郭會燦

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程系，石家莊 050081）

重組天花粉蛋白與YH-16聯(lián)合用藥抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖及成瘤

郭會燦

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程系，石家莊 050081）

獲得人源天花粉蛋白并研究其與YH-16聯(lián)合用藥對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10增殖及成瘤的作用。以大腸桿菌BL21重組表達(dá)天花粉蛋白rTCS并以親和層析法純化rTCS；以MTT法檢測rTCS、YH-16、rTCS+YH-16對B16-F10細(xì)胞生長的影響；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測rTCS、rTCS+YH-16對瘤體生長的作用。結(jié)果表明，獲得了電泳純重組天花粉蛋白rTCS；rTCS可顯著抑制B16-F10細(xì)胞增殖，并且抑制率顯著高于YH-16組，但是rTCS與YH-16聯(lián)合處理組并未比rTCS組有顯著差異；rTCS與YH-16聯(lián)合用藥明顯抑制B16-F10細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤。重組天花粉蛋白rTCS聯(lián)合YH-16用藥對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的增殖及成瘤有顯著抑制作用。聯(lián)合策略將為治療黑色素瘤患者提供新的契機(jī)。

天花粉蛋白；YH-16；B16-F10；腫瘤；聯(lián)合治療

黑色素瘤是一類高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生命安全。弱免疫原性及豐富的腫瘤外周血管生成是黑色素瘤的兩大特征，也是實(shí)體腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視及獲取充足營養(yǎng)的兩條重要途徑［1］。因而設(shè)計(jì)新治療策略同時(shí)增強(qiáng)對黑色素瘤的免疫殺傷效應(yīng)及阻斷腫瘤外周血管生成對治療黑色素瘤有重要臨床意義。

天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）是一種提取自栝樓塊根中的堿性單鏈核糖體失活蛋白（Ribosome inactivating protein，RIP），其N-糖苷酶活性，能水解斷裂真核細(xì)胞核糖體28S rRNA 腺苷酸的N-C 糖苷鍵，不可逆失活核糖體，從而抑制蛋白質(zhì)的合成［2］。大量研究數(shù)據(jù)表明天花粉蛋白具有正向免疫調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［3-6］。YH-16，又名恩度，是一類來源于血管基底膜膠原的大分子膜蛋白，由基質(zhì)金屬蛋白酶水解釋放得到，已被成功開發(fā)并應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的治療，其作用機(jī)制是抑制腫瘤的血管生成，切斷腫瘤細(xì)胞能量及營養(yǎng)供應(yīng)，從而達(dá)到治療腫瘤的效果［7，8］。

據(jù)此，本研究借助基因工程方法重組表達(dá)天花粉蛋白并分析其對黑色素瘤細(xì)胞的增殖及體內(nèi)成瘤的影響，同時(shí)考察天花粉蛋白與YH-16聯(lián)合用藥對黑色素瘤的治療效果，以期為開發(fā)黑色素瘤治療提供新的契機(jī)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)動物 黑色素瘤細(xì)胞B16購自中科院上海細(xì)胞所；C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡購自南京醫(yī)科大學(xué)動物中心。

1.1.2 主要試劑 蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、誘導(dǎo)劑IPTG與雙抗（100 μg/mL的鏈霉素、100 U/mL的青霉素）購自上海生工生物工程公司；YH-16購自煙臺麥得津生物公司；抗TCS抗體購自Santa Cruz公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Invitrogen公司；MTT（methylthiazolyl tetrazolium）購自美國Fluka公司；胰RNase購自美國Sigma公司；DH5α及BL21細(xì)胞購自南京天根生物有限公司；Taq酶購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pET22b-rTCS的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物PF、PR，在其兩端分別添加Nde I及Nhe I酶切位點(diǎn)，以本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pbs-rTCS為模板，PCR擴(kuò)增rTCS基因片段并進(jìn)行T-A克隆。經(jīng)酶切鑒定及DNA測序得到正確質(zhì)粒pMD18T-rTCS；然后用Nde Ι及Nhe Ι酶同時(shí)處理質(zhì)粒pMD18T-rTCS與pET-22b，膠回收目的片段，并經(jīng)T4 ligase連接過夜。轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，篩選陽性菌株。

1.2.2 重組rTCS的表達(dá)、純化及Western blot鑒定 隨機(jī)挑選幾個(gè)單克隆，分別以2 mL LB培養(yǎng)基37℃，250 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，然后按照1%轉(zhuǎn)接至50 mL LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至吸光度OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.42 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)5 h取樣1 mL離心、收集菌體。加入70 μL水及15 μL 5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，離心2 min，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)。

以鎳柱純化重組天花粉蛋白rTCS，具體如下：取3 mL鎳柱填料裝柱，以5倍柱體積去離子水沖洗，以5倍柱體積磷酸鹽緩沖液平衡，進(jìn)樣，收集穿透液。再以10 mL含50、100和200 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液依次線性過柱并收集洗脫液。最后以5倍柱體積去離子水洗脫柱并保存在20%乙醇溶液中，于4℃放置。

以抗天花粉蛋白抗體鑒定重組表達(dá)的rTCS。對rTCS進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析并剪下含rTCS的膠條，轉(zhuǎn)膜250 mA恒流轉(zhuǎn)30 min；電轉(zhuǎn)完成后取下PVDF膜并作好標(biāo)記置于含5%的脫脂奶粉（TBS配制）中封閉，37℃，1 h低速震蕩。加入一抗（用封閉液稀釋），4℃搖床孵育過夜。棄一抗溶液，用TBST洗滌5 min左右，3次。加入二抗（用TBS稀釋），室溫下于搖床孵育1 h。棄二抗溶液，用TBST洗滌5 min左右，3次。以ECL法檢測特異結(jié)合的抗體，對照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將X膠片晾干掃描保存。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期B16-F10細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為每孔100 μL含1×104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后分別加入不同濃度的重組rTCS繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對照組加等體積PBS。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL濃度為5 mg/mL的 MTT，37℃繼續(xù)溫育4 h。吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO，室溫震蕩溶解結(jié)晶10 min。于570 nm（吸收波長）和630 nm（參比波長）處測吸光光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下：

1.2.4 小鼠荷瘤及給藥 調(diào)整B16-F10細(xì)胞密度為1×107/mL，經(jīng)小鼠腹部皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液，從第6天開始，小鼠隨機(jī)分為3組（6只每組）給藥：rTCS組（5 mg/kg/day，i.p.）、rTCS（5 mg/kg/day，i.p.）+YH-16組（1 mg/kg/day，i.p.）及等量PBS對照組，隔天給藥7次，至第18天處死小鼠剝瘤，測量瘤體積V=ab2/2（a為長度，b為寬度）。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss16.0處理，數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(yàn)，顯著性差異P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-rTCS

經(jīng)過PCR擴(kuò)增、兩步酶切、連接及驗(yàn)證，天花粉蛋白基因編碼區(qū)（CDS區(qū)）被成功插入表達(dá)載體pET-22b（圖1-A），DNA測序進(jìn)一步證明該克隆的rTCS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中報(bào)道序列完全一致。

2.2 重組rTCS的表達(dá)、純化及免疫鑒定

如圖1-B，重組天花粉蛋白rTCS在BL21工程菌中經(jīng)過0.42 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h后得到高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到200 mg/L，而且rTCS是可溶性表達(dá)。與NCBI數(shù)據(jù)庫中報(bào)道一致，rTCS分子量在30 kD左右，其電泳條帶位于25-35 kD之間。

經(jīng)0-200 mmol/L咪唑線性濃度洗脫，在120 mmol/L咪唑濃度處rTCS被成功洗脫，純度達(dá)到電泳純（圖1-C）。進(jìn)一步免疫印跡實(shí)驗(yàn)（圖1-D）表明純化的蛋白即是rTCS。

2.3 重組rTCS抑制黑色素瘤細(xì)胞B16-F10增殖

研究報(bào)道天花粉蛋白能抑制肺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖、促進(jìn)HeLa、HL-60細(xì)胞的凋亡［3-6，9，10］。如圖2-A，與對照PBS組相比，rTCS對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的生長有顯著抑制作用。在120 μg/mL時(shí)，rTCS對B16-F10細(xì)胞的生長抑制率達(dá)到約60%，在480 μg/mL時(shí)，其抑制率為95.3%。因此，rTCS對B16-F10細(xì)胞的抑制效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。

YH-16已經(jīng)被用于治療小細(xì)胞肺癌患者。我們的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)120 μg/mL rTCS對B16-F10細(xì)胞的抑制率顯著高于5 μg/mL YH-16單獨(dú)處理組（54.7% vs 33.7%）， 但 是120 μg/mL rTCS聯(lián) 合5 μg/mL YH-16處理組對B16-F10細(xì)胞的抑制率約60.4%，與rTCS單獨(dú)處理組無顯著性差異（圖2-B）。

圖1 rTCS的表達(dá)、純化及鑒定

2.4 重組TCS聯(lián)合YH-16對荷B16-F10瘤體生長的作用

黑色素瘤細(xì)胞B16-F10移植瘤小鼠實(shí)驗(yàn)（圖3）顯示，相對于PBS對照組，rTCS處理組及rTCS+YH-16聯(lián)合處理組的腫瘤生長明顯被阻滯。從接種第6天開始給藥，第12天時(shí)，rTCS處理組及rTCS+YH-16聯(lián)合處理組的腫瘤體積顯著小于對照組，并且聯(lián)合處理組比rTCS組瘤體積也明顯減小。第18天時(shí)，處死小鼠后對瘤體稱重發(fā)現(xiàn)，rTCS單獨(dú)處理組瘤體僅15 mg左右，而聯(lián)合處理組基本無肉眼可見瘤體。

在給藥第12天開始，rTCS單獨(dú)處理組及與YH-16聯(lián)合用藥組顯著抑制B16-F10細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤。而且聯(lián)合處理組在第18天時(shí)基本無可觸及的瘤體。

圖2 rTCS與YH-16對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的抑制效應(yīng)

圖3 rTCS抑制B16-F10細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤

3 討論

黑色素瘤是一類轉(zhuǎn)移性極高的惡性腫瘤，盡管歷經(jīng)幾十年的治療，人類對該病的治療手段主要還是手術(shù)、放化療。而這些傳統(tǒng)方法雖然有一定療效，但是其給患者帶來痛苦的副作用。進(jìn)入新世紀(jì)，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤是一類高異質(zhì)性疾病，多種因素都能引發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。其中腫瘤的免疫原性降低與大量的血管供應(yīng)對促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。因此研究人員開發(fā)了一系列增強(qiáng)腫瘤患者免疫能力以及減少血管生成的藥物，如白介素IL-2、GM-CSF、TCS、YH-16等［4，7，11，12］。

針對腫瘤的多方面誘導(dǎo)因素，研究人員開展了聯(lián)合治療研究，該策略可以靶向腫瘤的多個(gè)靶點(diǎn)，從而達(dá)到更強(qiáng)效、更徹底治療腫瘤的目的。研究數(shù)據(jù)也證實(shí)化療與免疫治療、兩種免疫治療、抗血管生成治療與免疫治療的聯(lián)合策略顯示了單一療法沒有的優(yōu)勢［12-14］。

本研究中的天花粉蛋白rTCS具有正向免疫調(diào)控的作用，對多種腫瘤細(xì)胞都顯示了較強(qiáng)的抑制生長作用，而且天花粉蛋白能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡［6］。而YH-16已成功上市，其機(jī)理就是抑制腫瘤的血管生成［7］。因此本研究采用聯(lián)合治療策略，同時(shí)給藥rTCS與YH-16，希望能促進(jìn)腫瘤免疫殺傷與抑制血管生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)相對單一的治療，聯(lián)合用藥組顯示更強(qiáng)的抑制腫瘤生長的作用，并且能降低用藥劑量，即降低rTCS劑量，這將有助于降低rTCS導(dǎo)致的毒性副作用。研究表明YH-16作用機(jī)制是阻斷血管生成，切斷腫瘤生長的營養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤生長。因此在本研究中rTCS與YH-16聯(lián)合處理組在細(xì)胞水平并沒有顯著的協(xié)同效應(yīng)也是合理的。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明YH-16與rTCS之間對腫瘤抑制具有協(xié)同效應(yīng)。

然而，目前的數(shù)據(jù)僅表明聯(lián)合用藥對腫瘤生長的抑制作用，尚需要更多研究進(jìn)行微血管密度的測定、免疫細(xì)胞類型的分析，從而為解釋聯(lián)合用藥的機(jī)制提供信息以及為腫瘤治療性研究提供更好的理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究以基因重組技術(shù)獲得了電泳純的天花粉蛋白，通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的增殖及小鼠體內(nèi)成瘤均有很強(qiáng)的抑制作用，而且天花粉蛋白可以協(xié)同YH-16抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Inhibition Effect of Recombinant Trichosanthin Combined with YH-16 on the Proliferation and Xenograft Tumor Growth of Melanoma

GUO Hui-can
（Department of Chemistry，Shijiazhuang Vocational Technology Institute，Shijiazhuang 050081）

The objectives of this study are to acquire trichosanthin（rTCS）and to explore the effect of rTCS combined with YH-16 on the proliferation of melanoma B16-F10 and xenograft tumor growth in mice model. rTCS was expressed in Escherichia coli BL21 strain and purified by Ni affinity chromatography. Then the effects of rTCS，YH-16，and combination of rTCS with YH-16 on the cell growth were determined by MTT assay and in vivo trial. Results were as：pure recombinant rTCS protein was obtained. The proliferation of B16-F10 was inhibited significantly by rTCS，and inhibition rate was significantly higher than by YH-16 alone，however，no significant difference between rTCS alone and the combination of rTCS and YH-16. The xenograft tumor growth in the group treated with the combination of rTCS and YH-16 was significantly smaller than the ones by rTCS-treated alone or control. In conclusion，the combination of rTCS with YH-16 presented significant inhibitory effect on proliferation of B16-F10 as well as on xenograft tumor growth，and this strategy with the combination would provide new opportunity for treating melanoma patients.

trichosanthin；YH-16；B16-F10；tumor；combination therapy

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.035

2015-06-19

郭會燦，女，碩士，副教授，研究方向：生物制藥；E-mail：heweibingkkk@126.com