李明 李璽 權(quán)乾坤 袁海峰 王娟 徐陽(yáng)
(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710004;2. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院,陜西 西安 710032;3. 西安市第五醫(yī)院,陜西 西安 710083)
·論著·
人參皂苷Rg1對(duì)岡田酸誘導(dǎo)的AD樣腦片模型的影響*
李明1李璽1權(quán)乾坤1袁海峰1王娟2徐陽(yáng)3
(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710004;2. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院,陜西 西安 710032;3. 西安市第五醫(yī)院,陜西 西安 710083)
【摘要】目的觀察人參皂苷Rg1對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠腦片模型中磷酸化Tau蛋白及蛋白磷酸酯酶2B(PP2B)的影響,探討中藥人參皂苷Rg1抑制AD模型大鼠腦片Tau蛋白磷酸化的作用機(jī)制。方法將通過(guò)岡田酸誘導(dǎo)SD大鼠腦片(含皮層和海馬),造成Tau蛋白過(guò)度磷酸化的AD腦片模型,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和60、120、240μmol/L人參皂苷Rg1干預(yù)組,干預(yù)結(jié)束后采用免疫組織化學(xué)、western bolt、圖像分析技術(shù)等方法檢測(cè)各組大鼠腦片P-Tau、PP2B水平。結(jié)果模型組大鼠腦片P-Tau蛋白表達(dá)明顯增加,PP2B蛋白表達(dá)明顯減少;人參皂苷Rg1各濃度組P-Tau蛋白表達(dá)減少,PP2B蛋白表達(dá)增加,其中240μmol/L人參皂苷Rg1組P-Tau蛋白表達(dá)最少,PP2B蛋白表達(dá)最多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論人參皂苷Rg1可能通過(guò)上調(diào)AD樣Tau蛋白磷酸化大鼠腦片模型中PP2B的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)P-Tau的去磷酸化,以此途徑抑制Tau蛋白磷酸化,從而減緩神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成。
【關(guān)鍵詞】人參皂苷Rg1;阿爾茨海默病(AD);磷酸化Tau蛋白;蛋白磷酸酯酶2B(PP2B)
磷酸化微管相關(guān)蛋白(Protein Tau,P-Tau)存在于正常人的大腦中,但是Tau蛋白過(guò)度磷酸化參與了神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangle,NFT)[1]形成,成為阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的核心病理變化。Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化并形成PHF被認(rèn)為是AD神經(jīng)元退化的基礎(chǔ), 并且NFT的數(shù)目與AD病人的癡呆程度密切相關(guān)[2,3]。人參皂苷Rg1是從人參中提取的一類生物活性成分[4],有增強(qiáng)記憶和認(rèn)知功能的作用,已成為研究中藥抗老年癡呆的熱點(diǎn)之一。研究表明,蛋白磷酸酯酶是Tau蛋白去磷酸化的重要調(diào)節(jié)酶,其活性的增強(qiáng)在AD的Tau蛋白去磷酸化中發(fā)揮了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)[5,6],采用岡田酸(Okadaicacid,OA)誘導(dǎo)的大鼠培養(yǎng)腦片方法,建立Tau蛋白過(guò)度磷酸化的AD模型,觀察人參皂苷Rg1對(duì)磷酸化Tau蛋白、蛋白磷酸酯酶2B(PP2B)的調(diào)控作用,擬闡明人參皂苷Rg1是否通過(guò)上調(diào)PP2B蛋白表達(dá)途徑以抑制Tau蛋白磷酸化,降低AD大鼠腦片模型中磷酸化Tau蛋白水平,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康6周齡SD雄性大鼠10只,體重120~130g,清潔級(jí),購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)為SCXK(陜)2009-001。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》。每只鼠取400μm厚海馬及皮層腦片5張,隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rg1大、中、小濃度組,每組10張腦片。
1.2藥物與試劑人參皂苷Rg1購(gòu)自吉林宏久生物科技股份有限公司,純度98.99%,使用前溶于生理鹽水配成濃度分別為60、120和240mg/ml的3種溶液。崗田酸購(gòu)自美國(guó)ALEXIS生物制劑公司,純度98%,使用前溶于10%二甲基亞砜(dimethysulphoxide,DMSO),配制成1mg/ml DMSO溶液待用;PP2B多克隆抗體、β-actin及PVDF膜為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;P-Tau(Sere262) 多克隆抗體及SABC試劑盒、抗體稀釋液均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Haws′S蘇木素由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1動(dòng)物模型的制備[7]、分組及干預(yù)在6%水合氯醛麻醉下切開大鼠頭皮,暴露顱骨,迅速斷頭,取腦,置于0~4℃的人工腦脊液冰水混合物中,洗凈血液并降溫后,行冠狀切片,平均厚度400μm。挑選形態(tài)較好(含海馬和皮層)的腦片置入盛有人工腦脊液(mmol/L, 150 NaCl,2 CaCl2,1.2 MgSO4,0.5 KH2PO4,1.5 K2HPO4,10 glucose,pH 7.4)的6孔板中孵育,整個(gè)過(guò)程中于人工腦脊液持續(xù)通入混合氧氣(95%O2+5%CO2),保持溫度(32.0±0.5)℃。腦片隨機(jī)分為5組:對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rg1低、中、高濃度組,每組10張腦片。ACSF孵育1小時(shí),人參皂苷Rg1各組中加入人參皂苷Rg1致使其濃度分別為60、120、240μmol/L,預(yù)處理2小時(shí)后,模型組和人參皂苷Rg1各組ACSF中分別加入OA,使其濃度為1μmol/L,作用3小時(shí),對(duì)照組不加任何處理因素。干預(yù)結(jié)束后,各組大鼠腦片經(jīng)4%多聚甲醛固定4小時(shí),然后轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液浸泡至沉底,做冰凍切片,切片10μm厚,每張切片含皮層、海馬、齒狀回。
1.3.2免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)采用免疫組化染色(SABC法)分別檢測(cè)各組腦片皮層和海馬P-Tau、PP2B蛋白的表達(dá)情況。腦組織切片經(jīng)正常山羊血清抗體封閉后,分別加入兔抗大鼠P-Tau、PP2B多克隆抗體(一抗?jié)舛染鶠?∶1 000),4℃過(guò)夜,生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育40 min,DAB顯色劑顯色,然后蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封固。實(shí)驗(yàn)中用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對(duì)照。采用圖象處理與分析系統(tǒng)對(duì)各組腦片陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行灰度分析,每張切片同一區(qū)域中隨機(jī)選取6個(gè)視野,檢測(cè)面積相同,采集6組數(shù)據(jù),取其平均灰度值作為該切片目標(biāo)區(qū)域的平均灰度值,灰度值越低,陽(yáng)性表達(dá)量越高;反之灰度值越高,陽(yáng)性表達(dá)量越低。
1.3.3Western blot 檢測(cè)P-Tau、PP2B 蛋白水平干預(yù)結(jié)束后,將腦片取出勻漿,充分裂解,提取總蛋白。采用不連續(xù)SDS-PAGE法,將提取的總蛋白經(jīng)電泳儀電泳進(jìn)行蛋白分離,之后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜,經(jīng)多次封閉、漂洗后,分別用待測(cè)目的蛋白的一抗(P-Tau抗體濃度200μg/ml、PP2B抗體濃度200μg/ml)與PVDF膜上的蛋白相互作用,加入辣根酶標(biāo)記的P-Tau、PP2B二抗。采用DAB法顯色,用PBS做陰性對(duì)照。通過(guò)凝膠成像分析儀對(duì)各組蛋白條帶表達(dá)情況進(jìn)行掃描分析,測(cè)出灰度值。利用Image J 1.44p軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別以各自條帶灰度值與β-actin灰度值之比表示,采集10組數(shù)據(jù)。
2結(jié)果
2.1免疫組化檢測(cè)P-Tau、PP2B陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)
2.1.1大鼠腦片陽(yáng)性免疫反應(yīng)細(xì)胞分析P-Tau的陽(yáng)性免疫反應(yīng)物質(zhì)為棕黃色,主要分布于細(xì)胞的胞漿和突起,皮層主要分布在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ層的顆粒細(xì)胞和椎體細(xì)胞,在海馬主要分布于椎體細(xì)胞。PP2B的棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)主要分布于細(xì)胞的胞膜、胞漿和突起,細(xì)胞核著色較淡或不著色。
2.1.2OA處理后腦片P-Tau、PP2B 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的情況與對(duì)照組比較,模型組大鼠腦片P-Tau的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加(P<0.05),PP2B的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.05),見表1。
表1 OA對(duì)大鼠培養(yǎng)腦片P-Tau、PP2B表達(dá)量變化的影響
注:與空白對(duì)照組比較, ①P<0.05
2.1.3人參皂苷Rg1干預(yù)后各組大鼠腦片P-Tau陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量的情況人參皂苷Rg1各濃度組與模型組比較,P-Tau陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)均有不同程度減少(均P<0.05);人參皂苷Rg1各組之間比較,人參皂苷Rg1大劑量組較人參皂苷Rg1中、小劑量組更能有效降低P-Tau的表達(dá)(均P<0.05),見表2、圖1。
表2 人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片P-Tau表達(dá)的影響
注:與空白對(duì)照組比較,①P<0.05;與模型組比較, ②P<0.05;與大劑量組比較,③P<0.05;與中劑量組比較,④P<0.05
圖1人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片P-Tau蛋白表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué),×400)
Figure 1Expression of P-Tau protein in different groups (immunohistochemical method,×400)
注:a.空白對(duì)照組; b.模型組; c.人參皂甙Rg1大劑量組
2.1.4人參皂苷Rg1干預(yù)后各組腦片PP2B陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量的情況與模型組比較,人參皂苷Rg1各組PP2B陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)明顯增加(均P<0.05);人參皂苷Rg1各組間比較,在各腦區(qū)人參皂苷Rg1大劑量組PP2B蛋白的表達(dá)高于人參皂苷Rg1中、小劑量組(均P<0.05),中、低濃度組之間亦存在明顯差異(P<0.05),見表3、圖2。
表3 人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片PP2B表達(dá)的影響
注:與空白對(duì)照組比較,①P<0.05;與模型組比較, ②P<0.05;與大劑量組比較,③P<0.05;與中劑量組比較,④P<0.05
圖2人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片PP2B蛋白表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué),×400)
Figure 2Expression of PP2B protein in different groups(immunohistochemical method,×400)
注:.a.空白對(duì)照組; b.模型組; c.人參皂甙Rg1大劑量組
2.2Western blot 檢測(cè)P-Tau、PP2B蛋白表達(dá)
2.2.1人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片P-Tau表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組P-Tau蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05);與模型組比較,人參皂苷 Rg1 各組P-Tau 蛋白表達(dá)量均顯著減少(均P<0.05),其中以人參皂苷Rg1大劑量組P-Tau 蛋白表達(dá)減少最為顯著,其次為人參皂苷Rg1中劑量組、小劑量組(均P<0均05 ),見圖3。
圖3Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬P-Tau蛋白結(jié)果
Figure 3Expression of P-Tau protein in different groups (Western blot)
注:a.western blot;b.Expression level of P-Tau protein in different groups
2.2.2人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片PP2B蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,模型組大鼠腦片PP2B蛋白的表達(dá)顯著減少(P<0.05 );人參皂苷 Rg1 各濃度組與模型組比較, PP2B蛋白表達(dá)均增高(均P<0.05 ),其中人參皂苷Rg1大劑量組PP2B蛋白表達(dá)增加更為顯著,人參皂苷Rg1中劑量組較小劑量組表達(dá)亦增加(均P<0.05 ),見圖4。
3討論
NFT產(chǎn)生的原因是Tau蛋白的過(guò)度磷酸化[1,2]。正常生理?xiàng)l件下,大腦中Tau蛋白可促進(jìn)微管蛋白聚集成微管并增強(qiáng)其穩(wěn)定性,在軸突的通訊傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用[8]。Tau過(guò)度磷酸化后,與管蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合正常Tau,抑制微管的聚集,則其促進(jìn)微管組裝和穩(wěn)定微管的生物活性就會(huì)喪失,從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)異常,形成神經(jīng)纖維纏結(jié)[9]。目前已發(fā)現(xiàn)Tau有45個(gè)磷酸化位點(diǎn)[10], 其中包括Ser 262 位點(diǎn),而 Ser 262是唯一位于AD Tau蛋白微管結(jié)合域的磷酸化位點(diǎn),這一位點(diǎn)的磷酸化能夠顯著地削弱Tau蛋白與微管的結(jié)合能力,在AD患者腦Tau蛋白檢測(cè)有明顯過(guò)度磷酸化改變。研究者在大鼠腦內(nèi)注射岡田酸在Ser-198/Ser-199/Ser-262、 Ser-396/Ser-404位點(diǎn)可誘導(dǎo)Tau蛋白發(fā)生磷酸化[11]。岡田酸是蛋白磷酸酶的高效選擇性抑制劑,被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)Tau蛋白的過(guò)度磷酸化[12],如岡田酸作用于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞Tau蛋白過(guò)度磷酸化[13],與AD病人腦組織中的病理特征一致。本實(shí)驗(yàn)選用Ser 262位點(diǎn)磷酸化進(jìn)行研究,免疫組化染色結(jié)果表明,模型組大鼠腦內(nèi)P-Tau蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加,推測(cè)岡田酸可能誘導(dǎo)了大鼠腦片Tau蛋白在Ser 262位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。人參皂苷Rg1預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)岡田酸這種作用。與模型組比較,人參皂苷Rg1各組P-Tau蛋白表達(dá)均明顯降低,并以高濃度組效果最佳。
圖4Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬PP2B蛋白結(jié)果
Figure 4Expression of PP2B protein in different groups (Western blot)
a.Western blot; b.Expression level of PP2B protein in different groups
任何Tau蛋白磷酸化都由蛋白激酶和磷酸酶的作用決定,磷酸酶活性正??删S持細(xì)胞骨架的完整,磷酸酶活性降低將導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化[14]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),許多蛋白激酶可促進(jìn)Tau蛋白磷酸化,體外磷酸化的Tau蛋白去磷酸化則可以使NFT松解。AD腦組織中所有Tau蛋白的磷酸化位點(diǎn)都位于Ser/ Thr殘基,所以Ser/Thr磷酸酶能催化Tau蛋白脫磷酸基。研究人員將PP2B的抑制劑處理培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,可導(dǎo)致 Tau 蛋白幾個(gè)特殊位點(diǎn)過(guò)度磷酸化[15]。PP2B是海馬區(qū)最主要的P-Tau去磷酸化磷酸酶,且導(dǎo)致P-Tau去磷酸化的位點(diǎn)最多[16]。另外,人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一,近年來(lái)關(guān)于其對(duì)Tau蛋白磷酸化的抑制作用研究,主要集中于降低糖原合成酶激酶-3β的活性[17],抑制周期依賴性蛋白激酶5的表達(dá)等[18]方面。本課題組前期研究也表明,人參皂苷Rg1可以通過(guò)下調(diào)蛋白激酶A的表達(dá)以抑制Tau蛋白磷酸化[19]。但是關(guān)于人參皂苷Rg1能否對(duì)PP2B的表達(dá)產(chǎn)生影響未做深入研究和報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用人參皂苷Rg1對(duì)AD樣Tau蛋白磷酸化大鼠腦片模型進(jìn)行預(yù)處理,觀察其對(duì)腦片模型中PP2B表達(dá)的影響,結(jié)果表明,與模型組比較,各人參皂苷Rg1組PP2B的表達(dá)增加;3個(gè)濃度人參皂苷Rg1組之間比較,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中以240μmol/L人參皂苷Rg1組效果最佳。這表明人參皂苷Rg1能有效減輕崗田酸引起的Tau蛋白過(guò)度磷酸化,從而減輕NFT的形成。
4結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)證實(shí),以O(shè)A誘導(dǎo)大鼠培養(yǎng)腦片Tau蛋白過(guò)度磷酸化的阿爾茨海默病腦片模型,人參皂苷Rg1可能通過(guò)上調(diào)AD樣Tau蛋白磷酸化大鼠腦片模型中PP2B的表達(dá)從而促進(jìn)P-Tau的去磷酸化,以此途徑抑制Tau蛋白磷酸化,從而減緩神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成,為人參皂甙Rg1治療AD的研究提供了新靶點(diǎn),新思路。
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Effects of ginsenoside Rg1 in rat brain slice model of Alzheimer′s disease induced by okadaic acid
LI Ming1, LI Xi1, QUAN Qiankun1,et al
(1.TheSecondAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Xi′an710004,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,XijingHospital,TheForthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China; 3.Xi′anNo. 5Hospital,Xi′an710083,China)
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the expressions of phosphorylated tau protein (P-tau) and protein phosphatase2B (PP2B) in rat brain slice model of Alzheimer’s disease (AD) induced by okadaic acid(OA) and explore the mechanism of gensenoside Rg1 in inhibiting tau phosphorylation.Methods400 μm thick brain slices cut from brains of 6-week-old SD rats were randomly divided into control, untreated, and low-dose, medium-dose and high-dose ginsenoside Rg1 group. Expressions of P-tau and PP2B proteins in brain slices were determined by immunohistochemical stain, western blot and the results were analyzed by image acquisition and analysis system.ResultsThe expression of P-tau protein was signifitly increased and the expression of PP2B protein was decreased in the untreated group. The expression of P-tau was signifitly decreased and the expression of PP2B protein was increased in the ginsenoside Rg1 groups. The expression of P-tau was less and the expression of PP2B protein was more in high-dose ginsenoside Rg1 group than the other ginsenoside Rg1 groups. The expression of P-tau was less and the expression of PP2B protein was more in medium-dose ginsenoside Rg1 group than low-dose ginsenoside Rg1 group.ConclusionGinsenoside Rg1 could inhibit tau phosphorylation by increasing protein phosphatase2B expression in rat brain slice model of Alzheimer′s disease.
【Key words】Gensenoside Rg1; Alzheimer’s disease; Phosphorylated tau protein; Protein phosphatase2B; Tau protein; SD rat
基金項(xiàng)目:陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目[2007K16-07(5)]; 陜西省中醫(yī)藥管理局基金項(xiàng)目(2005030)
通訊作者:李璽,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,E-mail: lixi2100@sohu.com
【中圖分類號(hào)】R-33;R 743
【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A
doi:10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.006
(收稿日期:2015-10-30; 修回日期: 2016-01-25; 編輯:母存培)