原攀紅， 康 振， 金 鵬， 劉 龍，*， 堵國成，2， 陳 堅，2

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

體外酶法水解制備小分子透明質(zhì)酸

原攀紅1， 康 振1， 金 鵬1， 劉 龍1，*， 堵國成1，2， 陳 堅1，2

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

為了制備分子量分布集中的小分子透明質(zhì)酸，在6 g/ L的高分子量透明質(zhì)酸水溶液中加入一定梯度重組水蛭透明質(zhì)酸酶，并控制水解時間。結(jié)果表明，通過控制加入重組水蛭HAase的量和水解時間，根據(jù)水解分子量下降規(guī)律，可以制備出分子量分布集中的小分子HA，包括水解終產(chǎn)物透明質(zhì)酸四糖和六糖。同時，通過高效體積排阻色譜和瓊脂糖凝膠電泳，可以證明水解產(chǎn)物的分子量分布集中。

透明質(zhì)酸；重組水蛭透明質(zhì)酸酶；小分子透明質(zhì)酸；高效體積排阻色譜；瓊脂糖凝膠電泳中圖分類號：TS202.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

透明質(zhì)酸（hyaluronan或hyaluronic acid，HA），俗稱玻璃尿酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖為重復(fù)雙糖單位，通過β（1-3）和β（1-4）糖苷鍵交替連接而成的大分子酸性黏多糖［1-3］，1934年由Meyer等人首次從牛玻璃球眼中提取獲得，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域。

HA以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能。由于HA具有良好的保濕性、黏彈性、滲透性和延展性，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛地應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域［4］。分子量大小對HA的生物活性影響較大，不同分子量范圍的HA表現(xiàn)出截然不同的生理學(xué)功能［5-7］。高分子量的HA（相對分子質(zhì)量＞2×106u）由于具有較好的潤滑、抑制炎性反應(yīng)、保濕等功能，可應(yīng)用在眼科手術(shù)黏彈劑、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療藥物和高端化妝品之中。中等分子量的HA（介于1× 105～106）具有良好的保濕性、潤滑和藥物緩釋作用，可廣泛用于滴眼液、皮膚燒傷愈合及術(shù)后防粘連等藥物中。低分子量的HA和寡聚透明質(zhì)酸，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的生物活性，具有抑制腫瘤擴(kuò)散、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)骨和血管生成、免疫調(diào)節(jié)等作用［8-10］，且易于滲透到真皮中，是免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子的激活劑。因此，水解制備小分子HA在食品保健、化妝品以及臨床醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

制備小分子HA的方法有物理降解法、化學(xué)降解法、酶解法［11］。物理法主要為加熱、機(jī)械剪切、紫外輻射、超聲波破碎、60Co照射、γ-射線輻射，可促使HA發(fā)生降解。物理降解法處理過程簡單，產(chǎn)品易于回收。但是，這些方法都存在一定的缺陷，例如加熱法易使HA變色，紫外和超聲效率較低，且產(chǎn)生的小分子HA分子量范圍較大，產(chǎn)品穩(wěn)定性差。HA的化學(xué)降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解（HCl）和堿水解（NaOH），氧化降解常用的氧化劑為次氯酸鈉（NaClO）和過氧化氫（H2O2）。但是，化學(xué)降解法引入了化學(xué)試劑，反應(yīng)條件復(fù)雜，易給HA性質(zhì)帶來影響和給產(chǎn)品的純化帶來困難，且產(chǎn)生大量的工業(yè)廢水。酶解法是HA在酶的作用下，HA鏈上的糖苷鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生小分子透明質(zhì)酸。但是，多數(shù)酶解效率不高，在緩沖液中進(jìn)行，水解產(chǎn)物含有較多雜質(zhì)，且產(chǎn)生的小分子透明質(zhì)酸分子量分布不集中［12］。本研究中，重組水蛭透明質(zhì)酸酶（hyalurondiase，HAase）水解HA，反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)，不在緩沖溶液中溶解透明質(zhì)酸，水解產(chǎn)生的小分子透明質(zhì)酸不含無機(jī)鹽等雜質(zhì)。通過控制重組水蛭HAase的量和水解時間，可以成功獲得分子量分布集中且純度較高小分子HA。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品（180，2 700，9 750，13 050，36 800，135350，2000000 u）購于中國食品藥品檢定研究院，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

透明質(zhì)酸酶P. pastoris GS115-HAase由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其特性以P. pastoris GS115為宿主，整合來自水蛭的透明質(zhì)酸酶基因（GenBank登錄號KJ026763），同時具有His +和Mut +表型，發(fā)酵產(chǎn)生重組水蛭透明質(zhì)酸酶。取所需量的發(fā)酵液在4℃、12 000 r/ min條件下離心30 min，上清液即為實(shí)驗(yàn)水解反應(yīng)所需的重組水蛭HAase，以HA為底物測定重組水蛭HAase活力，重組水蛭HAase活力測定方法采取DNS法［13-16］，最高酶活8. 42×105U/ mL［17］，根據(jù)所測酶活，計算出加入反應(yīng)體系的重組水蛭HAase體積。

1.2 儀器和設(shè)備

DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；DKB-600A型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；臺式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；GelDoc凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；1260型液相色譜，安捷倫科技有限公司；Ultrafle Xtreme型基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，美國布魯克公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分析透明質(zhì)酸水解過程

將60 mg大分子HA加入10 mL純水中，配制成為反應(yīng)底物溶液，加入重組水蛭HAase（1×104，5× 104，1×105U/ mL），在45℃最適條件下水解，每隔1 h取一次樣，樣品取出后立即水煮滅活，12 000 r/ min離心5 min，上清液通過0. 22 μm的濾膜除去雜質(zhì)。

1.3.2 高效體積排阻色譜測分子量大小及分布

用高效體積排阻色譜系統(tǒng)（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）分析分子量分布［18］。HPSEC體系是一套安捷倫1260系統(tǒng)，由G1310A泵和G1329B針頭和G1362A示差檢測器組成。分析條件為色譜柱Ultrahydrogel?Linear column 7. 8 mm×300 mm；流動相0. 1 mol/ L NaNO3溶液；流速0. 9 mL/ min；柱溫40℃；進(jìn)樣量40 μL。根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的洗脫體積，使用凝膠滲透色譜分析法（gel permeation chromatography，GPC）制作出分子量和洗脫體積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同的條件下，測出每個樣品的洗脫體積，GPC可計算出每個樣品的重均分子量、數(shù)均分子量及分子量分布。

1.3.3 一定分子量透明質(zhì)酸的制備

根據(jù)透明質(zhì)酸水解規(guī)律曲線，在特定時間點(diǎn)高溫將酶失活，終止反應(yīng)，即可制備一定分子量的透明質(zhì)酸，將樣品在-80℃冷凍，之后放入冷凍干燥機(jī)中凍干至粉末狀。

1.3.4 MALDI-TOF MS檢測終產(chǎn)物

基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）用來檢測水解產(chǎn)物［19］。將樣品和2，5-二羥基苯甲酸各1 μL混勻點(diǎn)靶，吹干后，在氮?dú)饧す獠ㄩL337 nm加速電壓20 kV和負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用Flex Control控制軟件和Flex Analysis versison 3. 3分析軟件。

1.3.5 瓊脂糖電泳檢測產(chǎn)物的分子量分布

稱取2 nmol樣品，加入5 μL ANTS溶液在室溫下放置15 min，再加入5 μL氰基硼氫化鈉，在37℃條件下放置16 h［20］。反應(yīng)后，將樣品在4℃，10 000 r/ min條件下離心10 min。取5 μL上清液點(diǎn)入3%的瓊脂糖凝膠孔中，在TBE緩沖液中，80 V電壓下電泳40 min。電泳后，瓊脂糖膠在365 nm的紫外燈下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA的水解過程分析

2.1.1 水解過程中pH值的變化

為檢測pH值的變化規(guī)律，每隔1 h使用pH計測量反應(yīng)溶液中的pH值，如圖1。

由圖1，3種酶活條件下pH值都沒有發(fā)生太大變化，保持在6. 0左右，且接近重組水蛭HAase的最適pH值6. 5。因此，重組水蛭HAase作用于HA無需在醋酸鹽緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液、檸檬酸緩沖液中進(jìn)行。從而實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)操作簡便化，達(dá)到產(chǎn)物純凈不含鹽雜質(zhì)的目的。

2.1.2 水解過程中酶活的變化

為了檢測反應(yīng)過程中酶在水中活性的變化，前2個小時，每個半小時取一次樣，之后每2個小時取一次樣。使用DNS法測定酶活，繪制酶活變化曲線圖2。

圖1 不同酶活條件下pH值變化趨勢Fig. 1 pH changing trend under conditions of different HAase activity

圖2 水中酶活的變化趨勢Fig. 2 HAase activity changing trend in water

由圖2發(fā)現(xiàn)酶活在一定范圍內(nèi)波動，直到16 h，酶活仍然很高，為反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行提供保障。

2.1.3 水解過程中分子量變化規(guī)律

使用HPLC-SEC-RI方法測定不同酶量（1× 104，5×104，1×105U/ mL）不同時間點(diǎn)水解產(chǎn)物的分子量，如圖3。

由圖3可知，水解15 h的分子量變化曲線圖?？梢园l(fā)現(xiàn)，初始反應(yīng)速率極大，分子量迅速降低，且酶活越高，分子量降低速率越快，隨后反應(yīng)速率逐漸降低，直至分子量幾乎不發(fā)生變化，且酶量越高，分子量越早不發(fā)生變化，分子量最終停滯在較低水平?？梢姡瑔挝惑w積的酶量越高，鏈斷裂的越快，且斷裂的越徹底。因此，制備聚合度不同透明質(zhì)酸，需要控制HAase的量和水解時間。

圖3 不同酶活條件下分子量變化趨勢Fig. 3 Molecular weight changing trend under the conditions of different HAase activity

2.2 特定分子量透明質(zhì)酸的質(zhì)量分布

根據(jù)水解過程中分子量變化曲線圖，通過控制加入的酶量和水解時間，可以制備出一定分子量的透明質(zhì)酸。加入酶量104U/ mL的條件下，水解40 min后高溫煮沸將酶滅活，終止整個反應(yīng)，樣品凍干后使用HPLC-SEC-RI方法測得透明質(zhì)酸分子量，見圖4，由圖4可知，透明質(zhì)酸分子質(zhì)量大小為6 000 u，分子量分布系數(shù)為1. 45。

圖4 分子質(zhì)量為6 000 u的質(zhì)量分布圖Fig. 4 Mass distribution of molecular mass 6 000 u

酶量5×104U/ mL的條件下，在40 min終止反應(yīng)，使用HPLC-SEC-RI方法測得分子量，見圖5。

由圖5可知，分子質(zhì)量大小為3 000 u的小分子透明質(zhì)酸，分子量分布系數(shù)1. 09。根據(jù)水解產(chǎn)物的分布系數(shù)可以看出，通過這種方法可以制備出分子量分布集中的小分子透明質(zhì)酸。

2.3 水解終產(chǎn)物的鑒定

MALDI-TOF MS可以準(zhǔn)確靈敏的檢測出糖類樣品的分子量信息。反應(yīng)體系中加入酶量1×105U/ mL，水解10 min終止反應(yīng)，樣品凍干后使用MALDI-TOF MS檢測，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物分子質(zhì)量有797. 192 0， 1 176. 282 0，1 555. 389 0，1 934. 51.2.u，分別是HA4，HA6，HA8，HA10的帶電粒子，如圖6；水解1 h終止反應(yīng)，檢測發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物分子質(zhì)量有797. 192 0 u和1 176. 282 0 u，是HA4，HA6帶電粒子。除基質(zhì)（基質(zhì)DHB中含NaCl）產(chǎn)生的峰外，不含其他大分子透明質(zhì)酸，如圖7。隨著水解時間延長，分子質(zhì)量不再發(fā)生變化（如圖3），經(jīng)檢測，15 h產(chǎn)物仍由透明質(zhì)酸四糖HA4和透明質(zhì)酸六糖HA6組成（如圖8），說明透明質(zhì)酸四糖HA4和透明質(zhì)酸六糖HA6是水解終產(chǎn)物。相比于其他水解酶，終產(chǎn)物僅有兩種，有利于實(shí)現(xiàn)HA4和HA6的大量生產(chǎn)和制備。

圖5 分子質(zhì)量為3 000 u的質(zhì)量分布圖Fig. 5 Mass distribution of molecular mass 3 000 u

圖6 水解中間產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析Fig. 6 MALDI-TOF MS analysis of hydrolysis of intermediate product

2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物

為了直觀顯示水解產(chǎn)物分子量分布情況，使用瓊脂糖凝膠電泳的方法對水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，將制備出的分子質(zhì)量大小為6 000，4 000，3 000 u HA片段及終產(chǎn)物染色后，在3%的瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果如圖9。1代表分子質(zhì)量大小6 000 u，2代表分子質(zhì)量大小4 000 u，3代表分子量大小3 000 u，4代表終產(chǎn)物?？梢?，每種樣品的電泳結(jié)果僅有一個條帶，說明水解產(chǎn)物分子量分布相對集中。與其他透明質(zhì)酸酶的水解產(chǎn)物相比，具有一定的優(yōu)勢，且?guī)Р粚?。說明重組水蛭HAase專一性強(qiáng)，可使用重組水蛭HAase水解HA制備分子量分布集中的HA片段。

圖7 水解終產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析Fig. 7 MALDI-TOF MS analysis of hydrolysis of end product

圖8 水解終產(chǎn)物的ESI-MS分析Fig. 8 ESI-MS analysis of hydrolysis of end product

圖9 不同分子質(zhì)量HA片段的瓊脂糖電泳分析Fig. 9 Agarose electrophoresis analysis of different molecular weight hyaluronan

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)重組水蛭HAase降解高分子HA可以在水溶液中進(jìn)行。水解結(jié)果顯示單位質(zhì)量的HA對應(yīng)的HAase的量、水解時間對水解產(chǎn)物具有重要的影響。通過控制HAase的量、水解時間來獲得分子量分布集中的小分子HA。與動物體內(nèi)提取的透明質(zhì)酸酶降解產(chǎn)物相比，本研究結(jié)果水解產(chǎn)物種類少，分子量分布集中，且不含無機(jī)鹽等雜志。因此，對于制備分子量分布集中的小分子HA和終產(chǎn)物HA4和HA6具有重要的意義，將會促進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的研究。對于潛在應(yīng)用領(lǐng)域，包括化學(xué)合成、藥物治療、化妝品和保健食品領(lǐng)域等，將會產(chǎn)生重大的影響。為了實(shí)現(xiàn)研究的價值，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和得到更廣泛的應(yīng)用，將進(jìn)一步擴(kuò)大反應(yīng)體系和優(yōu)化水解過程，制備出高純度的小分子透明質(zhì)酸。

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Preparation of Small Molecular Hyaluronan by Enzymatic Hydrolysis in Vitro

YUAN Panhong1， KANG Zhen1， JIN Peng1， LIU Long1，*， DU Guocheng1，2， CHEN Jian1，2
（1. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to get concentrated distribution of small molecular hyaluronan，6 g/ L of high molecular hyaluronic acid aqueous solution was prepared，added with a certain gradient of hyaluronidase，and controlling the hydrolysis time. The results showed that controlling the amount of hyaluronidase and hydrolysis time，particular molecular weight hyaluronic acid could be prepared according to the law of the hyaluronan molecular weight decreased，which included tetrasaccharide and hexasaccharide. Furthermore，through high performance size exclusion chromatography and agarose gel electrophoresis，we could prove that the molecular weight distribution of hydrolysate was concentrated.

hyaluronan；recombinant leech hyaluronidase；small molecular hyaluronan；high performance size exclusion chromatography；agarose gel electrophoresis

李 寧）

10. 3969/ j. issn. 2095-6002. 2016. 02. 008

2095-6002（2016）02-0051-05

原攀紅，康振，金鵬，等.體外酶法水解制備小分子透明質(zhì)酸［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34（2）:51-55.

YUAN Panhong，KANG Zhen，JIN Peng，et al. Preparation of small molecular hyaluronan by enzymatic hydrolysis in vitro［J］. Journal of Food Science and Technology，2016，34（2）:51-55.

2015-04-03

原攀紅，女，碩士研究生，研究方向?yàn)轶w外酶法水解制備小分子透明質(zhì)酸；

*劉 龍，男，教授，博士，主要從事發(fā)酵過程優(yōu)化方面的研究。通信作者。