黃宏強(qiáng)，范小燕，陶亞群，魯紅學(xué)，鄧建新

(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北，荊州 434025)

三七黑斑病病原菌的復(fù)核鑒定

黃宏強(qiáng)，范小燕，陶亞群，魯紅學(xué)，鄧建新

(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北，荊州 434025)

[摘要]利用單孢分離法，從云南文山三七(Panax notoginseng)葉片上分離獲得黑斑病病原鏈格孢菌。對(duì)所獲得的供試菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)利用ITS、Alt a1、gpd、BT2和RPB2等5個(gè)基因的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析研究。結(jié)果表明，三七黑斑病病原菌為Alternaria panacis Whetzel。

[關(guān)鍵詞]三七(Panax notoginseng)；鏈格孢菌；形態(tài)鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen)又稱(chēng)田七，是一種五加科(Araliaceae)名貴藥用植物，主產(chǎn)于我國(guó)云南。黑斑病是中國(guó)三七主產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，危害植株的各個(gè)部分，受害葉片常形成圓形或不規(guī)則水浸狀褐色病斑，受害葉柄、莖稈產(chǎn)生黑褐色病斑，常造成落葉、干花、不能結(jié)實(shí)、植株折垂而枯死，一般發(fā)病率為25%～35%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)90%以上，導(dǎo)致減產(chǎn)[1～3]?；谛螒B(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，所有已報(bào)道的五加科植物(包括三七、人參、西洋參、鵝掌柴、八角金盤(pán)、刺五加、黃漆木、遼東楤木等)黑斑病病原菌均為鏈格孢菌大孢子種人參鏈格孢(AltemariapanaxWhetzel)[4～6]。

人參鏈格孢的分生孢子形態(tài)容易受到培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)條件(溫度、濕度和光照等)及孢子成熟度影響而發(fā)生改變[7，8]，該菌分類(lèi)鑒定僅依據(jù)孢子形態(tài)不是很可信的，必須綜合形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)、生物化學(xué)及生理學(xué)等相關(guān)信息來(lái)進(jìn)行分析[9]。Deng等[10]對(duì)多種五加科植物的鏈格孢菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)比較研究后，發(fā)現(xiàn)五加科植物黑斑病病原鏈格孢菌存在3個(gè)種類(lèi)：Alternariaaraliae、A.dendropanacis和A.panacis。但這些研究中并未包含分離自三七黑斑病的菌株。為此，本研究從形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)2個(gè)方面對(duì)三七黑斑病病原鏈格孢菌進(jìn)行復(fù)核鑒定，旨在進(jìn)一步明確其分類(lèi)地位。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料1.1.1菌種來(lái)源

將2015年4月采自云南文山的新鮮三七黑斑病病葉保濕培養(yǎng)后，通過(guò)無(wú)菌玻璃針進(jìn)行單孢分離，將分離獲得的菌種保存于長(zhǎng)江大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室，菌株編號(hào)為YZU 151074。

1.2.1培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)：馬鈴薯葡萄糖湯粉(potato dextrose broth，Difco，美國(guó))24g，瓊脂20g，水1000mL。

馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基(potato carrot agar,PCA)：馬鈴薯20g，胡蘿卜20g，瓊脂20g，水1000mL。

1.2試驗(yàn)方法1.2.1形態(tài)觀察

菌落形態(tài)：從PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5d的菌落邊緣取菌齡一致的菌餅(直徑6mm)，接種于含PDA培養(yǎng)基的90mm培養(yǎng)皿上，在無(wú)光照的條件下，置于25℃培養(yǎng)。培養(yǎng)7d后，觀察菌落形態(tài)、有無(wú)色素分泌，并測(cè)量菌落大小(直徑)。

孢子形態(tài)：將病原菌菌絲接種于PCA培養(yǎng)基中，在光照為8h/d、溫度為22℃的條件下培養(yǎng)[5]。培養(yǎng)7d后，觀察產(chǎn)孢方式、分生孢子形態(tài)，隨機(jī)測(cè)量50個(gè)分生孢子的大小。

1.2.2分子系統(tǒng)發(fā)育分析

從PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7d的菌落上刮取菌絲團(tuán)塊，冷凍干燥后，低溫保存?zhèn)溆谩NA的提取主要參考Park等[11]的方法。PCR擴(kuò)增和測(cè)序所用引物為：ITS5和ITS4[12]、Bt2a和Bt2b[13]、gpd1和gpd2[14]、Alt a1-for和Alt a1-rev[15]、RPB2-6F和RPB2-7cR[16]，均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。利用體積為20μL的2×Taq預(yù)混PCR反應(yīng)體系(Genstar，北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)，反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[8]。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠、0.5倍TBE的緩沖液進(jìn)行電泳，利用新型核酸染料(GoldenView，北京博邁德基因技術(shù)有限公司)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，并對(duì)已擴(kuò)增好的產(chǎn)物利用Cyle-Pure Kit(200)純化試劑盒(E.Z.N.A.，Omega Bio-tek，美國(guó))進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物直接送到南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司，用正反2個(gè)引物在ABI3730測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

利用正反兩向序列互補(bǔ)連接后的完整序列，在GenBank中進(jìn)行同源序列查找，盡可能選擇模式菌株或權(quán)威菌株，確保所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可靠性。對(duì)所要分析的核苷酸序列輸入到Mega V5.03軟件后，應(yīng)用ClustalW程序?qū)蝹€(gè)基因序列進(jìn)行校排(alignment)，隨后將構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的多個(gè)基因序列逐個(gè)進(jìn)行連接合并，使每個(gè)菌株的多個(gè)基因序列形成一條核苷酸鏈。用Mega V5.03軟件中的ML(Maximum Likelihood)方法生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行重復(fù)1000次的自舉分析(bootstrap)來(lái)估算分支的支持率，并將Stemphyliumlycopersici設(shè)為組外對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)

菌落形態(tài)：在PDA培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7d的病原菌菌落呈圓形，平鋪，白色至淺灰色，菌絲質(zhì)地柔和似棉花狀，菌落背面由邊緣淺灰色漸變至中間深褐色，菌落大小為52～56mm(圖1A)。

圖1　三七黑斑病病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征(A)和在PCA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢方式、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)(B)

孢子形態(tài)：在PCA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d后，分生孢子梗單生，直立或略彎曲，褐色，長(zhǎng)度變化大，一般為15～50μm×5～7μm，有0～3個(gè)橫隔。分生孢子單生或串生(常見(jiàn)2～6個(gè)分生孢子)于分孢子梗上，呈倒棍棒狀，黃褐色至褐色，孢身25～70μm×10～25μm，有1～8個(gè)橫隔，橫隔間常見(jiàn)0～3個(gè)縱膈或斜隔，隔膜處常隘縮，表面光滑，成熟的分生孢子表面常有小的疣狀突起，孢身上部逐漸延伸成為長(zhǎng)短不等的喙，呈柱狀或錐狀，長(zhǎng)約15～40μm(圖1B)。

綜合菌落和分生孢子的形態(tài)，將供試菌株YZU 151074與已報(bào)道的五加科植物黑斑病病原鏈格孢菌比較，確定為三七黑斑病病原菌，種名應(yīng)為Alternariapanacis(表1)。

表1　三七黑斑病病原菌與已報(bào)道的五加科植物鏈格孢菌的形態(tài)學(xué)比較

2.2分子系統(tǒng)學(xué)

供試菌株YZU 151074的ITS、BT2、gpd、Alt a1和RPB2基因序列分別約500、290、530、450bp和750bp。將測(cè)定的序列提交GenBank，其登陸號(hào)見(jiàn)表2。序列分析發(fā)現(xiàn)供試菌株的ITS基因序列(KU881907)與已報(bào)道的五加科植物鏈格孢菌的100%相同，因此選用4個(gè)基因序列(BT2、gpd、Alt a1和RPB2)組合起來(lái)，共1957bp，以7個(gè)相似種的12鏈格孢菌株為參照，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，供試菌株三七黑斑病病原菌為Alternariapanacis。

表2　構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所有菌株的種類(lèi)、寄主及GenBank登錄號(hào)

圖2　基于BT2、gpd、Alt a1和RPB2基因序列構(gòu)建的ML(maximum likelihood)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3結(jié)論與討論

通過(guò)形態(tài)學(xué)檢測(cè)和分子系統(tǒng)發(fā)育分析，本研究結(jié)果表明三七黑斑病病原應(yīng)為鏈格孢菌屬的Alternariapanacis，與人參、西洋參的黑斑病病原菌同屬于一個(gè)種。與Deng等[10]的結(jié)果相類(lèi)似，并發(fā)現(xiàn)三七黑斑病的病原鏈格孢菌A.panacis與其他2個(gè)從五加科植物上分離的種類(lèi)(A.araliae和A.dendropanacis)不同，在PDA培養(yǎng)基上不分泌有色色素，在PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生相對(duì)較小的分生孢子，串生的分生孢子鏈較長(zhǎng)(2～6個(gè))，并且可以通過(guò)基因序列分析進(jìn)行分子鑒定，例如單個(gè)基因RPB2。

傳統(tǒng)鏈格孢菌的分類(lèi)主要依據(jù)形態(tài)學(xué)的方法，Simmon等[5]對(duì)分離自五加科植物上的鏈格孢菌進(jìn)行系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)研究后，認(rèn)為五加鏈格孢(A.araliaeGreene)和鵝掌藤鏈格孢(A.actinophyllaJ.W.Miller)與分離自人參和西洋參的人參鏈格孢(A.panax)形態(tài)學(xué)特征上相同，同屬人參鏈格孢。影響該觀點(diǎn)成立的主要原因是不同五加科植物鏈格孢菌的分生孢子在形態(tài)上存在交互重疊的現(xiàn)象，且其形態(tài)易受菌齡及培養(yǎng)條件影響。直至2007年，Simmon等[5]的鏈格孢菌專(zhuān)著里也持同樣的觀點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在鏈格孢菌分類(lèi)研究上的廣泛應(yīng)用，Deng等[8]利用分子學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)分離自10種五加科植物的58個(gè)鏈格孢菌菌株，被分成2個(gè)聚類(lèi)組，且形態(tài)上存在明顯差異。隨后在2015年，Deng等[10]利用形態(tài)學(xué)和分子學(xué)方法，證明五加科(Araliaceae)植物鏈格孢菌共存在3個(gè)種類(lèi)，而非僅一個(gè)種類(lèi)。本研究用相似的分類(lèi)學(xué)研究方法，對(duì)三七黑斑病病原鏈格孢菌進(jìn)行復(fù)核鑒定，明確了其分類(lèi)地位，這為該病害的防治研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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[收稿日期]2016-03-08

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400014)；長(zhǎng)江大學(xué)青年人才基金項(xiàng)目(2015cqr17)。

[作者簡(jiǎn)介]黃宏強(qiáng)(1993-)，男，現(xiàn)從事植物保護(hù)學(xué)研究。通信作者：鄧建新，djxin555@hotmail.com。

[中圖分類(lèi)號(hào)]S432.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)15-0006-04

[引著格式]黃宏強(qiáng)，范小燕，陶亞群，等.三七黑斑病病原菌的復(fù)核鑒定[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(15)：6～9.