guān)病因?qū)W探討分析認(rèn)為，EB病毒的感染是導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的主要原因，相關(guān)研究分析認(rèn)為90%的NK/T細(xì)胞淋巴瘤由于后天性感染EB病毒而致病，相關(guān)臨床治療可以發(fā)現(xiàn)NK/T細(xì)胞淋巴瘤的治療面臨著類似其他惡性腫瘤的治療難題，其耐藥以及較為嚴(yán)重的血管侵襲性改變顯著影響了患者的臨床預(yù)后[5]。在EB病毒感染導(dǎo)致的致病過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)通過(guò)其與相關(guān)整合素受體的結(jié)合，從而直接釋放或者誘導(dǎo)宿主分泌MMP-9，作為基質(zhì)金屬家族中分子量最大的酶，可以通過(guò)破壞和降低細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原和明膠，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究也證實(shí)，分化較差或者侵襲性較為明顯的腫瘤細(xì)胞其細(xì)胞膜表面的MMP-9表達(dá)明顯升高[6]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)被認(rèn)為在腫瘤缺氧應(yīng)答中處于較為關(guān)鍵的位置，與腫瘤細(xì)胞血管的生成密切相關(guān)[7]，通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)缺氧性細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而調(diào)控腫瘤新生血管的生成，相關(guān)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1ɑ(HIF-1ɑ)可能作為腫瘤治療的有效途徑[8，9]，但對(duì)于二者在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)，特別是其與相關(guān)臨床病理特征的關(guān)系研究較少。

MMP-9通過(guò)講解細(xì)胞外Ⅳ型以及Ⅴ型膠原纖維，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，筆者通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，病例組的MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)71.74%，顯著高于鼻甲黏膜慢性炎癥組織的表達(dá)水平，提示了MMP-9參與到了NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。而相關(guān)研究也證實(shí)，MMP-9除了可以通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，MMP-9同樣參與到了增強(qiáng)上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力、參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成中。筆者通過(guò)研究MMP-9與相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，隨著臨床分期的增加以及腫瘤發(fā)生血管侵襲或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，組織中MMP-9的表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步提示了MMP-9在NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用[10]。部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，隨著Ann Arbor分期的增加，MMP-9呈現(xiàn)出了較為明顯的增加趨勢(shì)，但Ⅲ期或者Ⅳ期患者差異并不明顯[11]，而Ye和Souza等[12]學(xué)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生血管侵襲性轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例的MMP-9升高可達(dá)對(duì)照組的4～5倍，而相關(guān)機(jī)制研究表明EB病毒感染導(dǎo)致的癌蛋白LMP-1的激活可以促進(jìn)AP-1信號(hào)通路的激活[13]，進(jìn)而促進(jìn)MMP-9對(duì)于血管基底膜以及細(xì)胞外膠原纖維的作用[14]。而對(duì)于HIF-1α的研究表現(xiàn)出了較為相似的結(jié)論，提示了HIF-1α參與到了NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。筆者通過(guò)分析近年來(lái)國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，NF-κB可以通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)MMP-9以及HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)其對(duì)于腫瘤的轉(zhuǎn)移、淋巴侵襲等作用。同時(shí)部分學(xué)者認(rèn)為，腫瘤壞死因子α(TNF-α)在HIF-1α生成過(guò)程中的抑制性調(diào)節(jié)可能促進(jìn)了NK/T細(xì)胞淋巴瘤的免疫逃逸以及促新生血管的生成[15]。

綜上所述，鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者組織中HIF-1ɑ、MMP-9呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與患者發(fā)生Ann Arbor分期(Ⅲ～Ⅳ期)、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)具有一定的關(guān)系，但相關(guān)信號(hào)通路的傳遞以及表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究探討。

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[收稿2015-07-09]

(編輯許四平)

Study on effect of MMP-9 and HIF-1α expression in nasal NK/T cell lymphoma

WEI Hua-Mei,LIU Kun-Ping,LUO Chun-Ying，LU Yun-Long,HUANG Yong-Yi,SU Qun-Ying,LU Hai-Shan.

Department of Pathology,Qingyuan Hospital School of Medicine,Ji′nan University,Qingyuan 511500,China

[Abstract]Objective:To study the expression of MMP-9 in nasal NK/T cell lymphoma, HIF-1ɑ and its relationship with the clinical and pathologic characteristics.Methods: 46 cases (case group) of paraffin block specimens from patients with pathologically confirmed nasal NK/T cell lymphoma were collected from the Affiliated Hospital of Youjiang Medical College For Nationalities,the same period endoscopy turbinate mucosa were confirmed by pathology in 20 cases of chronic inflammation of mucosa specimens (control group), respectively HE staining and immunohistochemistry handle two specimens, observation of the expression differences of two groups of specimens of pathological morphology, MMP-9 and HIF-1ɑ, and to analyze its relationship with the clinical and pathological features of the patients.Results: Case group HIF-1ɑ expression rate 67.39% (31/46), expression was 6.52% (3/20) in control group., the HIF-1ɑ case group were significantly higher than control group (P<0.05).Case group MMP-9 expression rate 71.74% (33/46), in the control group expression was 6.52% (3/20), MMP-9 expression in the case group was significantly higher than control group (P<0.05).HIF-1ɑ and MMP-9 in positive expression in Ann Arbor staging (Ⅲ-Ⅳ), lymph node metastasis, vascular invasion in patients with nasal NK/T cell lymphoma tissue appeared a high expression (P< 0.05).Conclusion: Nasal NK/T cell lymphoma tissue of patients with HIF-1ɑ, MMP-9 presented high expression, and there was a certain relationship between Arbor Ann stage (Ⅲ-Ⅳ), lymph node metastasis and vascular invasion.

[Key words]Nasal NK/T cell lymphoma;Matrix metal loproteinase-9;Hypoxia inducible factor alpha-1;Clinical pathological characteristics

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.020

作者簡(jiǎn)介：韋花媚(1983年-)，女，在讀碩士，住院醫(yī)師，主要從事診斷病理學(xué)方面的研究。

通訊作者及指導(dǎo)教師：劉坤平(1963年-)，女，博士， 主任醫(yī)師，主要從事腫瘤病理診斷及研究工作。

中圖分類號(hào)R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0863-04

①右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，百色533500。