盧盛娟　林　興　雷丹青

(廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西　南寧　530021)

紅車軸草異黃酮對認(rèn)知損害大鼠NF-κB信號通路及突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用

盧盛娟林興雷丹青

(廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021)

〔摘要〕目的探討紅車軸草異黃酮對Aβ1～42致大鼠認(rèn)知功能損害的保護作用。方法將75 只Wistar大鼠隨機分為五組，除假手術(shù)組外，其余大鼠海馬雙側(cè)注射Aβ1～42肽建立認(rèn)知功能損傷模型，治療組灌胃給予紅車軸草異黃酮，連續(xù)3 w。采用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元退行性。TUNEL法測定各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；ELISA實驗檢測各組大鼠海馬組織中白細(xì)胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)情況；Western印跡法檢測海馬組織中核因子(NF)-κB信號通路相關(guān)蛋白和突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果紅車軸草異黃酮能改善Aβ1～42致大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。進一步研究表明，紅車軸草異黃酮可顯著減弱海馬神經(jīng)元退行性，降低Aβ1～42致海馬IL-1β和TNF-α的過度表達(dá)；減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生，明顯抑制海馬NF-κB的活化。此外，紅車軸草異黃酮還可增加突觸可塑性相關(guān)蛋白和腦源性營養(yǎng)因子(BDNF)水平。結(jié)論紅車軸草異黃酮對Aβ1～42誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)和記憶損傷有明顯改善作用，其機制可能與抑制NF-κB活化，減少神經(jīng)炎癥、調(diào)節(jié)突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及提高BDNF水平有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕紅車軸草異黃酮；認(rèn)知功能損害；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；腦源性營養(yǎng)因子；突觸

1材料與方法

1.1藥物和試石杉堿甲陽性對照藥〔4〕，購自重慶市渝中制藥廠；紅車軸草異黃酮購自南寧千金子中草藥有限公司；Aβ1～42肽(美國Sigma-Aldrich公司)，溶解于0.1 mmol/L無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)配成1 μg/μl的濃度。

1.2實驗動物及給藥Wistar大鼠，SPF級，10周齡，體質(zhì)量(300±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠75 只隨機分為假手術(shù)對照組、Aβ1～42處理組、石杉堿甲(0.05 mg/kg)陽性對照治療組、紅車軸草異黃酮(10 mg/kg)低劑量組、紅車軸草異黃酮(20 mg/kg)高劑量組。參照已有的研究，于Aβ1～42處理組大鼠海馬雙側(cè)立體定向注射Aβ1～42肽2 μl(1 μg/μl)〔5〕。假手術(shù)對照組，注射相同體積的PBS。各組動物在同樣條件下飼養(yǎng)1 d后，石杉堿甲治療組和紅車軸草異黃酮治療組分別灌胃給予石杉堿甲(0.05 mg/kg)和紅車軸草異黃酮(10、20 mg/kg)；假手術(shù)對照組和Aβ1～42處理組，均給予等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)3 w。

1.3腦組織病理檢查首先取部分腦組織馬上放入4%的多聚甲醛溶液，常規(guī)脫水、石蠟包埋，組織切片，H-E染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)。將生長于24孔板中蓋玻片上不同條件下培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞用0.1%的NaBH 4和0.1%的Triton X-100處理過的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后，40 μm冷凍切片，將載玻片與含有脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶和異硫氯酸熒光-鄰苯二甲酸二十一烷莖酶(FITC-DUDP)的混合物培養(yǎng)反應(yīng) 1 h。用 4'-6'-二脒基-2-苯基吲哚二氫氯化物吲哚(DAPI)進行染色，每份樣品隨機選取視野，然后于熒光顯微鏡下分析計數(shù)，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5大鼠海馬中白細(xì)胞介素(IL)-1β，腫瘤壞死因子(TNF)-α活性的檢測采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA法)進行測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6Western印跡檢測海馬組織中核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路相關(guān)蛋白和突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)采用Western印跡檢測NF-κB p65，磷酸化NF-κBp65，IκBα，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，凝集素B4(IB4)，突觸泡蛋白，p-IκBα的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，用圖像處理系統(tǒng)進行分析。檢測方法參見文獻(xiàn)〔6〕。

2結(jié)果

2.1紅車軸草異黃酮對神經(jīng)元退行性的影響Aβ1～42處理組大鼠神經(jīng)元表現(xiàn)出嗜酸變性，核固縮和神經(jīng)元序列錯亂。紅 車軸草異黃酮(20 mg/kg)治療組與Aβ1～42處理組比較，神經(jīng)元退行性得到緩解(P<0.05)。見圖1。

2.2紅車軸草異黃酮對海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)的影響Aβ1～42處理組與假手術(shù)對照組比較，海馬凋亡細(xì)胞顯著增加。經(jīng)紅車軸草異黃酮或石杉堿甲治療后Aβ1～42所致的細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少。見圖2。

這款眾泰E200純電動車，采用的是杭州杰能動力有限公司提供的動力電池組，其電能量為24.5kWh，最大持續(xù)工作電流為75A，工作電壓范圍為264～369V。通過BMS實測電池組的總電壓較低，不在規(guī)定范疇內(nèi)。正常情況下，單體電池電壓一般為3.64V左右，變化范圍為3.0～4.2V。但在檢測時(圖3)，卻發(fā)現(xiàn)有的單體電池的電壓已高達(dá)6.40V(圖4)，這是極不正常的情況。動力電池整體電壓偏低，而某些單體電池電壓異常偏高，說明電池組已出現(xiàn)部分異常損壞。

2.3紅車軸草異黃酮對TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)的影響見表1。Aβ1～42處理的模型組與假手術(shù)對照組比較，海馬組織IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。Aβ1～42誘導(dǎo)的大鼠IL-1β和TNF-α水平增加，而用紅車軸草異黃酮治療后IL-1β和TNF-α水平顯著降低。

①假手術(shù)對照組；②Aβ1～42處理組；③石杉堿甲治療組；④低劑量紅車軸草異黃酮治療組；⑤高劑量紅車軸草異黃酮治療組；下圖同圖1　紅車軸草異黃酮對神經(jīng)元退行性的影響(HE，×400)

圖2　紅車軸草異黃酮對海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)的影響(TUNEL法，×200)

組別TNF-αIL-1β假手術(shù)對照組38.5±4.31)26.8±3.91)Aβ1～42處理組298.9±20.6212.5±20.4石杉堿甲治療組214.8±18.81)157.6±16.21)低劑量紅車軸草異黃酮治療組153.5±16.61)123.2±10.31)高劑量紅車軸草異黃酮治療組125.9±13.81)98.9±8.41)

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

2.4紅車軸草異黃酮對NF-κB活性的影響Aβ1～42誘導(dǎo)的大鼠模型組與假手術(shù)對照組比較，海馬NF-κBp65，P-p65蛋白表達(dá)顯著升高，而給予紅車軸草異黃酮治療后，其蛋白表達(dá)均顯著降低，紅車軸草異黃酮能明顯促進IκBα蛋白的表達(dá)和抑制IκBα的磷酸化。見表2，表3。

表2　Western印跡法檢測海馬組織中

表3　Western印跡法檢測海馬組織中IκBα與

2.5紅車軸草異黃酮對突觸泡蛋白水平的影響Aβ1～42誘導(dǎo)的大鼠模型組突觸泡蛋白水平(0.29±0.02)比假手術(shù)對照組(0.63±0.03)顯著降低，而用紅車軸草異黃酮治療后，突觸泡蛋白水平呈顯著增加(低、高劑量組分別為0.51±0.04、0.58±0.04)，且石杉堿甲也不能增加突觸泡蛋白水平(0.36±0.03)。

2.6紅車軸草異黃酮對BDNF的影響B(tài)DNF集中分布在海馬組織中。同時，Aβ1～42誘導(dǎo)的大鼠模型組，BDNF蛋白表達(dá)(0.11±0.03)較假手術(shù)對照組(0.38±0.02)顯著減少，紅車軸草異黃酮能阻礙Aβ1～42誘導(dǎo)的BDNF水平降低(低、高劑量組分別為0.17±0.03、0.22±0.03)，石杉堿甲不能提高BDNF水平(0.16±0.03)。

2.7紅車軸草異黃酮對膠質(zhì)的影響Aβ1～42導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞大量活化，從而增加GFAP和IB4水平。紅車軸草異黃酮能顯著降低GFAP、IB4水平；同時，石杉堿甲不能抑制兩者水平。見表4。

表4　Western印跡法檢測海馬組織中

3討論

Aβ1～42是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素，是誘發(fā)AD的多種原因的共同病理基礎(chǔ)〔7〕。前期實驗已證實，降低Aβ1～42在大腦內(nèi)的蓄積量可以緩解并減輕AD的癥狀。故本實驗考慮采用Aβ1～42建立認(rèn)知功能損傷動物模型。

AD的發(fā)病機制尚不清楚，目前普遍認(rèn)為Aβ是治療AD的有效靶分子〔8〕。石杉堿甲是從民間草藥千層塔(蛇足石杉,Huperzia serrata)中分離得到的一種新型石松類生物堿有效單體〔9〕。近年研究發(fā)現(xiàn),石杉堿甲通過提高抗氧化酶活力，具有明顯的抗Aβ毒性作用〔10〕。石杉堿甲對比已經(jīng)上市的治療AD藥物E2020，他克林，毒扁豆堿等，能更好地改善老年記憶力衰退，對AD有很好的療效〔11〕。因此，選用石杉堿甲作為本實驗治療Aβ1～42所致大鼠記憶和認(rèn)知功能障礙的陽性藥。

Aβ1～42主要是通過細(xì)胞內(nèi)激活胱天蛋白酶-3〔12〕途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡。本實驗中Aβ1～42處理組可見大量凋亡神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)紅車軸草異黃酮或石杉堿甲治療后，凋亡數(shù)顯著減少。提示紅車軸草異黃酮能顯著減弱海馬神經(jīng)元退行性。

IL-1β介導(dǎo)AD的炎癥反應(yīng)過程，并處于炎癥反應(yīng)鏈的前端，是炎癥級聯(lián)反應(yīng)中重要的始動因子,可進一步促進其他炎癥介質(zhì)的合成和釋放，如IL-6、NF-κB、TNF-α〔13〕。BDNF是由119 個氨基酸組成的堿性蛋白，作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，BDNF〔14〕在成年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個腦區(qū)調(diào)節(jié)突觸傳遞和突觸可塑性，參與學(xué)習(xí)和記憶的形成，并改善記憶，恢復(fù)受損的認(rèn)知功能。通過研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1～42處理組IL-1β、TNF-α、NF-κB大量表達(dá)，而BDNF表達(dá)量降低，紅車軸草異黃酮組其表達(dá)量情況剛好與Aβ1～42處理組相反，可見改善大鼠認(rèn)知功能損害與紅車軸草異黃酮促進 BDNF的表達(dá)，抑制IL-1β、TNF-α的表達(dá)和NF-κB的活化密切相關(guān)。

近年研究表明，隨著年齡增長而記憶功能逐漸下降的原因是由于突觸功能的退化，而不是神經(jīng)元的缺失〔15〕。Aβ的突觸毒性可能導(dǎo)致記憶障礙。在實驗?zāi)Ｐ椭校l(fā)現(xiàn)Aβ1～42能引起海馬突觸泡蛋白水平顯著降低，而突觸泡蛋白是一種特定突觸前標(biāo)記物，這與前期研究發(fā)現(xiàn)的Aβ側(cè)腦室注射產(chǎn)生突觸毒性有關(guān)〔16〕。本實驗顯示，給予紅車軸草異黃酮治療后突觸泡蛋白的表達(dá)顯著升高，表明紅車軸草異黃酮對海馬完整突觸的保護作用可能是其改善認(rèn)知功能惡化的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)的結(jié)果。

中樞炎癥反應(yīng)與周圍炎癥反應(yīng)不同，腦中樞具有自己的免疫系統(tǒng)。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞免疫細(xì)胞，正常狀態(tài)下，“靜息”的小膠質(zhì)細(xì)胞連續(xù)“監(jiān)測”機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，當(dāng)受刺激后迅速激活，誘發(fā)炎性反應(yīng)。實驗中，用紅車軸草異黃酮可一定程度抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活及中樞炎癥反應(yīng)，而使用GFAP和IB4石杉堿甲不能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥反應(yīng)，兩種藥物對術(shù)后認(rèn)知影響還需進一步研究，但通過實驗我們可以推測AD與顯著減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生有關(guān)。

綜上所述，紅車軸草異黃酮可明顯減輕Aβ1～42誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)和記憶損害，初步的機制研究證實，該異黃酮能抑制NF-κB的活化、減少神經(jīng)炎癥、提高突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)、提高BDNF的水平。

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〔2015-10-15修回〕

(編輯袁左鳴)

Regulative mechanism of pratensein on NF-κB signaling pathway and synaptic plasticity in cognitive impairment rats

LU Sheng-Juan,LIN Xing,LEI Dan-Qing.

Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of pratensein against cognitive impairment induced by Aβ1～42in rats.MethodsSeventy-five rats were randomly divided into five groups.Except the sham control group,all the rats in the other groups were injected bilaterally in the hippocampus with Aβ1～42peptide to establish the model of cognitive impairment.Then the rats in the treatment groups were administered orally pratensein for 3 weeks.The neuronal degeneration and neuronal apoptosis in hippocampus were detected by immunohistochemistry and TUNEL assays,respectively.The levels of NF-κB and synaptic-associated proteins were examined by Western blot.In addition,the expressions of IL-1β and TNF-α in hippocampus were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsPratensein treatment significantly ameliorated learning and memory deficits induced by Aβ1～42in rats.The further mechanism study indicated that pratensein significantly reduced the neuronal degeneration and apoptosis in hippocampus.Moreover,treatment with pratensein significantly decreased the contents of IL-1β and TNF-α,and inhibited the proliferations of astrogliosis and microgliosis in hippocampus.Pratensein could significantly suppress the activation of NF-κB in hippocampus.In addition,pratensein was able to enhance the levels of synaptophysin and brain-derived neurotrophic factor(BDNF).ConclusionsPratense can improve the learning and memory deficits induced by Aβ1～42in rats,and its mechanism may be relate to the inhibition of neuronal inflammation by suppressing NF-κB activation,and the up-regulations of synapse-related proteins and BDNF level.

【Key words】Pratensein;Cognitive impairment;NF-κB;Brain-derived neurotrophic factor;Synapsis

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81260674)；廣西自然科學(xué)基金資助項目(No.2013GXNSFAA019146)

通訊作者：雷丹青(1963-)，男，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物提取、分離及其應(yīng)用方面的研究。

〔中圖分類號〕R74

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2318-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.004

第一作者：盧盛娟(1989-)，女，碩士，主要從事生化藥理學(xué)研究。