劉大晟　吳先林　李接興　羅羽宏

(廣東省中醫(yī)院普外科，廣東　廣州　510120)

三種不同造模方法建立大鼠急性胰腺炎模型的對(duì)比

劉大晟吳先林1李接興2羅羽宏2

(廣東省中醫(yī)院普外科，廣東廣州510120)

〔摘要〕目的采用雨蛙肽、L-精氨酸、?；悄懰徕c作為誘導(dǎo)劑建立大鼠急性胰腺炎(AP)動(dòng)物模型，通過(guò)大鼠病理評(píng)分、血清生化及炎癥細(xì)胞因子指標(biāo)檢測(cè)，找出一種操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的大鼠AP造模方法。方法采用不用造模方法處理后的大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)采集血液及胰腺標(biāo)本。檢測(cè)指標(biāo)有淀粉酶(AMY)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α及胰腺組織病理評(píng)分。結(jié)果雨蛙肽組大鼠血清檢查結(jié)果及胰腺病理均符合輕型AP改變，L-精氨酸及牛磺膽酸鈉組血清檢查結(jié)果及胰腺病理均符合重癥AP改變。結(jié)論三種方法均可成模，大鼠AP模型病情最重的是牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)組，其次為L(zhǎng)-精氨酸誘導(dǎo)組，病情最輕為雨蛙肽誘導(dǎo)組。

〔關(guān)鍵詞〕急性胰腺炎；雨蛙肽；L-精氨酸；?；悄懰徕c

急性胰腺炎(AP)發(fā)生初期，血液中產(chǎn)生大量抗炎細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及氧自由基，炎癥介質(zhì)之間相互作用，從而導(dǎo)致“炎癥介質(zhì)瀑布樣級(jí)聯(lián)效應(yīng)”〔1，2〕。炎癥介質(zhì)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)失控后迅速導(dǎo)致SIRS，并可進(jìn)一步發(fā)展為MODS。在臨床中直接進(jìn)行AP的相關(guān)臨床試驗(yàn)存在諸多限制，因此，學(xué)者們致力于建立AP模型進(jìn)行研究其發(fā)病機(jī)制及用藥等。本實(shí)驗(yàn)采用雨蛙肽腹腔注射、L-精氨酸腹腔注射、經(jīng)十二指腸胰膽管逆行穿刺注射?；悄懰徕c等3種方法建立大鼠AP模型，觀察大鼠造模過(guò)程中血清生化指標(biāo)及炎癥因子水平動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合胰腺組織石蠟切片進(jìn)行病理評(píng)分，綜合評(píng)價(jià)3種大鼠AP模型嚴(yán)重程度及造模方法優(yōu)劣，尋找AP的最優(yōu)造模方法。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性SPF級(jí)SD大鼠128只，采用完全隨機(jī)分組法分為空白對(duì)照組、雨蛙肽誘導(dǎo)組、L-精氨酸誘導(dǎo)組、?；悄懰徕c誘導(dǎo)組，每組32只，每組組內(nèi)再根據(jù)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為4個(gè)亞組(6、12、24、48 h)，每個(gè)亞組8只。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理空白對(duì)照組不予特殊處理。雨蛙肽誘導(dǎo)組：以50 μg·kg-1·h-1的誘導(dǎo)劑量，每隔1 h注射1次，共注射6次。L-精氨酸誘導(dǎo)組：采用L-精氨酸腹腔注射的方法，用配制好的20%L-精氨酸溶液腹腔注射，劑量為2.5 g/kg體重，間隔1 h注射1次，共注射2次。?；悄懰徕c誘導(dǎo)組：采用異氟烷吸入麻醉，以0.1 ml/min經(jīng)十二指腸胰膽管逆行緩慢勻速注入5%?；悄懰徕c溶液(1 ml/kg)。

1.3實(shí)驗(yàn)標(biāo)本在末次處理后的第6、12、24、48小時(shí)各取8只大鼠，再以異氟烷吸入麻醉，采用心臟注射器穿刺直接采血法采集血液并處死大鼠，提取血清以檢測(cè)淀粉酶(AMY)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。取大鼠胰腺組織，固定于4%多聚甲醛溶液中備做石蠟切片。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件行析因設(shè)計(jì)方差分析。

2結(jié)果

2.1大鼠血清炎癥因子結(jié)果TNF-α和IL-6在?；悄懰徕c誘導(dǎo)組和L-精氨酸誘導(dǎo)組都明顯升高，而IL-10則在雨蛙肽組較高。從生化結(jié)果看，三種不同造模方法均可使大鼠血清AMY明顯上升，并隨時(shí)間推移而變化。雨蛙肽誘導(dǎo)組大鼠ALT、BUN、Cr水平改變不明顯，說(shuō)明其肝腎功能無(wú)明顯損傷，L-精氨酸誘導(dǎo)組大鼠血清ALT、BUN、Cr有不同程度上升，但其水平不及?；悄懰徕c誘導(dǎo)組，說(shuō)明?；悄懰徕c誘導(dǎo)組AP大鼠的肝腎功能損傷更嚴(yán)重。L-精氨酸誘導(dǎo)組與牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)組Ca2+水平在48 h均明顯下降，且與雨蛙肽誘導(dǎo)組相比有較明顯下降。從三組模型胰腺病理評(píng)分看，L-精氨酸誘導(dǎo)組與?；悄懰徕c誘導(dǎo)組病理評(píng)分峰值明顯高于雨蛙肽組，見表1～表3。

2.2胰腺石蠟切片結(jié)果空白對(duì)照組胰腺結(jié)構(gòu)完整，無(wú)細(xì)胞水腫，胰管走形正常，未見小葉間間隙增寬，無(wú)出血壞死，偶見炎癥細(xì)胞。雨蛙肽誘導(dǎo)組胰腺細(xì)胞彌漫性水腫，小葉結(jié)構(gòu)稍紊亂，可見點(diǎn)狀出血壞死灶，中量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。L-精氨酸誘導(dǎo)組胰腺結(jié)構(gòu)紊亂，彌漫性小葉間水腫，實(shí)質(zhì)出血明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)組胰腺結(jié)構(gòu)紊亂，彌漫性水腫，細(xì)胞明顯脹大，彌漫性出血壞死灶，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

表1　血清IL-6、IL-10、TNF-α測(cè)定結(jié)果

表2　血清AMY、ALT、BUN、Cr、Ca2+、SOD、胰腺病理評(píng)分測(cè)定結(jié)果

表3　各實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)指標(biāo)析因設(shè)計(jì)方差分析

圖1　各組胰腺石蠟切片病理結(jié)果(×200)

3討論

雨蛙肽是膽囊收縮素(CCK)類似物，含有14個(gè)氨基酸殘基，可以刺激胃腸道激素分泌〔3〕。雨蛙肽誘導(dǎo)AP的機(jī)制是通過(guò)CCK受體，刺激胰腺腺泡，激活溶酶體酶水解組織蛋白B，導(dǎo)致胰蛋白酶原激活成胰蛋白酶，從而導(dǎo)致胰腺的“自我消化”〔4〕。雨蛙肽可以在大鼠、小鼠、兔、狗、豬等動(dòng)物中成功誘發(fā)AP，且其胰腺病理變化與人類AP病理變化非常類似。1977年，Lampel等〔5〕最先將雨蛙肽用于建立大鼠AP模型，并成功建立了MAP模型。本實(shí)驗(yàn)采用雨蛙肽按50 μg/kg劑量重復(fù)6次腹腔注射方法建立AP模型，結(jié)果顯示，雨蛙肽誘導(dǎo)組大鼠血清AMY明顯上升，并在12 h內(nèi)迅速上升到較高水平，至24 h血清AMY仍維持在這一水平，與文獻(xiàn)相符。該組AP模型血清ALT、血清BUN、血清Cr水平上升不明顯，Ca2+水平降低程度不如另外兩個(gè)誘導(dǎo)組，提示該模型對(duì)肝腎功能損傷較小，病情較輕。結(jié)合IL-6、TNF-α水平提示該模型炎癥因子水平較其余兩個(gè)誘導(dǎo)組低，病理切片觀察胰腺壞死程度也相對(duì)較輕，因此我們認(rèn)為雨蛙肽腹腔注射法建立的AP模型為MAP。

L-精氨酸大劑量腹腔注射法建立大鼠AP模型最早由Mizunuma等〔6〕報(bào)道，隨后該模型被廣泛應(yīng)用。目前機(jī)制尚不清楚，可能與L-精氨酸誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基、一氧化氮或釋放炎癥介質(zhì)有關(guān)〔7，8〕?，F(xiàn)已證實(shí)，L-精氨酸在一氧化氮合成酶(NoS)催化下生成一氧化氮(NO)〔9〕。L-精氨酸在AP中有雙重作用，在生理劑量時(shí)L-精氨酸及其代謝產(chǎn)物NO可以維持各系統(tǒng)功能，改善胰腺微循環(huán)，防止血栓形成，對(duì)AP起到保護(hù)及減輕胰腺損傷的作用〔10〕。另一方面，當(dāng)大劑量給予L-精氨酸時(shí)在機(jī)體產(chǎn)生大量NO，NO作為自由基也可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，促使AP的發(fā)生及加重其病情〔11〕。本實(shí)驗(yàn)采用20%L-精氨酸按2.5 g/kg分兩次腹腔注射，結(jié)果顯示L-精氨酸腹腔注射后血清AMY水平迅速上升，在24 h達(dá)到峰值，在48 h有所下降。病理切片結(jié)果顯示在24 h胰腺組織出血壞死明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，符合SAP診斷。另外，該模型血清ALT、血清BUN、血清Cr水平升高，提示有肝腎功能損害，結(jié)合血清IL-6、TNF-α上升明顯，說(shuō)明該模型為SAP模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在12～24 h檢測(cè)點(diǎn)檢測(cè)生化指標(biāo)及炎癥因子水平為最嚴(yán)重，但48 h時(shí)均有不同程度好轉(zhuǎn)，據(jù)此我們認(rèn)為，該模型胰腺組織發(fā)生壞死在造模后24 h最嚴(yán)重，隨后可能有自愈傾向。

?；悄懰徕c經(jīng)胰膽管逆行注射法造模是常用的經(jīng)典造模方法之一〔12〕。?；悄懰徕c是兩種膽汁酸的主要成分之一，該造模方式模擬膽總管下段梗阻時(shí)膽汁反流入胰膽管時(shí)引起的AP，而膽源性AP在臨床中占總病例數(shù)的大部分，因此該模型在研究AP時(shí)較為廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用5%?；悄懰徕c經(jīng)胰膽管逆行注射的方法建立AP模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模后6 h血清AMY就迅速上升，并能達(dá)到較高水平。血清生化如ALT、BUN、Cr等指標(biāo)有明顯改變，血清Ca2+、SOD水平下降明顯，血清IL-6、IL-10、TNF-α水平較空白對(duì)照組有明顯改變，說(shuō)明?；悄懰徕c建立AP模型病情嚴(yán)重，可導(dǎo)致MODS。胰腺病理切片可觀察到胰腺組織出血壞死明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，是典型SAP征象。

雨蛙肽方法建立的AP模型病情相對(duì)較輕，簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)，重復(fù)性好，是建立輕型大鼠AP模型的理想方法。L-精氨酸按方法同樣具有簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。?；悄懰徕c經(jīng)十二指腸胰膽管逆行穿刺方法可以成功快速建立大鼠AP模型，且建立的AP模型病情重，血清生化指標(biāo)及炎癥因子等改變明顯，是建立合并有器官功能損傷的SAP模型理想的方法。綜上，在相同時(shí)間點(diǎn)分析3種建立AP模型方法，大鼠AP模型病情最重的是?；悄懰徕c誘導(dǎo)組，其次為L(zhǎng)-精氨酸誘導(dǎo)組，病情最輕為雨蛙肽誘導(dǎo)組。

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〔2015-12-03修回〕

(編輯李相軍)

Comparative study in acute pancreatitis rat models induced by three different methods

LIU Da-Sheng，WU Xian-Lin，LI Jie-Xing，et al.

Department of General Surgery,the Hospital of Guangdong of TCM,Guangzhou 510120,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo find out a simple and reproducible methods of acute pancreatitis(AP)model rat.MethodsRats were received different methods to set up AP rat models.Serum biochemical indicators and pancreas specimens of the four groups rats were tested after AP induction.The levels of AMY,ALT,BUN,Cr,Ca2+,SOD,IL-6,IL-10,TNF-α were detected,and pathological scores of pancreas tissues were measured.ResultsSerum indicators and pathological score of caerulein group were in line with mild AP,yet those of L-arginine and sodium taurocholate group were in line with severe AP.ConclusionsThe models of AP rat could be established successfully by the three ways，the model induced by sodium taurocholate was the most serious illness and the caerulein was the lightest condition according to the three experimental groups at the same time point.

【Key words】Acute pancreatitis;Caerulein;L-arginine;Sodium taurocholate

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No.81403302)；廣東省自然科學(xué)基金資助(2014A030310477)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No.21614306)

通訊作者：羅羽宏(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事普外科疾病的診治研究。

〔中圖分類號(hào)〕R57

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2315-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.003

1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合胰腺病診治中心

2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科

第一作者：劉大晟(1989-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事普外科疾病的診治研究。