王小花 曹小紅 樊振川

（天津科技大學，天津 300457）

ML00253764拯救MC4R缺陷型突變體的特性研究

王小花 曹小紅 樊振川

（天津科技大學，天津 300457）

旨在探究非肽類小分子ML00253764對致肥胖MC4R突變體拯救的特異性及經其拯救后受體的內化動力學特性，構建了黑皮質素受體及其突變體穩(wěn)定表達的細胞模型。流式細胞術結果顯示，ML00253764使MC4R缺陷型變受體N62S與P78L的膜表面表達分別提高了43%與34%，但對其他黑皮質素受體及其突變體幾乎無影響，說明ML00253764的拯救效果具有MC4R受體特異性及突變受體特異性特征。內化動力學研究結果證明經拯救的突變受體與野生型受體的內化特性相同，內化速率參數(shù)t1/2無顯著性差異。內源性配體α-MSH及AgRP對MC4R缺陷型受體膜表面表達無拯救性功效，進一步從側面證明ML00253764的作用方式與二者不同，而突變受體被拯救是細胞膜滲透性藥學伴侶分子特定作用的結果。

黑皮質素-4型受體；藥學伴侶分子；拯救

黑皮質素受體家族成員（MCRs）均屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），具有經典的七跨膜結構，但家族成員間功能差異較大。其中MC1R主要作用是調節(jié)色素的合成和沉著，與動物皮毛的顏色相關，其突變體R160W與紅發(fā)表型的發(fā)生具有較高相關性［1］。MC2R與家族性糖皮質激素缺乏癥（FGD）的發(fā)生密切相關，但其功能性發(fā)揮必須依賴于輔助蛋白MRAP的幫助［2］。MC3R與能量代謝相關，其突變體I335S便是從肥胖表型的病人體內鑒定出來的［3］。MC4R的功能是調控食物攝取，其突變體是最常見的引發(fā)單基因肥胖的形式［4］，如N62S［5］與P78L［6］。MC5R是一種與內分泌功能相關的跨膜受體，目前研究較少［7］。

研究顯示胞內留存型突變受體是引起相關GPCRs疾病的主要形式，目前利用藥學伴侶分子對缺陷型GPCRs進行功能拯救是一大研究熱點且已有許多GPCRs藥學伴侶分子被開發(fā)。值得一提的是SR49059，能夠作為后葉加壓素受體V2R特異性的藥學伴侶分子拯救其內質網(wǎng)留存型突變受體［8］，臨床應用結果也清楚的顯示其可顯著性改善腎原性尿崩癥（NDI）患者的腎功能［9］。而目前國內外對于MC4R突變受體的藥理學伴侶分子的研究仍處于起步階段。2004年Vos團隊［10］首次合成了一種非肽類可穿膜小分子ML00253764，被證明是MC4R的反向激動劑。我們之前的研究結果顯示ML00253764可以對MC4R內質網(wǎng)留存型突變受體（C84R和W174C）進行拯救［11］，但其拯救MC4R突變受體的作用特性及其與黑皮質素受體其他成員間的關系仍不清楚。本研究通過構建細胞表達模型并結合流式細胞術探究ML00253764對黑皮質素受體的膜定位拯救及拯救后受體內化動力學的變化情況，并針對其作用方式與內源性配體進行比較，以詳細的闡明藥學伴侶分子ML00253764對MC4R突變受體專一靶向性拯救的作用特性，旨為潛在的抗肥胖藥物前體分子的開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑皮質素受體的cDNA均購于上海吉凱基因化學技術有限公司。藥物分子ML00253764化學名稱為（2-［2-［2-（5-溴-2-甲氧基苯基）-乙基］-3-氟苯基］-4，5-二氫-1H-咪唑），其結構通式見圖1，由天津科技大學中法食品營養(yǎng)與藥物化學聯(lián)合實驗室合成。

圖1 ML00253764結構式

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建 pcDNA3.1-HA-MCRs以質粒pcDNA3.1（+）為表達載體，上游添加EcoR I或Hind III限制性酶切位點，下游添加Xba I或EcoR I限制性酶切位點，并在其多克隆位點插入流感病毒血凝素（HA）序列和相應的人黑皮質素受體基因的編碼區(qū)序列構建所得。突變型表達載體以pcDNA3.1-HA-MCRs為模板，通過PCR引入突變位點，產物去甲基化后轉化進入大腸桿菌擴增，測序得到正確的突變表達載體，引物見表1。

表1 引物序列

1.2.2 HEK293細胞培養(yǎng)及穩(wěn)定細胞系的建立 人源胚胎腎細胞HEK293采用10%胎牛血清，1%青鏈霉素及高糖DMEM培養(yǎng)基37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。細胞如Wang等［12］所述轉染選擇80%融合度，磷酸鈣共沉淀法進行，隨后用濃度為500 μg/mL的G418進行篩選，期間更換培養(yǎng)液，一個月左右獲得包括陰性對照pcDNA3.1在內的各種穩(wěn)定表達細胞系。

1.2.3 流式細胞術測定細胞膜表面表達 貼壁細胞加入藥物或空白緩沖液處理，PBS清洗3遍，5%BSA/PBS封閉1 h，終止非特異性反應，避光孵育FITC標記的Anti-HA抗體1 h，然后用PBS輕柔地沖洗5遍，進行流式細胞術實驗測定，操作均在低溫進行。以空載體pcDNA3.1的細胞系為陰性對照，以［MCRs-Mutant-pcDNA3.1］/［MCRs-WT-pcDNA3.1］×100%計算，實驗中設定未加藥處理的野生型受體細胞膜表達水平為100%，每個實驗做3個平行重復。

2 結果

2.1 表達載體構建結果鑒定

表達載體構建完成后利用0.8%瓊脂糖凝膠進行雙酶切電泳驗證，結果（圖2）顯示，兩條電泳條帶分別為載體pcDNA3.1（5 400 bp）及黑皮質素受體目的片段大小，送樣測序，結果分析表明載體構建正確。利用構建好的表達載體為模板進行點突變，PCR反應條件：95℃ 30 s；95℃ 30 s，55-58℃1 min，68℃ 13 min，15個循環(huán)；68℃ 10 min。PCR產物去甲基化轉化擴增后送樣測序，結果顯示突變位點正確。

圖2 表達載體構建雙酶切驗證結果

2.2 ML00253764介導的黑皮質素受體細胞膜表面表達水平的分析

ML00253764介導的MCRs及其突變體細胞膜表面表達水平的結果（圖3）顯示，在加入10-5mol/L ML00253764處理12 h后，MC4R-WT及其突變體的細胞膜表面表達水平都發(fā)生顯著性提高（P<0.05）。其中MC4R-WT提高到156%，突變受體中MC4RN62S從15%上升到58%，MC4R-P78L從8%上升到42%，而MC4R-C84R從14%上升到36%，MC4RW174C從14%上升到45%，與未加藥處理條件下相比分別提高了43%、34%、22%與31%。但其他野生型黑皮質素受體MC1R、MC3R、MC5R及突變體MC1R-R160W、MC3R-I335S在加藥與不加藥處理情況下細胞膜表面受體量均未發(fā)生明顯變化，缺陷型突變體仍只有其相應野生型水平的15%左右。說明ML00253764只能特異性的作為MC4R的藥學伴侶分子提高其突變受體的表面表達水平，并且其拯救能力具有突變受體特異性特征。

圖3 ML00253764介導的細胞膜表面表達水平的測定

2.3 ML00253764介導的MC4R及其突變體的內化動力學研究

內化作用是受體自身的調節(jié)功能，是鑒定受體能否發(fā)揮正常功能的一大指標。研究中測定了ML00253764（10-4mol/L）拯救處理24 h后MC4RWT及其突變體在激動劑α-MSH（10-6mol/L）作用0-45 min內膜表面受體隨時間的變化情況，并以不加ML00253764處理的野生型受體（w/o）為對照，進行結果分析。如圖4所示，隨著作用時間的增加，不管是野生型還是突變型受體均開始出現(xiàn)內化，其中MC4R-N62S的最大內化水平達到21%，MC4RP78L為16%，而野生型受體在未加藥條件下達到65%，加藥處理后達到59%，由此看來不同突變受體的內化水平具有一定的突變體特異性特征。而且不同突變受體達到最大內化水平一半所需的時間t1/2也略有差異，MC4R-N62S（5.69 min）>MC4R-P78L（5.33 min）>MC4R-WT（3.47 min）>MC4R-WT（w/o）（3.27 min），但該差異并無顯著性，說明經拯救到達細胞膜表面的缺陷型受體與野生型受體的內化作用基本相同。

圖4 ML00253764介導的MC4R及其突變體內化動力學分析

2.4 內源性配體介導的MC4R及其突變體細胞膜表面表達水平的分析

為證明MC4R胞內留存型突變體的細胞膜表面表達水平提高確實是小分子化合物ML00253764特定作用方式的結果，用MC4R天然的內源性激動劑α-MSH或逆激動劑AgRP 10-6mol/L作用45 min，測定其細胞膜受體量。結果（圖5）顯示，野生型MC4R-WT在內源性配體作用下的膜受體量均發(fā)生了降低，其中α-MSH處理后降低到62%，而AgRP作用下降低到70%左右。但是對另外兩個胞內運送缺陷的突變受體來說，配體處理對受體的細胞膜表達水平無太大的影響，說明MC4R內源性配體包括反向激動劑多肽和正向激動劑都不能模仿ML00253764的作用方式，即MC4R突變體細胞膜表面表達量的提高是ML00253764單獨發(fā)揮小分子藥學伴侶分子特定作用的結果。

圖5 α-MSH（A）與AgRP（B）介導的MC4R突變體細胞膜表面表達水平的分析

3 討論

GPCRs蛋白是經典的膜蛋白，一旦基因發(fā)生突變將可能導致受體在胞內的成熟受到阻遏，最常見的一種情況便是被細胞的質量控制系統(tǒng)識別并滯留于內質網(wǎng)內，導致細胞膜表面表達的降低，引發(fā)疾?。?3］。MC4R突變體N62S與P78L便是從肥胖病人體內鑒定出來的單基因突變體，數(shù)據(jù)顯示其細胞膜表面表達發(fā)生了嚴重的缺陷，只能達到野生型10%左右的水平。ML00253764是一種小分子化合物，我們之前的研究［10］已證實可以拯救另外兩個MC4R缺陷型突變體C84R和W174C，本研究結果顯示N62S與P78L的細胞膜表達水平也同樣可以不同程度的被拯救，且這一拯救結果具有突變體特異性與受體特異性特征。因為ML00253764不能夠作為藥學伴侶分子影響其他黑皮質素受體及其缺陷型突變體的細胞膜表面表達水平。研究顯示，MC4R的胞內轉運嚴格的依賴于體內伴侶分子的出現(xiàn)與否［14］，由此推測，ML00253764能夠特異性的針對MC4R發(fā)揮藥學伴侶分子的作用促進其受體蛋白到達細胞膜的轉運過程。其機理很可能是ML00253764與突變受體在胞內形成了一種穩(wěn)定的分子復合物構象［13-15］，并繞過了細胞內質量體系的控制從而使錯誤折疊的受體蛋白擺脫了進入降解途徑的命運［14，16］。

此外，細胞膜滲透性及其相對較小的分子量特征很可能是ML00253764（MW377.251）發(fā)揮藥理學伴侶活性一個非常重要的因素，因為內源性配體α-MSH（MW1664.87）和AgRP（MW5347.20）均不具有穿透細胞膜的能力，所以對MC4R突變受體的細胞膜表面表達水平無顯著性影響，而且對于野生型受體來說還會降低其細胞膜受體量，很可能是因為激動劑或拮抗劑的作用促進了MC4R細胞膜表面受體的脫敏和/或內化進程，導致膜受體減少，與之前的研究結論一致［17，18］，而經藥學伴侶分子ML00253764拯救后的MC4R突變體均具有與野生型受體類似的內化動力學速率。

4 結論

ML00253764能夠以藥學伴侶分子的作用方式特異性的拯救MC4R胞內缺陷型突變受體，并且不會影響受體的內化速率，是一種潛在的治療早發(fā)性肥胖病癥的藥學前體分子。此外細胞膜滲透性特征是藥學伴侶分子發(fā)揮作用的前提條件，在未來進行GPCRs藥物設計及篩選過程中應首先納入考慮范圍。

［1］Duffy DL, Box NF, Chen W, et al. Interactive effects of MC1R and OCA2 on melanoma risk phenotypes［J］. Hum Mol Genet, 2004, 13（4）：447-461.

［2］Metherell LA, Chapple JP, Cooray S, et al. Mutations in MRAP, encoding a new interacting partner of the ACTH receptor, cause familial glucocorticoid deficiency type 2［J］. Nat Genet, 2005, 37（2）：166-170.

［3］Tao YX. Functional characterization of novel melanocortin-3 receptor mutations identified from obese subjects［J］. Biochim Biophys Acta, 2007, 1772（10）：1167-1174.

［4］Tao YX. The melanocortin-4 receptor：physiology pharmacology and pathophysiology［J］. Endocrine Reviews, 2010, 31（4）：506-543.

［5］Farooqi IS, Yeo GS, Keogh JM, et al. Dominant and recessive inheritance of morbid obesity associated with melanocortin 4 receptor deficiency［J］. J Clin Invest, 2000, 106（2）：271-279.

［6］Hinney A, Schmidt A, Nottebom K, et al. Several mutations in the melanocortin-4 receptor gene including a nonsense and a frameshift mutation associated with dominantly inherited obesity in humans［J］. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1999, 84（4）：1483-1486.

［7］Chen W, Kelly MA, Opitz Araya X, et al. Exocrine gland dysfunction in MC5R-deficient mice：evidence for coordinated regulation of exocrine gland function by melanocortin peptides［J］. Cell, 1997, 91（6）：789-798.

［8］Bernier V, Lagace M, Lonergan M, et al. Functional rescue of the constitutively internalized V2 vasopressin receptor mutant R137H by the pharmacological chaperone action of SR49059［J］. Molecular Endocrinology, 2004, 18（8）：2074-2084.

［9］Bernier V, Morello JP, Zarruk A, et al. Pharmacologic chaperones as a potential treatment for X-linked nephrogenic diabetes insipidus［J］. Journal of the American Society of Nephrology, 2006, 17（1）：232-243.

［10］Vos TJ, Caracoti A, Che JL, et al. Identification of 2-［2-［2-（5-bromo-2-methoxyphenyl）-ethyl］-4, 5-dihydro-1H-imidazole（ML00257364）, a small molecule melanocortin 4 receptor antagonist that effectively reduces tumor-induced weight loss in a mouse model［J］. J Med Chem, 2004, 47（7）：1602-1604.

［11］Fan ZC, Tao YX. Functional characterization and pharmacological rescue of melanocortin-4 receptor mutations identified from obese patients［J］. J Cell Mol Med, 2009, 13（9B）：3268-3282.

［12］Wang XH, Wang HM, Zhao BL, et al. Rescue of defective MC4R cell-surface expression and signaling by a novel pharmacoperone Ipsen 17［J］. J Mol Endocrinol, 2014, 53（1）：1-13.

［13］Conn PM, Ulloa Aguirre A, Janovick JA. G protein-coupled receptor trafficking in health and disease：lessons learned to prepare for therapeutic mutant rescue in vivo［J］. Pharmacol Rev, 2007, 59（3）：225-250.

［14］Meimaridou E, Gooljar SB, Ramnarace N, et al. The Cytosolic chaperone Hsc70 promotes traffic to the cell surface of intracellular retained melanocortin-4 receptor mutants［J］. Molecular Endocrinology, 2011, 25（9）：1650-1660.

［15］Conn PM, Ulloa-Aguirre A. Trafficking of G-protein-coupled receptors to the plasma membrane：insights for pharmacoperone drugs［J］. Trends Endocrinol Met, 2010, 21（3）：190-197.

［16］Granell S, Serra-Juhé C, Martos-Moreno Gá, et al. A novel melanocortin-4 receptor mutation MC4R-P272L associated with severe obesity has increased propensity to be ubiquitinated in the ER in the face of correct folding［J］. PLoS One, 2012, 7（12）：e50894.

［17］Castro-Fernandez C, Maya-Nunez G, Conn PM. Beyond the signal sequence：protein routing in health and disease［J］. Endocr Rev, 2005, 26（4）：479-503.

［18］Breit A, Wolff K, Kalwa H, et al. The natural inverse agonist agouti-related protein induces arrestin-mediated endocytosis of melanocortin-3 and -4 receptors［J］. J Biol Chem, 2006, 281（49）：37447-37456.

（責任編輯 馬鑫）

Characteristics of ML00253764 Rescuing the MC4R Deficient Mutants

WANG Xiao-hua CAO Xiao-hong FAN Zhen-chuan
（Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

To determine the specificity and internalization kinetics of non-peptide small molecule ML00253764 rescuing the obesitycausing MC4R mutants，the cell model for the stable expression of melanocortin receptors and their mutants were established. The results by flow cytometry（FACS）showed that ML00253764 resulted in the increase of the membrane surface expression of MC4R deficient mutation receptor N62S and P78L by 43% and 34%，respectively，while almost no effects to other melanocortin receptor and their mutants，demonstrating this rescue mediated by ML00253764 was MC4R receptor- and mutant- specific. Further study showed that the internalization of rescued receptors was similar to the wild type（WT）receptor，and there was no significant difference in rate of internalization t1/2. Both endogenous ligands α-MSH and AgRP had no rescue effect on the membrane surface expression of MC4R deficient mutation receptor，proving that action way of ML00253764 was different from that of above two，and what mutant receptors were rescued resulted from the specificity of pharmacological chaperone with cell membrane permeability.

melanocortin-4 receptor；pharmacological chaperone；rescue

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.034

2015-06-29

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（天津自然科學基金一般項目）（13JCYBJC41900）

王小花，女，博士研究生，研究方向：生物技術；E-mail：452457231@163.com

樊振川，男，博士，研究方向：食品分子微生物學和營養(yǎng)代謝；E-mail：fanzhen@tust.edu.cn