李 強(qiáng)， 李 婷， 王丹丹， 任 虹

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

HPLC-MS法分析玉米須中黃酮苷類(lèi)化合物

李 強(qiáng)， 李 婷， 王丹丹， 任 虹*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

研究了玉米須中的黃酮苷類(lèi)成分。通過(guò)硅膠柱層析和Sephadex LH-20層析對(duì)玉米須乙酸乙酯提取物初步純化，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)其中的黃酮苷類(lèi)化合物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，玉米須乙酸乙酯提取物中含有3種黃酮苷類(lèi)化合物，分別為5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-6-C-2"-O-二鼠李糖苷、5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-3-C-阿拉伯糖-6-C-鼠李糖苷和ax-5"-甲烷-3′-甲氧基玉米素。

玉米須；黃酮苷類(lèi)；HPLC-MS法

玉米須是禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩祝╖ea mays L.）在成熟收獲季節(jié)的雌花花柱和柱頭。現(xiàn)代藥理研究表明玉米須富含黃酮及其苷類(lèi)、多糖、甾醇、生物堿、有機(jī)酸、揮發(fā)油、微量元素以及維生素等多種成分［1］，具有顯著的利尿、降血糖、抑菌、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗癌等功效［2-6］。臨床上，玉米須廣泛用于高血壓、膽道結(jié)石、糖尿病等多種疾病的臨床治療［1］。作為農(nóng)作物玉米生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，玉米須來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，易于采集，是一種有待全面開(kāi)發(fā)利用的藥用資源。黃酮苷類(lèi)化合物是玉米須的主要活性成分之一，其分離純化及活性成為研究熱點(diǎn)。目前，大多熱衷于玉米須總黃酮苷的提取工藝［7-10］，但對(duì)玉米須中含有的黃酮苷類(lèi)化合物成分的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析對(duì)玉米須乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離純化，采用液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用法分析其黃酮苷類(lèi)化合物，為玉米須藥食同源資源的研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須購(gòu)于山東沂南；甲醇、乙腈（均為色譜純），F(xiàn)isher公司；無(wú)水甲醇、二氯甲烷、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯（均為分析純），北京化工廠(chǎng)；硅膠，青島海洋化工廠(chǎng)；LH-20型Sephadex，北京博雅宏興科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME102E/02型電子天平，梅特勒-托利多（上海）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-520型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠(chǎng)；1200型高效液相色譜儀、1100型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Deca co型質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米須乙酸乙酯提取物萃取

稱(chēng)取3. 5 kg玉米須粉末，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇以料液比1：15（g：mL）浸提3次，每次3 h，過(guò)濾，合并濾液，45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。分別用等體積的二氯甲烷、乙酸乙酯對(duì)濃縮液進(jìn)行分級(jí)萃取，并將各提取層提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到不同提取層的浸膏，其中二氯甲烷層浸膏60. 20 g，乙酸乙酯層浸膏19. 95 g。

1.3.2 玉米須乙酸乙酯提取物純化

采用反復(fù)硅膠柱層析和凝膠柱層析方法對(duì)乙酸乙酯層浸膏進(jìn)行純化，流程見(jiàn)圖1。具體操作如下: 1）稱(chēng)取20 g硅膠拌樣，選擇減壓柱型號(hào)為6. 5 cm× 30 cm，采用干法裝柱，用真空泵抽實(shí)，依次用二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇（50：1，4：1），甲醇梯度洗脫，每種洗脫劑洗脫3次，根據(jù)薄層層析結(jié)果合并相同流分。2）對(duì)組分3再次進(jìn)行硅膠柱層析，依次用二氯甲烷：甲醇（10：1，8：1，5：1，2：1），甲醇梯度洗脫，對(duì)二氯甲烷：甲醇為5：1洗脫組分進(jìn)行Sephadex LH-20柱層析，收集組分3-1-1。

圖1 玉米須乙酸乙酯提取物純化流程Fig. 1 Flow chart of purified technology

1.3.3 高效液相色譜制備乙酸乙酯提取物成分

采用半制備高效液相色譜對(duì)組分3-1-1中的物質(zhì)進(jìn)行制備。色譜條件:反相色譜ZORBAX SB-C18半制備柱（250 mm×9. 4 mm，10 μm），流動(dòng)相為甲醇-水體系，采用甲醇45%（0～45 min），甲醇45%～70%（45～60 min）梯度洗脫，流速為4. 0 mL/ min，進(jìn)樣量100 μL，柱溫30℃，280 nm下檢測(cè)。

1.3.4 LC-MS分析玉米須乙酸乙酯提取物成分

色譜條件:反相色譜ZORBAX SB-C18分析柱（250 mm×4. 6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0. 1%TFA-水；B為0. 1%TFA-乙腈，梯度10%～100%B（0～20 min），100%B（20～35 min），流速為200 μL/ min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃，280 nm下檢測(cè)。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源，電子能量70 eV，傳輸線(xiàn)溫度275℃，離子源溫度200℃，母離子m/ z 285，激活電壓1. 5 V，質(zhì)量掃描范圍m/ z 300～1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC制備乙酸乙酯提取物中黃酮類(lèi)成分

采用三氯化鋁顯色法測(cè)定乙酸乙酯提取物中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6. 47%，乙酸乙酯提取物（19. 95g）經(jīng)過(guò)硅膠柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析純化后得到組分3-1-1，其液相色譜圖如圖2。從圖中可以看出在保留時(shí)間為17. 24，33. 08，35. 21 min時(shí)有3個(gè)明顯吸收峰，分別命名為組分A、組分B和組分C。

圖2 組分3-1-1液相色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of fragment 3-1-1

2.2 HPLC-MS法分析黃酮苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)

采用HPLC-MS法對(duì)制備得到的化合物A、B、C進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)，見(jiàn)圖3～圖8。

化合物A呈淡黃色，紫外光譜圖（見(jiàn)圖3（a））顯示其在240～280 nm和320～380 nm都有吸收帶，初步判斷為黃酮苷類(lèi)化合物。其正離子一級(jí)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖4（a））出現(xiàn)m/ z 593. 1［M + H］+離子峰，表明其相對(duì)分子質(zhì)量為592，分子式為C28H32O14，在其二級(jí)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖4（b））中m/ z 431為［M-Rha + 2H］+峰，提示分子中可能含有鼠李糖基，參照文獻(xiàn)［1］推斷化合物A為5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-6-C-2"-O-二鼠李糖苷，其結(jié)構(gòu)如圖7（a），其MS裂解過(guò)程如圖8（a）。

化合物B呈淡黃色，紫外光譜圖（見(jiàn)圖3（b））與化合物A相似，在240～280 nm和320～380 nm都有吸收帶，初步判斷為黃酮苷類(lèi)化合物，其正離子一級(jí)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖5（a））出現(xiàn)m/ z 579.1［M +H］+離子峰，表明其相對(duì)分子質(zhì)量為578，分子式為C27H30O14，在其二級(jí)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖5（b））中m/ z 301為［M-280 +3H］+峰，推測(cè)可能是黃酮C環(huán)產(chǎn)生RDA裂解。參照文獻(xiàn)［11］推斷化合物B為5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-3-C-阿拉伯糖-6-C-鼠李糖苷，其結(jié)構(gòu)如圖7（b），其MS裂解過(guò)程如圖8（b）。

圖3 化合物A、B、C紫外圖譜Fig. 3 UV spectrum of compound A，B and C

圖4 化合物A質(zhì)譜圖Fig. 4 MS spectrum of compound A

化合物C呈淡黃色，紫外光譜圖（見(jiàn)圖3（c））也與化合物A相似，在240～280 nm和320～380 nm都有吸收帶，是黃酮苷類(lèi)化合物，其正離子一級(jí)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖6（a））出現(xiàn)m/ z 590. 9［M + H］+離子峰，表明其相對(duì)分子質(zhì)量為590，分子式為C28H30O14，在其二級(jí)質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖6（b））中m/ z 445為［M-Rha + 2H］+峰。參照文獻(xiàn)［12］推斷化合物C為ax-5"-甲烷-3′-甲氧基玉米素，其結(jié)構(gòu)如圖7（c），其MS裂解過(guò)程如圖8（c）。

3 結(jié) 論

玉米須乙酸乙酯提取物的主要活性成分為黃酮苷類(lèi)物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)類(lèi)型、含量與其產(chǎn)地、品種及采收時(shí)期等多因素有關(guān)，萃取溶劑不同，得到的成分也不同。張慧恩等［13］從產(chǎn)自無(wú)錫玉米須中分離純化出3個(gè)黃酮苷類(lèi)化合物，分別為刺芒柄花素，2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-（3-脫氧葡萄糖基）-3"-甲氧基木犀草素和2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-（6-脫氧-ax-5甲基-木-己-4-羰基）-3"-甲氧基木犀草素。徐燕等［14］從產(chǎn)自安徽的玉米須中分離得到6-乙?；?木犀草素。任順成等［15-16］在玉米須黃酮的含量測(cè)定、分離純化方面做了大量研究，并通過(guò)柱層析法得到6個(gè)黃酮類(lèi)化合物，經(jīng)鑒定其中4個(gè)分別為ax-5"-methane-3′-metho xymaysin、2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-巖藻糖基-3′-甲氧基木犀草素、7，4′-二羥基-3′-甲氧基黃酮-2"-O-α-L-鼠李糖基-6-C-巖藻糖苷、6，4′-二羥基-3′，5′-二甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖苷。

圖5 化合物B質(zhì)譜圖Fig. 5 MS spectrum of compound B

圖6 化合物C質(zhì)譜圖Fig. 6 MS spectrum of compound C

圖7 化合物A、B、C結(jié)構(gòu)Fig. 7 Chemical structures of compound A，B，and C

圖8 化合物A、B、C裂解過(guò)程Fig. 8 Pyrolysis process of compound A，B，and C

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)硅膠柱層析和Sephadex LH-20柱層析對(duì)山東產(chǎn)玉米須乙酸乙酯提取物中黃酮苷類(lèi)成分進(jìn)行分離純化，并利用半制備高效液相色譜制備，采用HPLC-MS法分析得到3個(gè)黃酮苷類(lèi)化合物，分別是5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-6-C-2"-O-二鼠李糖苷、5，7，4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮-3-C-阿拉伯糖-6-C-鼠李糖苷和ax-5"-甲烷-3′-甲氧基玉米素。

［1］ HASANUDIN K，HASHIM P，MUSTAFA S. Corn silk （Stigma maydis）in healthcare: a phytochemical and pharmacological review［J］. Molecules，2012，17:9697-9715.

［2］ VELAZQUEZ D V O，XAVIER H S，BATISTAC J E M，et al. Zea mays L. extracts modify glomerular function and potassium urinary excretion in conscious rats［J］. Phytomedicine，2005，12.3.3-369.

［3］ GUO Jianyou，LIU Tongjun，HAN Linna，et al. The effects of corn silk on glycaemic metabolism［J］. Nutrition & Metabolism，2009（6）:47.

［4］ LIU Jun，WANG Cuina，WANG Zuozhao，et al. The antioxidant and free-radical scavenging activities of extract and fractions from corn silk（Zea mays L.）and related flavone glycosides［J］. Food Chemistry，2011，126（1）: 261-269.

［5］ ZHAO Wenzhu，YIN Yongguang，YU Zhipeng，et al. Comparison of anti-diabetic effects of polysaccharides from corn silk on normal and hyperglycemia rats［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2012，50 （4）:1133-1137.

［6］ WANG Guangqiang，XU Tao，BU Xuemei，et al. Antiinflammation effects of corn silk in a rat model of carrageenin-induced pleurisy［J］. Inflammation，2012，35（3）:822-827.

［7］ 張艷，李海濤，周鴻立.響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須黃酮提取工藝［J］.食品科學(xué)，2012，33（18）:133-137.

［8］ 羅登宏，周桃英.玉米須黃酮的超聲波輔助提取工藝［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（9）:269-271.

［9］ 郭志紅，周鴻立，郭向明. Box-behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化玉米須黃酮純化工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2015（4）: 260-264，268.

［10］ 李春陽(yáng)，閆征.大孔樹(shù)脂分離純化青玉米須中總黃酮的研究［J］.廣西農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（5）:22-25.

［11］ 王英平.玉米須化學(xué)成分及其抗氧化作用研究［D］.長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2004.

［12］ LIU Jun，WANG Cuina，WANG Zuozhao，et al. The antioxidant and free-radical scavenging activities of extract and fractions from corn silk（Zea mays L.）and related flavone glycosides［J］. Food Chemistry，2011，126:261-269.

［13］ 張慧恩，徐德平.玉米須黃酮類(lèi)成分的研究［J］.中藥材，2007，30（2）:164-166.

［14］ 徐燕，梁敬鈺，鄒忠梅，等.玉米須中的一個(gè)新黃酮和兩個(gè)尿素苷［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，66（10）:1235-1238.

［15］ 任順成，丁霄霖.玉米須黃酮類(lèi)成分的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定（Ⅰ）［J］.中草藥，2004，35（8）:857-858.

［16］ 任順成，丁霄霖.玉米須黃酮類(lèi)成分的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定（Ⅱ）［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，28（4）: 34-36，40.

Analysis of Flavonoid Glycosides Derived from Corn Silk by HPLC-MS

LI Qiang， LI Ting， WANG Dandan， REN Hong*
（School of Food and Chemical Engineering/ Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry/ Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/ Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Composition of flavonoid glycosides in corn silk were analyzed in this study. Ethyl acetate extractive of corn silk was purified by the silica gel column and sephadex LH-20 column chromatography. Flavonoid glycosides in corn silk were analyzed by HPLC-MS. Results showed that ethyl acetate extractive of corn silk had three kinds of flavonoid glycosides，which were 5，7，4′-trihydroxy-3′-methoxyflavone-6-C-2"-O-dirhamnoside，5，7，4′-trihydroxy-3′-methoxyflavone-3-C-arabinose-6-C-rhamnoside，and ax-5"-methane-3′-methoxymaysin were analyzed by HPLC-MS.

corn silk；flavonoid glycosides；HPLC-MS method

檀彩蓮）

TS201.2.

A

10. 3969/ j. issn. 2095-6002. 2016. 02. 009

2095-6002（2016）02-0056-06

李強(qiáng)，李婷，王丹丹，等. HPLC-MS法分析玉米須中黃酮苷類(lèi)化合物［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，34（2）:56-61.

LI Qiang，LI Ting，WANG Dandan，et al. Analysis of flavonoid glycosides derived from corn silk by HPLC-MS［J］. Journal of Food Science and Technology，2016，34（2）:56-61.

2015-06-24

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA060701）。

李 強(qiáng)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊换钚晕镔|(zhì)；

*任 虹，女，副教授，博士，主要從事天然活性物質(zhì)方面的研究。通信作者。