龍　輝，謝建紅

(1.廣東省清遠(yuǎn)市婦幼保健院　511500；2.廣東省珠海市婦幼保健院　519000)

·論著·

單管多重RT-PCR檢測腸道病毒核酸及其臨床應(yīng)用

龍輝1，謝建紅2

(1.廣東省清遠(yuǎn)市婦幼保健院511500；2.廣東省珠海市婦幼保健院519000)

摘要:目的建立一種快速檢測腸道病毒通用型(EV)、科薩奇病毒A16(CA16)和腸道病毒71(EV71)核酸的單管多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，并探討其臨床應(yīng)用價值。方法建立單管多重RT-PCR檢測EV、CA16和EV71的反應(yīng)體系，并優(yōu)化退火溫度、各引物比例和循環(huán)參數(shù)等反應(yīng)條件；采用自建RT-PCR體系檢測136例手足口病患兒大便標(biāo)本的腸道病毒核酸。結(jié)果單管多重RT-PCR檢測體系的最佳反應(yīng)條件：退火溫度為54 ℃；EV、CA16和EV71引物比例為2∶1∶1；循環(huán)參數(shù)為35。采用自建單管多重RT-PCR從136例標(biāo)本中檢出EV陽性46例(33.82%)，CA16陽性14例(10.29%)，EV71陽性14例(10.29%)，其中CA16、EV71同時陽性2例。結(jié)論成功建立檢測EV、CA16和EV71核酸的單管多重RT-PCR，并應(yīng)用于手足口病患兒的病原學(xué)檢測。

關(guān)鍵詞:反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；手足口病；腸道病毒；核酸

手足口病(HFMD)是由腸道病毒(EV)引起的常見傳染病，致病病原以柯薩奇病毒A組16型(CA16)和腸道病毒71型(EV71)多見[1]。以嬰幼兒發(fā)病為主，近年來呈現(xiàn)暴發(fā)流行的趨勢，嚴(yán)重影響嬰幼兒的生活及學(xué)習(xí)，成為影響社會穩(wěn)定的公共衛(wèi)生問題。尤其是2008年3月在安徽阜陽暴發(fā)的手足口疫情，出現(xiàn)了部分死亡病例，從而引起了全社會的廣泛關(guān)注[2]。如何對HFMD的病原進(jìn)行快速檢測，對HFMD的早期診斷、治療和預(yù)后觀察顯得尤為重要。本研究旨在建立一種簡便、快速檢測EV核酸的單管多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，為HFMD的早期診斷及治療提供病原學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集2014年6月至2015年3月清遠(yuǎn)市婦幼保健院兒科收治的136例疑診HFMD患兒的糞便標(biāo)本，所有標(biāo)本置-40 ℃保存待檢。其中男74例，女62例，年齡6個月至11歲，平均3歲零2個月。HFMD參照原衛(wèi)生部頒布的《HFMD診療指南(2010年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2試劑與儀器柱式病毒RNA提取試劑購自北京天恩澤基因科技有限公司，one-step RT-PCR試劑盒為Takara寶生物(大連)公司產(chǎn)品，采用珠海黑馬9600型PCR儀進(jìn)行檢測。

1.3方法

1.3.1RNA提取先用生理鹽水將大便標(biāo)本進(jìn)行重懸，取0.2 mL重懸液至1.5 mL潔凈離心管中，嚴(yán)格按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA。提取后的RNA可直接用于RT-PCR或-80 ℃保存。

1.3.2EV通用型(以下簡稱EV)、CA16和EV71單重RT-PCR退火溫度選擇分別對EV、CA16和EV71單重RT-PCR采用梯度PCR進(jìn)行退火溫度摸索，溫度選擇47～63 ℃。采用Primer 5.0軟件設(shè)計各引物序列，交由Takara寶生物(大連)公司合成，引物序列見表1。 以實時熒光RT-PCR 檢測EV、CA16和EV71三者均為陽性的RNA作為RT-PCR反應(yīng)的模板。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30 min，94 ℃預(yù)變性2 min后，94 ℃ 30 s，梯度PCR退火溫度47～63 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.3EV、CA16和EV71單管多重RT-PCR退火溫度確定在確定各單重RT-PCR退火溫度后，選擇EV、CA16和EV71三者均能擴增出產(chǎn)物的溫度范圍作為單管多重RT-PCR退火溫度摸索條件，從而選擇最佳退火溫度。

表1　　EV、CA16和EV71 RT-PCR引物序列

1.3.4單管多重RT-PCR按正交設(shè)計方法摸索EV、CA16和EV71各引物比例分別以EV、CA16和EV71引物(濃度為10 μmol/L)體積0.5、1.0 、1.5和2.0 μL作為引物比例摸索條件來選擇單管多重RT-PCR最佳引物比例。

1.3.5單管多重RT-PCR循環(huán)參數(shù)以25、30、35和40循環(huán)數(shù)進(jìn)行單管多重RT-PCR來選擇最佳循環(huán)參數(shù)。

1.3.6單管多重RT-PCR檢測HFMD患兒EV核酸對單管多重RT-PCR各反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，建立最佳反應(yīng)體系用于臨床標(biāo)本檢測。將136例診斷為HFMD患兒的大便標(biāo)本提取RNA后，采用單管多重RT-PCR同時檢測EV、CVA16和EV71，從而分析HFMD患兒EV感染情況。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2　　單管多重RT-PCR檢測結(jié)果解釋

注：(+)表示陽性，(-)表示陰性。

2結(jié)果

2.1EV、CA16和EV71各單重RT-PCR退火溫度EV在溫度為47～62 ℃時均能擴增出產(chǎn)物，表明其退火溫度范圍較寬。CA16在48～54 ℃能擴增出產(chǎn)物，而在57～63 ℃未見擴增產(chǎn)物，由此說明CA16的退火溫度為48～54 ℃。雖然EV71在47～62 ℃均能擴增出產(chǎn)物，但在47～49 ℃出現(xiàn)非特異性條帶，說明該退火溫度范圍過低，因此EV71適宜的退火溫度為50～62 ℃。綜合三者單重RT-PCR的退火溫度，選擇49～55 ℃作為三者單管多重RT-PCR退火溫度摸索的范圍。EV、CA16和EV71單重梯度RT-PCR結(jié)果見圖1。

注：EV和EV71的01～06溫度范圍為47～62 ℃。CA16的01～06溫度范圍為48～63 ℃，07為內(nèi)對照，M為DNAMaker DL500。

圖1EV、CVA16和EV71單重RT-PCR

各退火溫度范圍

2.2EV、CA16和EV71單管多重RT-PCR退火溫度三者在49～55 ℃均能擴增出產(chǎn)物(圖2)，根據(jù)三者產(chǎn)物條帶灰度的強弱選擇54 ℃作為EV、CA16和EV71單管多重RT-PCR最適退火溫度。

注：01為49.4 ℃，02為50.4℃，03為51.6 ℃，04為52.9 ℃，05為54.2 ℃，06為55.0 ℃，M為DL500。

圖2單管多重RT-PCR 退火溫度

2.3單管多重RT-PCR EV、CA16和EV71各引物劑量見表3。 通過對各引物比例條件的摸索，根據(jù)不同引物比例產(chǎn)物灰度的強弱(圖3)，選擇EV∶CA16∶EV71=2∶1∶1為單管多重RT-PCR為最佳引物比例條件。

圖3　單管多重RT-PCR EV、CA16和EV71

表3　　單管多重RT-PCR檢測EV核酸引物劑量(μL)

2.4單管多重RT-PCR循環(huán)參數(shù)見圖4。25循環(huán)時無擴增產(chǎn)物，30循環(huán)時產(chǎn)物條帶較暗，說明產(chǎn)物量較少，40循環(huán)時已至PCR擴增的平臺期，因此選擇35循環(huán)作為單管多重RT-PCR的循環(huán)參數(shù)。

注：01為25循環(huán)參數(shù)，02為30循環(huán)參數(shù)，03為35循環(huán)參數(shù)，04為40循環(huán)參數(shù)。

圖4單管多重RT-PCR不同循環(huán)參數(shù)

2.5單管多重RT-PCR檢測HFMD患兒EV核酸見圖5。在136例大便標(biāo)本中檢出EV陽性46例(33.82%)，CA16陽性14例(10.29%)，EV71陽性 14例(10.29%)，其中CA16、EV同時陽性2例。

圖5　　單管多重RT-PCR檢測HFMD患兒EV核酸

3討論

HFMD是由多種人EV引起的一種嬰幼兒常見的傳染病，大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀，其中以EV71和CA16感染較常見[4]。特別是EV71可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，嚴(yán)重者可致死亡[5-6]。HFMD是一種可預(yù)防、可治愈的疾病，主要應(yīng)于早期診斷、早期隔離、早期治療。因而對HFMD病原學(xué)進(jìn)行快速檢測，為HFMD提供早期診斷依據(jù)顯得尤為重要。目前HFMD診斷以臨床表現(xiàn)為主要手段，傳統(tǒng)的實驗室診斷方法有病毒分離、中和試驗和ELISA等[7]。病毒分離時間長，操作繁瑣。血清中和試驗和ELISA用于疾病早期診斷靈敏度不高。通過檢測EV核酸則能更快速、更特異地對HFMD進(jìn)行診斷[8]。常用于EV核酸檢測的方法有RT-PCR和實時熒光RT-PCR等，雖然實時熒光RT-PCR檢測時間短，操作簡便，但由于其要使用熒光探針，且不能用單管多重的方法同時檢測EV、CA16和EV71，因而檢測成本較高，增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。為了提高檢測EV核酸的靈敏度，有研究者采用互補鎖定引物技術(shù)RT-PCR和反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法等方法來提高檢測的靈敏度，但是這些方法技術(shù)難度大，應(yīng)用成本更高[10-11]。為了建立一種更簡便快速、經(jīng)濟(jì)的方法，本研究將EV、CA16和EV71 3種引物加入同一管中，對各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，采用單管多重RT-PCR同時對EV、CA16和EV71進(jìn)行檢測。

分別對單管多重RT-PCR的退火溫度、各引物的比例及循環(huán)參數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，其退火溫度為54 ℃，EV、CA16和EV71的引物比例為2∶1∶1，循環(huán)參數(shù)為35，成功建立用于EV核酸檢測的單管多重RT-PCR。并對136例HFMD患兒臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，EV陽性率為33.82%，CA16陽性率為10.29%，EV71陽性率為10.29%，由此表明在HFMD患兒中CA16和EV71均有感染，為HFMD的診斷、治療及預(yù)后觀察提供了指導(dǎo)作用。為使單管多重RT-PCR能更好地應(yīng)用于臨床，需要對單管多重RT-PCR進(jìn)行方法學(xué)評價，包括特異性、靈敏度及與其他方法進(jìn)行比較，這是本研究下一步將要解決的問題。

HFMD已在世界范圍內(nèi)流行，常成暴發(fā)趨勢，可致嚴(yán)重的并發(fā)癥甚至死亡，在我國已列為丙類傳染病，因而實驗室檢查對HFMD的早期診斷有重要意義。本研究所建立的單管多重RT-PCR更能簡便快速、經(jīng)濟(jì)有效地在各基層單位應(yīng)用于HFMD的病原體檢測[12]。

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Development and application of single-tube multiplex RT-PCR for detecting enterovirus RNA

LONGHui1,XIEJianhong2

(1.MaternalandChildHealthHospitalofQingyuan,Qingyuan,Guangdong511500,China;2.MaternalandChildHealthHospitalofZhuhai,Zhuhai,Guangdong519000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a rapid single-tube multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for rapid detection of enterovirus RNA including universal enterovirus (EV),coxsachievirus A-16 (CA16) and enterovirus 71 (EV71) and to evaluate the clinical value of this method.MethodsThe reaction conditions of single-tube multiplex RT-PCR were optimized systematically including annealing temperature,the proportion of three groups of primers and the cycle parameter.After the optimal conditions were determined,single-tube multiplex RT-PCR was used to test enterovirus RNA extracted from stool samples of 136 children diagnosed as hand-foot and mouth disease (HFMD).ResultsThe optimal reaction conditions were as follow:annealing temperature was 54 ℃,the proportion of EV,CA16 and EV71 primers corresponded to 2∶1∶1 and the cycle parameter was 35.Out of 136 samples analyzed by single-tube multiplex RT-PCR,46 samples were identified as positive for EV (33.82%),14 samples were identified as positive for CA16 (10.29%) and 14 samples were identified as positive for EV71 (10.29%),among which two samples were identified as positive for both CA16 and EV 71.ConclusionThe single-tube multiplex RT-PCR assay for detecting enterovirus RNA is successfully established and can be applied to provide etiological evidence for HFMD.

Key words:reverse transcription polymerase chain reaction;hand-foot and mouth disease;enterovirus;nucleotide

作者簡介：龍輝，男，副主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.019

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1497-04

(收稿日期：2016-01-18修回日期：2016-02-25)