鄧瑞雪蒙學(xué)蓮曾巧英才學(xué)鵬

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

小反芻獸疫病毒F基因缺失體的克隆、表達(dá)及鑒定

鄧瑞雪1蒙學(xué)蓮2曾巧英1才學(xué)鵬2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

旨在研究小反芻獸疫病毒（PPRV）囊膜與宿主細(xì)胞的融合機(jī)制，構(gòu)建F基因缺失體，并且在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。鑒于F基因中包含的兩段保守序列HR1和HR2在融合過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用，分別構(gòu)建pET30a-HR1和pET30a-HR2原核表達(dá)載體，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在最優(yōu)表達(dá)條件下大量表達(dá)，并利用鎳瓊脂糖凝膠純化蛋白。結(jié)果顯示，獲得的重組蛋白與預(yù)期大小一致且以可溶性方式表達(dá)，純化的蛋白純度大于90%；重組蛋白與抗His標(biāo)簽抗體和抗PPRV Nigeria 75/1株陽(yáng)性血清均能發(fā)生反應(yīng)，證明重組蛋白具有反應(yīng)原性。

F基因缺失體；原核表達(dá)；小反芻獸疫病毒

小反芻獸疫（PPR），俗稱羊瘟，是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）小反芻獸疫病毒（PPR virus，PPRV）引起的一種烈性、接觸性傳染病，主要感染山羊和綿羊［1］。該病危害嚴(yán)重，發(fā)病率達(dá)100%，若伴發(fā)其他疾病其死亡率可達(dá)100%，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）法定必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)部制定的《法定動(dòng)物疫病病種名錄》中規(guī)定的Ⅰ類動(dòng)物疫病［2］。自2007年我國(guó)西藏首次發(fā)生PPR疫情疫情以來(lái)，該病已在我國(guó)20多個(gè)省 份發(fā)生，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖戶造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

PPRV基因組是單股負(fù)鏈無(wú)節(jié)段RNA，共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、囊膜基質(zhì)蛋白（M）、纖突糖蛋白（F）、血凝素（H）和大蛋白（L）以及 C、V非結(jié)構(gòu)蛋白。F蛋白和H蛋白是構(gòu)成病毒表面纖突的兩種糖蛋白，是決定病毒感染成功與否的關(guān)鍵因素，其中F蛋白通過(guò)促進(jìn)病毒囊膜和細(xì)胞膜融合，使直接釋放的N蛋白進(jìn)入細(xì)胞漿，從而幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞［3］。一般認(rèn)為副黏科病毒的F蛋白促使細(xì)胞融合必須與H蛋白或HN蛋白共同參與，但有實(shí)驗(yàn)表明，PPRV F蛋白可使雞紅細(xì)胞溶解，在感染初期可導(dǎo)致溶血和細(xì)胞融合［1，4］。由此證明，PPRV F蛋白在無(wú)HN蛋白參與的情況下仍能表現(xiàn)出融合功能。

作為融合的直接作用蛋白，F(xiàn)蛋白不僅直接參與病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，而且也可以介導(dǎo)宿主臨近細(xì)胞間的融合。F蛋白為了獲得融合活性，必須由無(wú)生物學(xué)活性F0前體形式裂解成二硫鍵連接的融合前形式F1+F2異源二聚體，F(xiàn)1形成了膜錨定亞單位，這個(gè)亞單位在副黏病毒中有一些保守序列，其中有4個(gè)片段已經(jīng)被深入研究，這4個(gè)片段分別是位于新生成N-端的融合多肽（FP）、2個(gè)七肽重復(fù)區(qū)（HR1和HR2）以及跨膜區(qū)（TM）。這些保守序列編譯的多肽FP、HR1、HR2和TM共同介導(dǎo)宿主細(xì)胞膜和病毒囊膜的融合，在融合過(guò)程中，F(xiàn)P插入到宿主細(xì)胞膜，HR1和HR2相互作用使得病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜相互靠近，它們的靠近進(jìn)一步引起了融合［5，6］。F蛋白HR1和HR2在融合觸發(fā)時(shí)重新定位，形成穩(wěn)定的六螺旋束（6-HB），在PPRV-F蛋白HR1和HR2形成的六螺旋束中，HR1是三聚體，HR2是單體。PPRV-F蛋白的HR1和HR2均能影響合胞體的形成，而且HR2的影響效果更強(qiáng)，F(xiàn)P在發(fā)揮融合活性時(shí)可能插入靶細(xì)胞膜中啟動(dòng)融合過(guò)程。

因此，鑒于F蛋白HR1和HR2在病毒融合過(guò)程的重要作用，本研究對(duì)小反芻獸疫的 F蛋白的七肽重復(fù)區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，旨在獲得高純度的蛋白抗原，為進(jìn)一步研究小反芻獸疫病毒F蛋白介導(dǎo)的融合過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體 pET-30a（+）、質(zhì)粒PCAGGSFLAG-F，羊抗 PPRV Nigeria75/1 株多克隆抗體均由家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T Simple Vector、Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0）購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌Trans5α Chemically Competent Cell，BL21（DE3）Chemically Competent Cell購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購(gòu)自NEB，T4連接酶購(gòu)自 Promega，Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Goat Anti-Mouse IgG/HRP antibody購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司，Biodlight Western Chemiluminescent HRP Substrate購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司；鎳瓊脂糖凝膠 FF購(gòu)自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根根據(jù)PPRV Nigeria75/1中F基因堿基序列，利用Oligo 6.0分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增F基因HR1和HR2的特異性引物，分別在兩對(duì)引物的上游、下游引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)（表1）。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建 以本實(shí)驗(yàn)室保存的F基因全長(zhǎng)PCAGGS-FLAG-F質(zhì)粒為模板，分別以兩對(duì)特異性引物PCR擴(kuò)增獲得目的基因。反應(yīng)體系為50 mL：上、下游引物各2 mL，2×Premix Taq 25 mL，模板1 mL，ddH2O 20 mL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；95℃ 1 min，54℃ 40 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。切膠回收目的片段，對(duì)目的片段及載體進(jìn)行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，PCR及雙酶切鑒定，將初步鑒定的陽(yáng)性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)菌株的確定 將篩選出的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3），挑取單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，選取陽(yáng)性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的分別命名為pET30a-HR1和pET30a-HR2。

1.2.4 重組蛋白表達(dá) 將過(guò)夜培養(yǎng)的陽(yáng)性pET30a-HR1和pET30a-HR2重組菌液按1%的量分別轉(zhuǎn)接于含50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)6 h，離心收集菌液，-70℃凍融3次，冰浴中超聲裂解20 min，然后13 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀，用與上清等體積的PBS重懸沉淀，將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 重組蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件的確定 選取表達(dá)克隆，過(guò)夜培養(yǎng)，按1%的比例分別轉(zhuǎn)接于含50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)分成三組，第一組誘導(dǎo)的條件為37℃、6 h，IPTG的終濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L；第二組誘導(dǎo)溫度37℃，IPTG終濃度1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間依次為2、4和6 h；第三組誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)溫度依次為21℃、28℃和37℃。收集菌體，8 mol/L尿素裂解，SDS-PAGE分析對(duì)比確定最優(yōu)表達(dá)條件。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的純化 在最優(yōu)條件下大量表達(dá)重組蛋白，12 000 r/min離心5 min，PBS洗2次，按照每克菌體濕重加10 mL PBS的比例重懸，-70℃凍融3次，冰浴中超聲裂解，13 000 r/min離心15 min，收集上清，按照鎳瓊脂糖凝膠 FF說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 將純化重組蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，用eBlotTMProtein Transfer System轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，用PBST洗滌3次，每次10 min；加入Mouse Anti-His Tag Monoclonal Antibody（1∶1 000），37℃孵育1 h，同上洗滌；加入Goat Anti-Mouse IgG/HRP antibody（1∶4 000），37℃孵育40 min，同上洗滌后用Biodlight Western Chemiluminescent HRP Substrate顯色試劑盒進(jìn)行ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀分析。平行實(shí)驗(yàn)以兔抗PPRV Nigeria 75/1株F蛋白多克隆抗體為一抗（按1∶50稀釋），Mouse Anti-Rabbit IgG/HRP antibody（按1∶4 000稀釋）為二抗進(jìn)行Western blot，對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行免疫活性分析。

2 結(jié)果

2.1 HR1和HR2基因的擴(kuò)增

根據(jù)所設(shè)計(jì)的特異性引物，以PCAGGS-FLAG-F重組質(zhì)粒為模板，成功擴(kuò)增獲得了與預(yù)期目的條帶大小一致的條帶，HR1大小為189 bp，HR2大小為153 bp（圖1）。

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增

2.2 HR1和HR2基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

回收純化目的條帶，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-30a（+），將目的產(chǎn)物亞克隆至pET-30a（+），獲得重組質(zhì)粒pET-30a（+）/HR1、pET-30a（+）/HR2，經(jīng)雙酶切（圖2）、PCR 鑒定結(jié)果正確，測(cè)序結(jié)果與原序列一致，成功構(gòu)建了HR1和HR2的原核表達(dá)載體。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析結(jié)果（圖3）表明，在37℃、IPTG終濃度為1 mmol/L的條件下誘導(dǎo)6 h獲得了與目的蛋白大小接近的重組蛋白，而轉(zhuǎn)染空載體pET-30a（+）的菌株在相同條件下未表達(dá)出相應(yīng)的蛋白條帶，并且重組蛋白大多數(shù)出現(xiàn)在上清中，說(shuō)明所表達(dá)的蛋白為可溶性表達(dá)。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度、時(shí)間及誘導(dǎo)劑IPTG用量的篩選，確定構(gòu)建的原核基因工程菌最佳反應(yīng)條件pET-30a（+）-HR1為28℃、IPTG終濃度為1 mmol/L、200 r/min、誘導(dǎo)6 h，pET-30a（+）-HR2為28℃、IPTG終濃度為0.4 mmol/L、200 r/min、誘導(dǎo)6 h。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物純化結(jié)果

將超聲裂解所得的上清與鎳瓊脂糖凝膠FF混合均勻，用不同咪唑濃度的緩沖液洗脫，SDS-PAGE電泳。結(jié)果（圖4）顯示，pET30a-HR1在300 mmol/L咪唑濃度時(shí)，目的蛋白的洗脫量最大，雜質(zhì)蛋白量最??；pET30a-HR2在100 mmol/L咪唑濃度時(shí)，目的蛋白的洗脫量最大，雜質(zhì)蛋白量最小。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物純化結(jié)果SDS-PAGE分析

2.6 Western blotting分析

用抗His標(biāo)簽抗體作為一抗的Western blotting鑒定，結(jié)果（圖5）顯示，誘導(dǎo)后的pET-30a（+）-HR1/BL21（DE3）和pET-30a（+）-HR2/BL21（DE3）均在預(yù)期分子量大小處出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明重組蛋白獲得表達(dá)，且與His標(biāo)簽表達(dá)為融合蛋白，利于后續(xù)的蛋白純化。用羊抗PPRV Nigeria 75/1株多克隆抗體作為一抗的Western blotting結(jié)果（圖6）顯示，與抗His標(biāo)簽的抗體作為一抗的結(jié)果一致，證明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖5 純化的表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析

圖6 純化的表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析

3 討論

在病毒感染過(guò)程中，病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜的融合是非常重要的一步。作為融合的直接作用蛋白，副黏科病毒F蛋白不僅直接參與病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，也可以介導(dǎo)宿主臨近細(xì)胞間的融合。

在F蛋白介導(dǎo)的宿主細(xì)胞和病毒囊膜的融合過(guò)程中，F(xiàn)基因的保守序列表達(dá)的融合多肽FP、2個(gè)七肽重復(fù)區(qū)蛋白HR1和HR2以及跨膜區(qū)蛋白TM起著重要的作用，其中HR1和HR2可以拉近病毒囊膜蛋白和宿主細(xì)胞受體的距離，進(jìn)而導(dǎo)致了融合。在PPRV-F蛋白HR1和HR2形成的六螺旋束中，HR1是三聚體，HR2是單體，即HR1分子以α螺旋的形式形成三聚體核心，HR2分子同樣以α螺旋的形式反向平行結(jié)合于HR1分子形成的溝槽中，這種結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是F蛋白最穩(wěn)定的構(gòu)象。雖然F蛋白晶體結(jié)構(gòu)中缺乏TM區(qū)的結(jié)構(gòu)，但最近的研究表明副黏病毒F蛋白TM區(qū)是蛋白錨定于細(xì)胞膜所必需的，TM區(qū)連接到三聚體上可能有助于穩(wěn)定融合前構(gòu)象。F蛋白的重折疊產(chǎn)生了新的亞基，破壞了許多融合前的構(gòu)象，整體上產(chǎn)生一種更緊湊和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)P采用一種對(duì)融合具有重要意義的螺旋結(jié)構(gòu)，而且FP的結(jié)構(gòu)與自身和TM都相關(guān)［7，8］。有報(bào)道認(rèn)為一些副黏病毒的胞質(zhì)區(qū)也與融合活性有關(guān)。

在副黏病毒感染中，抗F蛋白的抗體對(duì)阻止感染和防止病毒在體內(nèi)的擴(kuò)散起主要作用［9］，蛋白單抗能完全抑制新城疫病毒（NDV）在雞體內(nèi)的生長(zhǎng)，防止雞群死亡［10］。NDV F蛋白DNA疫苗能夠有效保護(hù)雞群抵抗強(qiáng)毒NDV的感染［11-13］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)F蛋白的研究日益增多。在參與VLPs裝配方面，證明編碼F蛋白的基因參與了NDV［14］和MV［15，16］的VLPs裝配。PPRV F蛋白TM區(qū)對(duì)VLPs的裝配和釋放無(wú)明顯影響，但會(huì)對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)產(chǎn)生影響［17］。Rahaman等［18］證明PPRV F蛋白的HR1和HR2均能抑制合胞體的形成，而且HR2的抑制效果更強(qiáng)。目前，HR1或HR2單獨(dú)介導(dǎo)宿主細(xì)胞膜和病毒囊膜的融合機(jī)制還不清楚。

在原核表達(dá)系統(tǒng)中，雖然蛋白多易以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致蛋白不能正確折疊成天然結(jié)構(gòu)而無(wú)生物學(xué)活性，但由于目的蛋白、載體及表達(dá)條件的不同，也可表達(dá)出有活性的重組蛋白。在pET系統(tǒng)中，鑒于pET30a（+）載體具有標(biāo)簽小、影響較小的優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用pET30a（+）作為載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a/HR1和pET30a/HR2，并設(shè)置了不同的表達(dá)條件，期望表達(dá)出可溶性的、有活性的蛋白。

Western blotting結(jié)果表明，分別以抗His標(biāo)簽的抗體和抗PPRV的陽(yáng)性血清作為一抗，重組工程菌誘導(dǎo)表達(dá)樣品均在預(yù)期分子量大小處檢測(cè)到特異性條帶，而陰性對(duì)照中未出現(xiàn)大小一致的條帶，這說(shuō)明成功表達(dá)了融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白具有良好的特異性和免疫反應(yīng)性。這為后續(xù)研究PPRV F基因缺失體對(duì)病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜融合的影響奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

構(gòu)建pET30a（+）/HR1和pET30a（+）/HR2重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化BL21（DE3），在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)出帶His標(biāo)簽的融合蛋白，最佳表達(dá)條件分別為：pET-30a（+）-HR1誘導(dǎo)溫度28℃、IPTG終濃度為1 mmol/L、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、誘導(dǎo)時(shí)間6 h；pET-30a（+）-HR2誘導(dǎo)溫度28℃、IPTG終濃度為0.4 mmol/L、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、誘導(dǎo)時(shí)間6 h。通過(guò)鎳瓊脂糖凝膠 FF分離出高純度的融合His標(biāo)簽的蛋白。

Western blotting分析顯示，這兩種蛋白與抗His標(biāo)簽的抗體和抗PPRV Nigeria 75/1株多克隆抗體均能發(fā)生特異性反應(yīng)，即重組蛋白具有良好的特異性和反應(yīng)原性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning，Expression and Identification of F Gene Deletants from Peste Des Petits Ruminants Virus

DENG Rui-xue1MENG Xue-lian2ZENG Qiao-ying1CAI Xue-peng2
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046）

The F gene deletants were constructed and expressed in prokaryotic cell in order to clarify the fusion mechanism between the envelope of peste des petits ruminants virus（PPRV）and the host cells. Considering the key roles in the fusion process，HR1 and HR2，the two conserved fragments of F gene，were cloned into prokaryotic expression vector pET-30a，respectively. The recombinant plasmid pET30a-HR1 and pET30a-HR2 with the confirmed correct sequences were transformed into Escherichia coli BL21（DE3）and expressed by the induction of IPTG. The fusion proteins were largely expressed under the optimal condition and purified using the nickel agarose gel. The results showed that the relative molecular masses of the fusion proteins expressed in form of soluble protein were consistent with the expectation，and the purities of the expressed proteins were over 90%. The fusion proteins reacted with both anti-His tag antibody and anti-PPRV Nigeria75/1 positive serum，indicating that the fusion protein had reactionogenicity.

F gene deletant；prokaryotic expression；peste des petits ruminants virus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.031

2015-12-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300142），蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013-4-40）

鄧瑞雪，男，碩士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)；E-mail：drxd1@163.com

曾巧英，女，教授，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)；E-mail：zengqy@gsau.edu.cn

才學(xué)鵬，男，研究員，研究方向：家畜寄生蟲(chóng)的研究；E-mail：caixp@163.vip.com