程華方向東崔碩吳萌張昭軍李澤夏

（1.河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；2.中國科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101）

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在細(xì)胞中的表達(dá)

程華1方向東2崔碩1吳萌1張昭軍2李澤夏2

（1.河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；2.中國科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101）

構(gòu)建載體表達(dá)人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）蛋白，用以獲得抗GPC3單克隆抗體。用PCR技術(shù)擴(kuò)增GPC3基因，利用酶切位點(diǎn)將該序列插入p3XFLAG-CMV-14載體，構(gòu)建pCMV-gpc3表達(dá)載體。通過脂質(zhì)體將該載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)最終結(jié)果。收集穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，破碎，通過親和層析柱，獲得純度較高的GPC3蛋白。成功構(gòu)建pCMV-gpc3真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞后，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系；Western blot分析結(jié)果表明目的蛋白高效表達(dá)。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；真核表達(dá)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；親和純化

磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一個(gè)家族，參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等過程［1-3］。有研究表明，Glypican-3與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，特別是在肝細(xì)胞癌中特異性高表達(dá)，是一種潛在的肝癌血清學(xué)和組織學(xué)重要診斷標(biāo)志物［4-12］。另外，近期的研究表明GPC3不但能夠用于肝癌的診斷，而且具有抑制肝癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的功能［13］，該發(fā)現(xiàn)為肝癌的特異性治療提供了新的思路。

本研究利用真核表達(dá)載體和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得了穩(wěn)定表達(dá)Glypican-3的單克隆細(xì)胞系。通過大量培養(yǎng)、細(xì)胞破碎和親和純化，獲得了一定數(shù)量的GPC3蛋白，為進(jìn)一步研究GPC3的分子生物學(xué)特性和功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒 含GPC3基因的質(zhì)粒由德國洪堡大學(xué)病理學(xué)研究所Lage博士惠贈(zèng)；克隆菌株E.coli DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD18-T購自寶生物公司；人胚胎腎細(xì)胞HEK293購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共享平臺(tái)；表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-14購自Sigma公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRΙ和BamHΙ、T4連接酶、Pfu DNA聚合酶均購自New England Biolabs公司；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自美國熱電公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Life公司；ANTI-FLAG? M1 Agarose Affinity Gel及ANTIFLAG抗體購自Sigma公司；兔抗人GPC3蛋白和兔抗人β-actin抗體購自美國ABcom公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自北京華美公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，均購自美國GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)GPC3的基因閱讀框序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游引物：5'-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3'（下劃線部分為EcoR Ι酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3'（下劃線部分為BamH Ι酶切位點(diǎn)）。使用上述引物，以含GPC3基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸15 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 重組質(zhì)粒pMD18-gpc3的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，連入pMD18-T載體，產(chǎn)物用T4連接酶在16℃水浴中連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α菌株，篩選陽性克隆，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-gpc3。

1.2.3 重組質(zhì)粒pCMV-gpc3的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒pMD18-gpc3和質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-14分別用EcoR Ι和BamH Ι雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。取含有酶切位點(diǎn)的目的基因和經(jīng)雙酶切的p3XFLAG-CMV-14用T4連接酶在16℃水浴中連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α菌株，篩選陽性克隆，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-gpc3。

1.2.4 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng) HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用0.05%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，傳代比例為1∶3。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用PBS沖洗3次，加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染時(shí)設(shè)立陰性組（p3XFLAG-CMV-14）和陽性組（pCMV-gpc3質(zhì)粒）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用含有0.5 mg/L G418、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基加壓篩選，采用有限稀釋法原理將細(xì)胞轉(zhuǎn)至96孔板，每孔1-2個(gè)細(xì)胞。待96孔板內(nèi)細(xì)胞增殖成團(tuán)后，傳至細(xì)胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，最終得到穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的單克隆細(xì)胞株pCMV-gpc3/293和陰性對(duì)照組pCMV-gpc3/NC。

1.2.6 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GPC3蛋白表達(dá)水平 待穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株和HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約90%時(shí)，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，提取方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，參照文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行。

電泳結(jié)束后以恒壓90 V，利用半干轉(zhuǎn)移設(shè)備將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將轉(zhuǎn)好的膜浸入封閉液（含5%（M/V）脫脂奶粉的TBST中，室溫輕搖封閉2 h；以購買的兔抗人GPC3蛋白抗體、兔抗人β-actin和ANTI-FLAG抗體為一抗，用封閉液按1∶1 000稀釋，室溫輕搖孵育2 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，用封閉液按1∶10 000稀釋，室溫輕搖孵育1 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；ECL發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。

1.2.7 重組蛋白的分離純化及驗(yàn)證 大量培養(yǎng)篩選到的單克隆細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［14］的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，低溫離心取上清液按照ANTI-FLAG? M1 Agarose Affinity Gel試劑盒說明書進(jìn)行純化。采用超濾的方法濃縮重組蛋白，取適量蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，Western blot檢測(cè)重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 GPC3基因的擴(kuò)增

用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中以無菌水為模板的陰性對(duì)照組沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而以含GPC3基因的質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增到了一條長(zhǎng)1 650 bp的片段，結(jié)果（圖1）與預(yù)期大小相一致。

圖1 GPC3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-gpc3和表達(dá)質(zhì)粒pCMV-gpc3進(jìn)行EcoR Ι和BamH Ι雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖2）與預(yù)期大小相一致。質(zhì)粒pCMV-gpc3經(jīng)測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明插入片段與GenBank中公布的全序列中該片段完全一致，且以正確的方向插入到表達(dá)載體的克隆位點(diǎn)，真核表達(dá)載體質(zhì)粒pCMV-gpc3構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3 Western blot檢測(cè)GPC3蛋白表達(dá)水平

以購買商業(yè)化兔抗GPC3多抗、兔抗人β-actin多抗和ANTI-FLAG抗體為一抗，進(jìn)行Western blot分析鑒定，結(jié)果見圖3。在陽性細(xì)胞株pCMV-gpc3/293的總蛋白提取液中，無論是用兔抗GPC3多抗還是兔抗FLAG多抗，結(jié)果中都可以看到在65 kD左右的位置上有帶，而陰性細(xì)胞株pCMV-gpc3/ NC總蛋白則沒有任何顯色帶出現(xiàn)，表明陽性細(xì)胞株pCMV-gpc3/293成功表達(dá)出GPC3蛋白。同時(shí)作為參照，陽性細(xì)胞株和陰性細(xì)胞株的β-actin蛋白表達(dá)基本一致。

圖3 GPC3蛋白表達(dá)Western blot分析

2.4 重組蛋白的表達(dá)和純化

將經(jīng)過純化及濃縮的重組蛋白及細(xì)胞破碎產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4。由于真核細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的水平較低，為了獲得一定量的重組蛋白，本研究大量培養(yǎng)細(xì)胞，從1014個(gè)細(xì)胞中提取純化到0.1 mg重組蛋白，鑒于得率太低，研究組計(jì)劃優(yōu)化培養(yǎng)條件，以獲得更高的得率和重組蛋白。從圖4中可以看出，經(jīng)過純化及濃縮后，得到了一個(gè)分子量約為65 kD的蛋白條帶，與Western blot檢測(cè)一致（圖5）。

3 討論

目前，我國惡性腫瘤已經(jīng)排在居民主要疾病死亡率的首位，成為影響人們健康的頭號(hào)殺手。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明2010年全國惡性腫瘤發(fā)病率為235.23/10萬。其中，肝癌（特別是原發(fā)性肝細(xì)胞癌）的死亡率僅次于胃癌，已經(jīng)成為我國的第二大癌癥［15］。發(fā)現(xiàn)并確定新的肝癌早期診斷、治療靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值［16，17］。最近，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為一種新的肝癌腫瘤標(biāo)志物被國內(nèi)外研究人員提出。研究人員發(fā)現(xiàn)GPC3在多個(gè)腫瘤組織中特異表達(dá)，特別是在肝癌中的特異性高表達(dá)，使我們看到了其成為繼AFP后又一個(gè)肝癌腫瘤標(biāo)志物的前景。

圖4 純化后GPC3蛋白SDS-PAGE電泳分析

圖5 純化后GPC3蛋白Western blot分析

Shirakawa等［18］利用免疫組化的方法對(duì)3種原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma HCC，intrahepatic cholangiocarcinoma ICC，combined hepatocellular and cholangiocarcinoma CHC）組織中的GPC3蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)ICC病例組織中不表達(dá)GPC3蛋白，CHC病例中部分表達(dá)GPC3蛋白，而在HCC病例組織中大量表達(dá)78.3%（36/46），所以作者最終得出GPC3蛋白對(duì)于HCC具有特異性的結(jié)論。付順軍等［19］利用酶聯(lián)免疫和化學(xué)發(fā)光的方法，對(duì)健康者、肝硬化患者和肝癌確診病例血清中的GPC3和AFP含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)健康者和肝硬化患者血清中的GPC3濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而肝癌患者血清中的GPC3濃度與健康者和肝硬化患者血清有顯著的差異，表明GPC3對(duì)肝癌有較高的敏感性和特異性。當(dāng)GPC3以3 μg/L，AFP以20 μg/L為診斷界限時(shí)，GPC3的敏感性要高于AFP。Akutsu等［20］利用商品化的ELISA試劑盒檢測(cè)血清中的GPC3含量，發(fā)現(xiàn)健康者和乙肝患者的含量均低于閾值，HCC患者中有50%（32/64）的含量高于閾值，HCC的平均含量明顯高于非HCC。

為了探究GPC3與肝癌的關(guān)系，獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)品的抗GPC3抗體，進(jìn)而開發(fā)肝癌早期診斷方法，本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-gpc3。經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，得到能夠穩(wěn)定表達(dá)GPC3的細(xì)胞株。最終通過高效表達(dá)、提取和純化等過程獲得了一定量純度較好的重組GPC3蛋白。選用真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-14及HEK293細(xì)胞宿主是因?yàn)镚PC3是一個(gè)糖蛋白，只有在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，才能夠最接近于其天然的狀態(tài)。目前，已經(jīng)有多個(gè)研究小組利用HEK293細(xì)胞無基礎(chǔ)性表達(dá)GPC3的特性進(jìn)行GPC3的相關(guān)研究［21，22］，同時(shí)p3XFLAG-CMV系統(tǒng)是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有高效的強(qiáng)啟動(dòng)子CMV啟動(dòng)子，有利于目的蛋白的高效表達(dá)。并且表達(dá)的蛋白中含F(xiàn)LAG標(biāo)簽，利用FLAG親和純化層析柱，能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，且純度非常高，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-gpc3。經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，得到能夠穩(wěn)定表達(dá)GPC3的細(xì)胞株。最終通過高效表達(dá)、提取和純化等過程獲得了一定量純度較好的重組GPC3蛋白。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Eukaryotic Expression Vector for Glypican-3 and Its Expression in Cell

CHENG Hua1FANG Xiang-dong2CUI Shuo1WU Meng1ZHANG Zhao-jun2LI Ze-xia2
（1. Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081；2. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

This work aims to construct the eukaryotic expression vector of glypican-3（GPC3）for acquiring anti-GPC3 monoclonal antibody. The GPC3 gene was amplified by PCR and was cloned into an expression vector p3XFLAG-CMV-14，and the expression vector pCMV-gpc3 was constructed. HEK293 cells were transfected with the vector by liposome，and the final results were detected by Western blot. The stably-expressed cells were collected and ground，and the high-purity GPC3 protein was obtained by affinity column. The eukaryotic expression vector of pCMV-gpc3 was constructed successfully. After the transfection to HEK293 cells，the monoclonal cell line of stablyexpressed was gained by G418 screening. Western blot analysis revealed that the target protein expressed markedly. A large number of GPC3 proteins were obtained via genetic engineering and purifying technology，which laid a foundation for the biological function and application of the protein as well as the preparation of monoclonal antibody.

glypican-3；eukaryotic expression；liposome transfection；affinity purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.019

2015-07-28

河北省科學(xué)院高層次人才資助項(xiàng)目（20150503LR62-9），河北省科學(xué)院科技計(jì)劃項(xiàng)目（13335）

程華，男，副研究員，研究方向：腫瘤早期診斷及相關(guān)機(jī)理；E-mail：cheng_hua@sina.com