基因槍轉(zhuǎn)化法對(duì)抗旱基因?qū)胗衩椎难芯?/h1>
2016-06-23 13:49:50李志亮吳忠義楊清張希太葉嘉邢浩春陳建中黃叢林
生物技術(shù)通報(bào) 2016年5期
李志亮吳忠義楊清張希太葉嘉邢浩春陳建中黃叢林
（1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，邯鄲 056005；2.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095；4.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，邯鄲 056001；5.河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，邯鄲 056005）
基因槍轉(zhuǎn)化法對(duì)抗旱基因?qū)胗衩椎难芯?/p>
李志亮1，2，5吳忠義2楊清3張希太4葉嘉1，5邢浩春1，5陳建中1，5黃叢林2
（1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，邯鄲 056005；2.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095；4.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，邯鄲 056001；5.河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，邯鄲 056005）
全球水資源短缺，干旱已是玉米生產(chǎn)發(fā)展的主要限制因素。通過(guò)培育抗旱能力提高的轉(zhuǎn)P5CS基因玉米株系，為玉米抗旱遺傳育種提供新材料。利用基因工程策略構(gòu)建植物表達(dá)載體pBPC-P5CS-F129A，用基因槍法對(duì)玉米自交系京501幼胚愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在選擇培養(yǎng)基中加入10 mg/L 的草丁膦進(jìn)行篩選，對(duì)草丁膦抗性再生植株進(jìn)行了PCR 檢測(cè)和 Northern blot鑒定，對(duì)轉(zhuǎn)P5CS基因玉米植株進(jìn)行了抗旱性分析。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力得到提高。干旱脅迫下，轉(zhuǎn)P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比對(duì)照高，而丙二醛含量比對(duì)照低。
玉米；愈傷組織；基因槍法；草丁膦；遺傳轉(zhuǎn)化；抗旱性
水分缺乏是世界范圍內(nèi)限制作物產(chǎn)量的一個(gè)主要因素，提高農(nóng)作物產(chǎn)量需要培育耐旱種質(zhì)［1］。為了減輕干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失，人們一方面采用改良土壤、合理灌溉等農(nóng)業(yè)措施；另一方面通過(guò)培育作物抗旱品種來(lái)提高作物的抗旱能力。植物體內(nèi)存在許多與干旱相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，植物通過(guò)激活許多信號(hào)通路響應(yīng)干旱脅迫，使植物抵御或適應(yīng)脅迫［2］。
干旱脅迫誘導(dǎo)所表達(dá)的基因主要包括起單一功能作用的基因和調(diào)控基因。第一類單一功能作用的基因主要是指編碼產(chǎn)物可在逆境下直接起保護(hù)作用的相關(guān)基因。（1）抗氧化基因。編碼產(chǎn)物如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶。（2）合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的基因。該類基因的過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞滲透保護(hù)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、果聚糖的合成能力，使其在細(xì)胞中積累，以維持細(xì)胞較高的滲透壓，從而增強(qiáng)植株的抗旱性。（3）其他脅迫相關(guān)基因，其編碼產(chǎn)物參與保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)。第二類是具有調(diào)控功能的基因，主要是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因，其編碼產(chǎn)物可在逆境脅迫下起調(diào)節(jié)作用。如轉(zhuǎn)錄因子和參與植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因［3］。
目前，用于玉米的抗旱基因工程育種也主要是這兩類基因。在抗旱功能基因轉(zhuǎn)化玉米方面，主要有甜菜堿合成酶基因betA［4］，蛋白激酶基因NPK1［5］，玉米磷脂酶C基因（ZmPLC1）［6］，小鹽芥（Thellungiella halophila）液泡H+焦磷酸酶（vacuolar H+-pyrophosphatase，TsVP）［7］，AtGPX3基因［8］，隣脂酰肌醇合成酶ZmPIS基因［9］，枯草桿菌cspB基因［3］，編碼膽堿脫氫酶的BADH 基因［10］。
高等植物中，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是由谷氨酸生物合成脯氨酸的限速酶。在干旱脅迫下許多植物體會(huì)積累大量的脯氨酸，脯氨酸在細(xì)胞內(nèi)可作為滲透調(diào)節(jié)劑降低細(xì)胞質(zhì)的水勢(shì)，維持胞質(zhì)的水分狀況，使植物適應(yīng)干旱脅迫［11，12］。脯氨酸累積與植物對(duì)干旱和鹽脅迫的適應(yīng)性呈正相關(guān)性關(guān)系［7］。脯氨酸的生物合成途徑首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)［13］。在植物體內(nèi)，脯氨酸的合成是通過(guò)谷氨酸途徑和鳥(niǎo)氨酸途徑進(jìn)行的，其中谷氨酸途徑在滲透脅迫條件下占主要地位［14］。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）由P5CS基因編碼。在高等植物中，第一個(gè)P5CS基因是從豇豆（Vigna aconitifolia）中克隆的［15］。基因表達(dá)分析表明，P5CS 基因能夠在豇豆葉片中高水平表達(dá)，且在根中的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，暗示其在脯氨酸生物合成中發(fā)揮重要作用，在植物中表達(dá)可引起滲透調(diào)節(jié)［15］。研究證明，轉(zhuǎn)P5CS基因的高羊茅［16］和白三葉［17］的抗旱性有一定程度的增強(qiáng)。
1987年，Klein等［18］利用基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥（Allium cepa）表皮細(xì)胞獲得成功，使這一技術(shù)在單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化中得到應(yīng)用。而利用基因槍法對(duì)玉米開(kāi)展基于P5CS基因的遺傳轉(zhuǎn)化還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用基因槍法將豇豆P5CS基因的突變型P5CS-F129A基因?qū)胗衩鬃越幌稻?01中，經(jīng)草丁膦篩選獲得轉(zhuǎn)化體，對(duì)草丁膦抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和Northern blot鑒定，同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行脯氨酸和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。
1 材料與方法
1.1 材料
供試的玉米（Zea mays L.）為自交系京501，由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米中心提供。
1.2 方法
1.2.1 植物表達(dá)載體 質(zhì)粒pBPC-P5CS-F129A由北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心提供，該基因上游為Ubi（玉米泛醌素）啟動(dòng)子，下游為 nos終止子，選擇標(biāo)記基因是bar基因（圖1）。
圖1 pBPC-P5CS-F129A質(zhì)粒圖譜
1.2.2 玉米幼胚的接種 取授粉后 10-13 d、幼胚大小為 1-2 mm的玉米果穗，去苞葉后在70%的酒精中浸泡5-10 min，取出后用解剖刀削去種皮及部分胚乳，挑出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
1.2.3 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基：N6大量、B5微量、N6有機(jī)、Fe鹽、脯氨酸690 mg/L、水解酪蛋白200 mg/L、肌醇100 mg/L、蔗糖30 mg/L、植物凝膠2.6mg/L或瓊脂粉6 mg/L；愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加 2，4-D 2 mg/L和10 mg/L AgNO3；選擇培養(yǎng)基：愈傷組織誘導(dǎo)或繼代培養(yǎng)基附加不同濃度草丁膦和10 mg/L AgNO3；胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加1.5 mg/L KT；分化培養(yǎng)基：同基本培養(yǎng)基；生根壯苗培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加0.5 mg/L NAA。
1.2.4 基因槍轟擊方法與參數(shù) 參見(jiàn)文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行。
1.2.5 胚性愈傷組織的篩選
1.2.5.1 胚性愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 將用基因槍轟擊后的胚性愈傷組織，在原培養(yǎng)皿中、暗處恢復(fù)培養(yǎng)3-5 d以便修復(fù)由微彈復(fù)合體對(duì)受體細(xì)胞造成的損傷。
1.2.5.2 胚性愈傷組織的繼代篩選 將恢復(fù)培養(yǎng)后的胚性愈傷組織接種在附加草丁膦6 mg/L篩選繼代培養(yǎng)基篩選15 d。然后，將存活的抗性愈傷轉(zhuǎn)接到草丁膦10 mg/L的篩選繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行第2次篩選15 d。
1.2.6 植株的再生及移栽 抗性愈傷組織在附加1.5 mg/L KT的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基進(jìn)行綠苗分化。分化的綠苗長(zhǎng)出主莖后，將其移至生根壯苗培養(yǎng)基上生根壯苗。待幼苗長(zhǎng)出 2片新葉、3-4條主根后，移至裝有營(yíng)養(yǎng)土（2/3蛭石+1/3腐殖質(zhì)）的小花盆中。當(dāng)幼苗在小花盆中長(zhǎng)出 1-2片新葉，帶土移栽到大田。
1.2.7 再生植株的分子檢測(cè)
1.2.7.1 選取草丁膦抗性的植株，用CTAB法提取葉片總DNA，利用PCR對(duì)P5CS基因進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)P5CS基因的序列設(shè)計(jì)引物為：上游引物：22 bp 5'-CTCTCTACGATACGCTGTTCAC-3'；下游引物：20 bp 5'-CTTCTTTGCCACCTTTCAAG-3'；陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出1 008 bp的片段。PCR采用由東盛公司生產(chǎn)的擴(kuò)增儀。
1.2.7.2 PCR陽(yáng)性植株的Northern blot 鑒定 取經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的植株進(jìn)行Northern blot 分析，以未轉(zhuǎn)基因的野生型植株的RNA為陰性對(duì)照。探針標(biāo)記和雜交檢測(cè)按照Roche公司的地高辛試劑盒的方法進(jìn)行，雜交溫度為41℃。具體參見(jiàn)文獻(xiàn)［19］的方法進(jìn)行。
1.2.8 脯氨酸含量測(cè)定 對(duì)部分轉(zhuǎn)基因玉米植株和對(duì)照植株進(jìn)行干旱處理，測(cè)定幼苗葉片脯氨酸含量。葉片脯氨酸含量的測(cè)定按Bates和張殿忠等［20，21］的方法進(jìn)行。數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
1.2.9 葉片丙二醛（MDA）含量測(cè)定 丙二醛（MDA）含量通過(guò)與硫代巴比妥酸的顏色反應(yīng)來(lái)測(cè)定［22，23］。
2 結(jié)果
2.1 胚性愈傷組織的篩選和植株再生
用不同濃度的草丁膦對(duì)幼胚愈傷組織進(jìn)行兩次篩選。第1次是在附加草丁膦6 mg/L篩選繼代培養(yǎng)基篩選15 d，愈傷組織的成活率在30%左右。然后，將存活的抗性愈傷轉(zhuǎn)接到草丁膦10 mg/L的篩選繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行第2次篩選15 d。在愈傷組織篩選過(guò)程中，非抗性愈傷組織塊會(huì)逐漸褐化變黑而死亡，25-35 d后，大部分（90%-95%）愈傷組織被殺死，只有少部分（5%-10%）愈傷組織能夠存活下來(lái)（抗性愈傷組織）并逐漸長(zhǎng)出綠色的小芽點(diǎn)，再經(jīng)過(guò)10-20 d后，發(fā)育成具有莖和葉的小植株，最后在生根培養(yǎng)基上發(fā)育成完整的植株（圖2）。
圖2 玉米植株再生體系的建立
2.2 轉(zhuǎn)基因玉米植株的分子檢測(cè)
用設(shè)計(jì)好的引物對(duì)草丁膦抗性植株進(jìn)行P5CS基因的PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因植株的P5CS基因擴(kuò)增帶位置與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增帶位置相同，而陰性對(duì)照及其他植株無(wú)擴(kuò)增帶（圖3-A）。經(jīng)檢測(cè)，共得到11株P(guān)CR陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率70%。
為了檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中是否表達(dá)，從野生型和3個(gè)轉(zhuǎn)基因植株葉片中提取總RNA，進(jìn)行Northern blot分析。每個(gè)泳道RNA上樣量為15 μg，探針為地高辛標(biāo)記的P5CS cDNA特異探針，溴化乙錠染色的rRNA作內(nèi)參，Northern雜交檢測(cè)結(jié)果如圖3-B所示。在未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株中未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，而在各轉(zhuǎn)基因植株株系中目的基因均有不同程度的表達(dá)。根據(jù)目的基因表達(dá)強(qiáng)度，選擇株系L2、L9進(jìn)行抗旱性實(shí)驗(yàn)。
2.3 轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量增加
為了解在干旱脅迫處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸積累的變化，測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株葉片脯氨酸的含量。在干旱脅迫處理之前，葉片脯氨酸含量在轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株之間沒(méi)有顯著差異，含量都較低。干旱脅迫引起轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸含量有不同程度的上升。在干旱脅迫處理過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸的含量都顯著高于其對(duì)照植株。如在正常條件下，WT、L2和L9植株的脯氨酸含量分別為23.4、24.1和26.5 μg/g·FW，沒(méi)有顯著差異。干旱脅迫處理3 d后，L2和L9植株脯氨酸含量分別上升為63.7和66.1 μg/g·FW，顯著高于WT植株的51.3 μg/g·FW，轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸含量比對(duì)照株高24.2%-28.8%（圖4，表1）。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞可以積累更多的脯氨酸，使細(xì)胞能夠維持較低的溶質(zhì)勢(shì)，從而能夠更好地保持水分，減少或免受干旱脅迫的傷害。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱脅迫具有較強(qiáng)的耐性。
圖4 干旱脅迫引起的玉米幼苗脯氨酸含量的變化
表1 不同株系在不同處理時(shí)間條件下脯氨酸的含量（μg/g·FW）變化
2.4 轉(zhuǎn)基因植株具有較低的丙二醛含量
干旱脅迫條件下，玉米葉片失水萎蔫，葉片細(xì)胞內(nèi)活性氧含量上升，使細(xì)胞膜脂成分發(fā)生氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物為丙二醛（MDA），MDA能與蛋白質(zhì)等交聯(lián)導(dǎo)致酶失活或膜系統(tǒng)受損，因此，植物體內(nèi)MDA含量的高低可在一定程度上反映玉米植株在干旱脅迫條件下膜脂過(guò)氧化的程度的大小。結(jié)果表明：在干旱脅迫處理前，各株系的丙二醛含量差別較小，且隨著干旱脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（圖5，表2）。相同處理時(shí)間下轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照株系相比測(cè)定值要低。如在干旱脅迫處理第3天時(shí)，L2和L9的MDA含量分別為18.8 nmol/g FW，14.0 nmol/g FW，而WT的測(cè)定值達(dá)到了21.5 nmol/g FW。這些結(jié)果表明，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)P5CS基因植株的細(xì)胞膜損傷較輕，有利于植株的生長(zhǎng)，使轉(zhuǎn)基因植株抗旱性得到提高。
圖5 干旱脅迫引起的玉米幼苗丙二醛含量的變化
表2 不同株系在不同處理時(shí)間條件下丙二醛的含量（nmol/g·FW）變化
3 討論
環(huán)境中，植物常常遭受干旱脅迫。植物通過(guò)激活一系列信號(hào)途徑來(lái)響應(yīng)脅迫，使植物能抵御或適應(yīng)干旱脅迫。干旱可以產(chǎn)生細(xì)胞傷害和次生脅迫，如滲透和氧化脅迫。通過(guò)信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)下游信號(hào)程序和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，激活脅迫響應(yīng)機(jī)制（如脯氨酸參與的滲透保護(hù)）以重建平衡，保護(hù)和修復(fù)受傷害蛋白和各種膜，從而賦予植物脅迫耐性［24］。
干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，通過(guò)滲透脅迫影響植物細(xì)胞膨壓從而導(dǎo)致植物的不良生長(zhǎng)。在滲透脅迫下，植物將產(chǎn)生一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵抗該脅迫，包括脯氨酸和甜菜堿。脯氨酸主要來(lái)源于谷氨酸合成途徑［25］。研究表明，由P5CS基因編碼的Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是滲透脅迫時(shí)植物體內(nèi)合成脯氨酸的關(guān)鍵酶，單獨(dú)轉(zhuǎn)化P5CS基因的植株可以提高脯氨酸的含量，起到抗旱的作用［26］。
自從1992年第一個(gè)高等植物的P5CS基因從豇豆中克隆以來(lái)，在許多植物中克隆出該基因。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅從2010年以來(lái)就從20多種植物中成功克隆了P5CS基因［27-53］。同時(shí)，利用豇豆P5CS基因轉(zhuǎn)化高羊茅［16］、冰草［54］、白三葉［17］，多年生黑麥草P5CS基因轉(zhuǎn)化擬南芥［55］，普通菜豆PvP5CS1基因轉(zhuǎn)化擬南芥［56］、PvP5CS2基因轉(zhuǎn)化煙草［56］，朝鮮堿茅P5CS基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿［57］，新牧一號(hào)苜蓿MvP5CS基因轉(zhuǎn)化棉花［58］，擬南芥P5CS1基因轉(zhuǎn)化羽衣甘藍(lán)［47］和馬鈴薯［59］均獲得成功。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)化P5CS基因可顯著提高多種植物的脯氨酸水平［60-63］。轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照植株最低也高達(dá)20.0%［17］，有的高達(dá)12倍［61］，耐旱性也有不同程度的提高。研究還發(fā)現(xiàn)，脯氨酸在調(diào)控植物體內(nèi)蛋白合成和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換中起重要作用，脯氨酸可以保護(hù)遭受滲透?jìng)Φ陌l(fā)育中的細(xì)胞［49］。脯氨酸合成不足會(huì)導(dǎo)致周期蛋白基因和其他細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，暗示脯氨酸可以作為植物發(fā)育中的信號(hào)分子參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［64］。
為進(jìn)一步探討植物抗旱的生理機(jī)制，Singh等［65］比較了兩種棉花的干旱耐性相關(guān)基因的差異表達(dá)譜和生理表現(xiàn)。結(jié)果顯示，在干旱條件下，生理指標(biāo)諸如凈光合速率、蒸騰、氣孔導(dǎo)度、葉綠素?zé)晒?、相?duì)含水量（RWC）和水勢(shì)都會(huì)發(fā)生變化，而脯氨酸、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）含量會(huì)隨著其相關(guān)基因表達(dá)改變而增加。中度脅迫下，耐旱品種保持較低的水勢(shì)可能是由于與敏感品種相比具有的較高脯氨酸含量?；虮磉_(dá)分析顯示，耐旱品種通過(guò)上調(diào)天冬酰胺合成酶調(diào)節(jié)（AS）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和甲基乙二醛（glyI）基因表達(dá)增強(qiáng)解毒機(jī)制，同時(shí)，耐旱品種通過(guò)上調(diào)Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因增強(qiáng)脯氨酸，一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累［65］。研究也發(fā)現(xiàn)，玉米在長(zhǎng)期遭受非生物逆境脅迫尤其是干旱脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)離子平衡遭到破壞，從而影響一系列代謝通路，導(dǎo)致多種生理活動(dòng)出現(xiàn)紊亂，最終對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用［3］。
為了提高玉米對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力，將來(lái)自豇豆的P5CS基因轉(zhuǎn)化玉米。首先通過(guò)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，建立了基于玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化體系；其次采用基因槍轉(zhuǎn)化法將P5CS基因轉(zhuǎn)化到玉米基因組中，并通過(guò)PCR和Northern blot檢測(cè)，驗(yàn)證了目的基因已轉(zhuǎn)入到玉米基因組中并得到表達(dá)。
另外，通過(guò)探討轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫條件下的生理生化變化對(duì)其抗旱性進(jìn)行了初步研究。測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的脯氨酸含量。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因玉米植株中脯氨酸含量的增加明顯高于對(duì)照植株，如干旱脅迫處理3 d后，轉(zhuǎn)基因株系L9植株脯氨酸含量為66.1 μg/g·FW，顯著高于WT植株的51.3 μg/g·FW（圖4，表1），說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞能夠維持較低的溶質(zhì)勢(shì)，抵御干旱脅迫能力較強(qiáng)。
水分脅迫會(huì)造成植物細(xì)胞原生質(zhì)膜的損傷，破壞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性降低，透性增大，干旱脅迫也會(huì)使細(xì)胞膜脂成分發(fā)生氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物主要是丙二醛（MDA）。MDA（丙二醛）含量越高，反映植物抗旱性越弱，反之，則植物抗旱性強(qiáng)。質(zhì)膜傷害度增值與抗旱性為顯著負(fù)相關(guān)［66］。轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的MDA含量測(cè)定結(jié)果顯示，相同處理時(shí)間下轉(zhuǎn)基因株系的MDA比對(duì)照株系的要低。在干旱脅迫處理第3天時(shí)，L9的MDA含量分別為14.0 nmol/g·FW，而WT的測(cè)定值達(dá)到了21.5 nmol/g·FW。表明干旱脅迫下，與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的膜脂過(guò)氧化程度較輕，細(xì)胞膜穩(wěn)定性較高，抗旱性較強(qiáng)（圖5，表2）。在干旱脅迫下轉(zhuǎn)P5CS基因植株可以通過(guò)降低細(xì)胞膜損傷提高干旱耐性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)P5CS基因玉米的抗旱性得到了一定提高。后續(xù)將對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行田間抗旱性分析，篩選抗旱性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因玉米新材料，為玉米抗旱育種提供中間材料。
近年來(lái)，P5CS基因?qū)μ岣咧参锟购的芰υ诳鼓婊蚬こ躺系膽?yīng)用不斷得到研究探討與證實(shí)，這些研究應(yīng)用將為抗旱植物的培育及真正運(yùn)用于大田生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前，我國(guó)玉米產(chǎn)量和品質(zhì)雖有一定提高但仍繼續(xù)進(jìn)行改良，考慮到目前轉(zhuǎn)基因玉米的應(yīng)用主要集中在抗蟲(chóng)、抗除草劑方面，而對(duì)于中國(guó)北方大面積的缺水現(xiàn)狀而言，利用不同遺傳背景的P5CS基因轉(zhuǎn)化玉米，增加玉米的抗旱性，獲得具有優(yōu)良性狀并能穩(wěn)定遺傳的耐旱玉米新品種將具有重要的經(jīng)濟(jì)和實(shí)踐意義，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。
4 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)的研究表明，豇豆P5CS基因已整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因玉米基因組中并能夠在植株中表達(dá)。干旱脅迫下，轉(zhuǎn)P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比對(duì)照高，而丙二醛含量比對(duì)照要低，轉(zhuǎn)基因玉米植株的抗旱性得到提高。
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（責(zé)任編輯 狄艷紅）
The Transformation of Drought-resistant Gene into Maize by Microprojectile Bombardment
LI Zhi-liang1，2，5WU Zhong-yi2YANG Qing3ZHANG Xi-tai4YE Jia1，5XING Hao-chun1，5CHEN Jian-zhong1，5HUANG Cong-lin2
（1. College of Life Sciences and Engineering，Handan University，Handan 056005；2. Beijing Research Center of Agro-Biotechnology，Beijing 100097；3. College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；4. Handan Academy of Agricultural Sciences in Hebei Province，Handan 056001；5. Application Technology Research and Development Center of Wild Resource Plants in Taihang Mountain Area of Southern Hebei for Hebei Institutions of Higher Education，Handan 056005）
A drought-resistance function gene，VaP5CS，was cloned from mothbean（Vigna aconitifolia）. Plant expression vector pBPC-P5CS-F129A was constructed using gene engineering strategy，then the genetic transformation of young embryo callus in maize inbred line Jing 501 was performed by microprojectile bombardment. Further，the transformed explants were directly selected on the medium containing 10 mg/L glufosinate，and the glufosinate-resistant plantlets were confirmed by PCR amplification and Northern blot identification. Finally，the different drought resistance indexes of P5CS-transgenic maize plants were analyzed. The results showed that the transgenic plants presented the improved drought resistance comparing to control plants. Under drought stress，the proline content in the P5CS-transgenic maize plant was higher than that in the control，while the MDA content was lower than that in the control.
Zea mays；callus；microprojectile bombardment；glufosinate；genetic transformation；drought resistance
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.008
2015-08-05
國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2009ZX08003-009B），邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（1322101065），邯鄲學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13208）
李志亮，男，博士，副教授，研究方向：植物生理、植物細(xì)胞工程和分子生物學(xué)；E-mail：zhiliangli09@126.com
黃叢林，男，博士，研究員，研究方向：植物抗旱、抗寒、耐鹽分子生物學(xué)及基因工程改良；E-mail：huangconglin@hotmail.com
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李志亮吳忠義楊清張希太葉嘉邢浩春陳建中黃叢林
（1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，邯鄲 056005；2.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095；4.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，邯鄲 056001；5.河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，邯鄲 056005）
基因槍轉(zhuǎn)化法對(duì)抗旱基因?qū)胗衩椎难芯?/p>
李志亮1，2，5吳忠義2楊清3張希太4葉嘉1，5邢浩春1，5陳建中1，5黃叢林2
（1.邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，邯鄲 056005；2.北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095；4.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，邯鄲 056001；5.河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，邯鄲 056005）
全球水資源短缺，干旱已是玉米生產(chǎn)發(fā)展的主要限制因素。通過(guò)培育抗旱能力提高的轉(zhuǎn)P5CS基因玉米株系，為玉米抗旱遺傳育種提供新材料。利用基因工程策略構(gòu)建植物表達(dá)載體pBPC-P5CS-F129A，用基因槍法對(duì)玉米自交系京501幼胚愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在選擇培養(yǎng)基中加入10 mg/L 的草丁膦進(jìn)行篩選，對(duì)草丁膦抗性再生植株進(jìn)行了PCR 檢測(cè)和 Northern blot鑒定，對(duì)轉(zhuǎn)P5CS基因玉米植株進(jìn)行了抗旱性分析。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力得到提高。干旱脅迫下，轉(zhuǎn)P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比對(duì)照高，而丙二醛含量比對(duì)照低。
玉米；愈傷組織；基因槍法；草丁膦；遺傳轉(zhuǎn)化；抗旱性
水分缺乏是世界范圍內(nèi)限制作物產(chǎn)量的一個(gè)主要因素，提高農(nóng)作物產(chǎn)量需要培育耐旱種質(zhì)［1］。為了減輕干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失，人們一方面采用改良土壤、合理灌溉等農(nóng)業(yè)措施；另一方面通過(guò)培育作物抗旱品種來(lái)提高作物的抗旱能力。植物體內(nèi)存在許多與干旱相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，植物通過(guò)激活許多信號(hào)通路響應(yīng)干旱脅迫，使植物抵御或適應(yīng)脅迫［2］。
干旱脅迫誘導(dǎo)所表達(dá)的基因主要包括起單一功能作用的基因和調(diào)控基因。第一類單一功能作用的基因主要是指編碼產(chǎn)物可在逆境下直接起保護(hù)作用的相關(guān)基因。（1）抗氧化基因。編碼產(chǎn)物如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶。（2）合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的基因。該類基因的過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞滲透保護(hù)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、果聚糖的合成能力，使其在細(xì)胞中積累，以維持細(xì)胞較高的滲透壓，從而增強(qiáng)植株的抗旱性。（3）其他脅迫相關(guān)基因，其編碼產(chǎn)物參與保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)。第二類是具有調(diào)控功能的基因，主要是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因，其編碼產(chǎn)物可在逆境脅迫下起調(diào)節(jié)作用。如轉(zhuǎn)錄因子和參與植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因［3］。
目前，用于玉米的抗旱基因工程育種也主要是這兩類基因。在抗旱功能基因轉(zhuǎn)化玉米方面，主要有甜菜堿合成酶基因betA［4］，蛋白激酶基因NPK1［5］，玉米磷脂酶C基因（ZmPLC1）［6］，小鹽芥（Thellungiella halophila）液泡H+焦磷酸酶（vacuolar H+-pyrophosphatase，TsVP）［7］，AtGPX3基因［8］，隣脂酰肌醇合成酶ZmPIS基因［9］，枯草桿菌cspB基因［3］，編碼膽堿脫氫酶的BADH 基因［10］。
高等植物中，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是由谷氨酸生物合成脯氨酸的限速酶。在干旱脅迫下許多植物體會(huì)積累大量的脯氨酸，脯氨酸在細(xì)胞內(nèi)可作為滲透調(diào)節(jié)劑降低細(xì)胞質(zhì)的水勢(shì)，維持胞質(zhì)的水分狀況，使植物適應(yīng)干旱脅迫［11，12］。脯氨酸累積與植物對(duì)干旱和鹽脅迫的適應(yīng)性呈正相關(guān)性關(guān)系［7］。脯氨酸的生物合成途徑首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)［13］。在植物體內(nèi)，脯氨酸的合成是通過(guò)谷氨酸途徑和鳥(niǎo)氨酸途徑進(jìn)行的，其中谷氨酸途徑在滲透脅迫條件下占主要地位［14］。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）由P5CS基因編碼。在高等植物中，第一個(gè)P5CS基因是從豇豆（Vigna aconitifolia）中克隆的［15］。基因表達(dá)分析表明，P5CS 基因能夠在豇豆葉片中高水平表達(dá)，且在根中的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，暗示其在脯氨酸生物合成中發(fā)揮重要作用，在植物中表達(dá)可引起滲透調(diào)節(jié)［15］。研究證明，轉(zhuǎn)P5CS基因的高羊茅［16］和白三葉［17］的抗旱性有一定程度的增強(qiáng)。
1987年，Klein等［18］利用基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥（Allium cepa）表皮細(xì)胞獲得成功，使這一技術(shù)在單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化中得到應(yīng)用。而利用基因槍法對(duì)玉米開(kāi)展基于P5CS基因的遺傳轉(zhuǎn)化還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用基因槍法將豇豆P5CS基因的突變型P5CS-F129A基因?qū)胗衩鬃越幌稻?01中，經(jīng)草丁膦篩選獲得轉(zhuǎn)化體，對(duì)草丁膦抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和Northern blot鑒定，同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行脯氨酸和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定。
1 材料與方法
1.1 材料
供試的玉米（Zea mays L.）為自交系京501，由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米中心提供。
1.2 方法
1.2.1 植物表達(dá)載體 質(zhì)粒pBPC-P5CS-F129A由北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心提供，該基因上游為Ubi（玉米泛醌素）啟動(dòng)子，下游為 nos終止子，選擇標(biāo)記基因是bar基因（圖1）。
圖1 pBPC-P5CS-F129A質(zhì)粒圖譜
1.2.2 玉米幼胚的接種 取授粉后 10-13 d、幼胚大小為 1-2 mm的玉米果穗，去苞葉后在70%的酒精中浸泡5-10 min，取出后用解剖刀削去種皮及部分胚乳，挑出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
1.2.3 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基：N6大量、B5微量、N6有機(jī)、Fe鹽、脯氨酸690 mg/L、水解酪蛋白200 mg/L、肌醇100 mg/L、蔗糖30 mg/L、植物凝膠2.6mg/L或瓊脂粉6 mg/L；愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加 2，4-D 2 mg/L和10 mg/L AgNO3；選擇培養(yǎng)基：愈傷組織誘導(dǎo)或繼代培養(yǎng)基附加不同濃度草丁膦和10 mg/L AgNO3；胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加1.5 mg/L KT；分化培養(yǎng)基：同基本培養(yǎng)基；生根壯苗培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加0.5 mg/L NAA。
1.2.4 基因槍轟擊方法與參數(shù) 參見(jiàn)文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行。
1.2.5 胚性愈傷組織的篩選
1.2.5.1 胚性愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 將用基因槍轟擊后的胚性愈傷組織，在原培養(yǎng)皿中、暗處恢復(fù)培養(yǎng)3-5 d以便修復(fù)由微彈復(fù)合體對(duì)受體細(xì)胞造成的損傷。
1.2.5.2 胚性愈傷組織的繼代篩選 將恢復(fù)培養(yǎng)后的胚性愈傷組織接種在附加草丁膦6 mg/L篩選繼代培養(yǎng)基篩選15 d。然后，將存活的抗性愈傷轉(zhuǎn)接到草丁膦10 mg/L的篩選繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行第2次篩選15 d。
1.2.6 植株的再生及移栽 抗性愈傷組織在附加1.5 mg/L KT的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基進(jìn)行綠苗分化。分化的綠苗長(zhǎng)出主莖后，將其移至生根壯苗培養(yǎng)基上生根壯苗。待幼苗長(zhǎng)出 2片新葉、3-4條主根后，移至裝有營(yíng)養(yǎng)土（2/3蛭石+1/3腐殖質(zhì)）的小花盆中。當(dāng)幼苗在小花盆中長(zhǎng)出 1-2片新葉，帶土移栽到大田。
1.2.7 再生植株的分子檢測(cè)
1.2.7.1 選取草丁膦抗性的植株，用CTAB法提取葉片總DNA，利用PCR對(duì)P5CS基因進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)P5CS基因的序列設(shè)計(jì)引物為：上游引物：22 bp 5'-CTCTCTACGATACGCTGTTCAC-3'；下游引物：20 bp 5'-CTTCTTTGCCACCTTTCAAG-3'；陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出1 008 bp的片段。PCR采用由東盛公司生產(chǎn)的擴(kuò)增儀。
1.2.7.2 PCR陽(yáng)性植株的Northern blot 鑒定 取經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的植株進(jìn)行Northern blot 分析，以未轉(zhuǎn)基因的野生型植株的RNA為陰性對(duì)照。探針標(biāo)記和雜交檢測(cè)按照Roche公司的地高辛試劑盒的方法進(jìn)行，雜交溫度為41℃。具體參見(jiàn)文獻(xiàn)［19］的方法進(jìn)行。
1.2.8 脯氨酸含量測(cè)定 對(duì)部分轉(zhuǎn)基因玉米植株和對(duì)照植株進(jìn)行干旱處理，測(cè)定幼苗葉片脯氨酸含量。葉片脯氨酸含量的測(cè)定按Bates和張殿忠等［20，21］的方法進(jìn)行。數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
1.2.9 葉片丙二醛（MDA）含量測(cè)定 丙二醛（MDA）含量通過(guò)與硫代巴比妥酸的顏色反應(yīng)來(lái)測(cè)定［22，23］。
2 結(jié)果
2.1 胚性愈傷組織的篩選和植株再生
用不同濃度的草丁膦對(duì)幼胚愈傷組織進(jìn)行兩次篩選。第1次是在附加草丁膦6 mg/L篩選繼代培養(yǎng)基篩選15 d，愈傷組織的成活率在30%左右。然后，將存活的抗性愈傷轉(zhuǎn)接到草丁膦10 mg/L的篩選繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行第2次篩選15 d。在愈傷組織篩選過(guò)程中，非抗性愈傷組織塊會(huì)逐漸褐化變黑而死亡，25-35 d后，大部分（90%-95%）愈傷組織被殺死，只有少部分（5%-10%）愈傷組織能夠存活下來(lái)（抗性愈傷組織）并逐漸長(zhǎng)出綠色的小芽點(diǎn)，再經(jīng)過(guò)10-20 d后，發(fā)育成具有莖和葉的小植株，最后在生根培養(yǎng)基上發(fā)育成完整的植株（圖2）。
圖2 玉米植株再生體系的建立
2.2 轉(zhuǎn)基因玉米植株的分子檢測(cè)
用設(shè)計(jì)好的引物對(duì)草丁膦抗性植株進(jìn)行P5CS基因的PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因植株的P5CS基因擴(kuò)增帶位置與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增帶位置相同，而陰性對(duì)照及其他植株無(wú)擴(kuò)增帶（圖3-A）。經(jīng)檢測(cè)，共得到11株P(guān)CR陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率70%。
為了檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中是否表達(dá)，從野生型和3個(gè)轉(zhuǎn)基因植株葉片中提取總RNA，進(jìn)行Northern blot分析。每個(gè)泳道RNA上樣量為15 μg，探針為地高辛標(biāo)記的P5CS cDNA特異探針，溴化乙錠染色的rRNA作內(nèi)參，Northern雜交檢測(cè)結(jié)果如圖3-B所示。在未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株中未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，而在各轉(zhuǎn)基因植株株系中目的基因均有不同程度的表達(dá)。根據(jù)目的基因表達(dá)強(qiáng)度，選擇株系L2、L9進(jìn)行抗旱性實(shí)驗(yàn)。
2.3 轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量增加
為了解在干旱脅迫處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸積累的變化，測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株葉片脯氨酸的含量。在干旱脅迫處理之前，葉片脯氨酸含量在轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株之間沒(méi)有顯著差異，含量都較低。干旱脅迫引起轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸含量有不同程度的上升。在干旱脅迫處理過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸的含量都顯著高于其對(duì)照植株。如在正常條件下，WT、L2和L9植株的脯氨酸含量分別為23.4、24.1和26.5 μg/g·FW，沒(méi)有顯著差異。干旱脅迫處理3 d后，L2和L9植株脯氨酸含量分別上升為63.7和66.1 μg/g·FW，顯著高于WT植株的51.3 μg/g·FW，轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸含量比對(duì)照株高24.2%-28.8%（圖4，表1）。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞可以積累更多的脯氨酸，使細(xì)胞能夠維持較低的溶質(zhì)勢(shì)，從而能夠更好地保持水分，減少或免受干旱脅迫的傷害。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱脅迫具有較強(qiáng)的耐性。
圖4 干旱脅迫引起的玉米幼苗脯氨酸含量的變化
表1 不同株系在不同處理時(shí)間條件下脯氨酸的含量（μg/g·FW）變化
2.4 轉(zhuǎn)基因植株具有較低的丙二醛含量
干旱脅迫條件下，玉米葉片失水萎蔫，葉片細(xì)胞內(nèi)活性氧含量上升，使細(xì)胞膜脂成分發(fā)生氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物為丙二醛（MDA），MDA能與蛋白質(zhì)等交聯(lián)導(dǎo)致酶失活或膜系統(tǒng)受損，因此，植物體內(nèi)MDA含量的高低可在一定程度上反映玉米植株在干旱脅迫條件下膜脂過(guò)氧化的程度的大小。結(jié)果表明：在干旱脅迫處理前，各株系的丙二醛含量差別較小，且隨著干旱脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（圖5，表2）。相同處理時(shí)間下轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照株系相比測(cè)定值要低。如在干旱脅迫處理第3天時(shí)，L2和L9的MDA含量分別為18.8 nmol/g FW，14.0 nmol/g FW，而WT的測(cè)定值達(dá)到了21.5 nmol/g FW。這些結(jié)果表明，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)P5CS基因植株的細(xì)胞膜損傷較輕，有利于植株的生長(zhǎng)，使轉(zhuǎn)基因植株抗旱性得到提高。
圖5 干旱脅迫引起的玉米幼苗丙二醛含量的變化
表2 不同株系在不同處理時(shí)間條件下丙二醛的含量（nmol/g·FW）變化
3 討論
環(huán)境中，植物常常遭受干旱脅迫。植物通過(guò)激活一系列信號(hào)途徑來(lái)響應(yīng)脅迫，使植物能抵御或適應(yīng)干旱脅迫。干旱可以產(chǎn)生細(xì)胞傷害和次生脅迫，如滲透和氧化脅迫。通過(guò)信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)下游信號(hào)程序和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，激活脅迫響應(yīng)機(jī)制（如脯氨酸參與的滲透保護(hù)）以重建平衡，保護(hù)和修復(fù)受傷害蛋白和各種膜，從而賦予植物脅迫耐性［24］。
干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，通過(guò)滲透脅迫影響植物細(xì)胞膨壓從而導(dǎo)致植物的不良生長(zhǎng)。在滲透脅迫下，植物將產(chǎn)生一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵抗該脅迫，包括脯氨酸和甜菜堿。脯氨酸主要來(lái)源于谷氨酸合成途徑［25］。研究表明，由P5CS基因編碼的Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是滲透脅迫時(shí)植物體內(nèi)合成脯氨酸的關(guān)鍵酶，單獨(dú)轉(zhuǎn)化P5CS基因的植株可以提高脯氨酸的含量，起到抗旱的作用［26］。
自從1992年第一個(gè)高等植物的P5CS基因從豇豆中克隆以來(lái)，在許多植物中克隆出該基因。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅從2010年以來(lái)就從20多種植物中成功克隆了P5CS基因［27-53］。同時(shí)，利用豇豆P5CS基因轉(zhuǎn)化高羊茅［16］、冰草［54］、白三葉［17］，多年生黑麥草P5CS基因轉(zhuǎn)化擬南芥［55］，普通菜豆PvP5CS1基因轉(zhuǎn)化擬南芥［56］、PvP5CS2基因轉(zhuǎn)化煙草［56］，朝鮮堿茅P5CS基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿［57］，新牧一號(hào)苜蓿MvP5CS基因轉(zhuǎn)化棉花［58］，擬南芥P5CS1基因轉(zhuǎn)化羽衣甘藍(lán)［47］和馬鈴薯［59］均獲得成功。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)化P5CS基因可顯著提高多種植物的脯氨酸水平［60-63］。轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照植株最低也高達(dá)20.0%［17］，有的高達(dá)12倍［61］，耐旱性也有不同程度的提高。研究還發(fā)現(xiàn)，脯氨酸在調(diào)控植物體內(nèi)蛋白合成和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換中起重要作用，脯氨酸可以保護(hù)遭受滲透?jìng)Φ陌l(fā)育中的細(xì)胞［49］。脯氨酸合成不足會(huì)導(dǎo)致周期蛋白基因和其他細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，暗示脯氨酸可以作為植物發(fā)育中的信號(hào)分子參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［64］。
為進(jìn)一步探討植物抗旱的生理機(jī)制，Singh等［65］比較了兩種棉花的干旱耐性相關(guān)基因的差異表達(dá)譜和生理表現(xiàn)。結(jié)果顯示，在干旱條件下，生理指標(biāo)諸如凈光合速率、蒸騰、氣孔導(dǎo)度、葉綠素?zé)晒?、相?duì)含水量（RWC）和水勢(shì)都會(huì)發(fā)生變化，而脯氨酸、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）含量會(huì)隨著其相關(guān)基因表達(dá)改變而增加。中度脅迫下，耐旱品種保持較低的水勢(shì)可能是由于與敏感品種相比具有的較高脯氨酸含量?；虮磉_(dá)分析顯示，耐旱品種通過(guò)上調(diào)天冬酰胺合成酶調(diào)節(jié)（AS）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和甲基乙二醛（glyI）基因表達(dá)增強(qiáng)解毒機(jī)制，同時(shí)，耐旱品種通過(guò)上調(diào)Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因增強(qiáng)脯氨酸，一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累［65］。研究也發(fā)現(xiàn)，玉米在長(zhǎng)期遭受非生物逆境脅迫尤其是干旱脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)離子平衡遭到破壞，從而影響一系列代謝通路，導(dǎo)致多種生理活動(dòng)出現(xiàn)紊亂，最終對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用［3］。
為了提高玉米對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力，將來(lái)自豇豆的P5CS基因轉(zhuǎn)化玉米。首先通過(guò)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，建立了基于玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化體系；其次采用基因槍轉(zhuǎn)化法將P5CS基因轉(zhuǎn)化到玉米基因組中，并通過(guò)PCR和Northern blot檢測(cè)，驗(yàn)證了目的基因已轉(zhuǎn)入到玉米基因組中并得到表達(dá)。
另外，通過(guò)探討轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫條件下的生理生化變化對(duì)其抗旱性進(jìn)行了初步研究。測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的脯氨酸含量。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因玉米植株中脯氨酸含量的增加明顯高于對(duì)照植株，如干旱脅迫處理3 d后，轉(zhuǎn)基因株系L9植株脯氨酸含量為66.1 μg/g·FW，顯著高于WT植株的51.3 μg/g·FW（圖4，表1），說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞能夠維持較低的溶質(zhì)勢(shì)，抵御干旱脅迫能力較強(qiáng)。
水分脅迫會(huì)造成植物細(xì)胞原生質(zhì)膜的損傷，破壞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性降低，透性增大，干旱脅迫也會(huì)使細(xì)胞膜脂成分發(fā)生氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物主要是丙二醛（MDA）。MDA（丙二醛）含量越高，反映植物抗旱性越弱，反之，則植物抗旱性強(qiáng)。質(zhì)膜傷害度增值與抗旱性為顯著負(fù)相關(guān)［66］。轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的MDA含量測(cè)定結(jié)果顯示，相同處理時(shí)間下轉(zhuǎn)基因株系的MDA比對(duì)照株系的要低。在干旱脅迫處理第3天時(shí)，L9的MDA含量分別為14.0 nmol/g·FW，而WT的測(cè)定值達(dá)到了21.5 nmol/g·FW。表明干旱脅迫下，與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的膜脂過(guò)氧化程度較輕，細(xì)胞膜穩(wěn)定性較高，抗旱性較強(qiáng)（圖5，表2）。在干旱脅迫下轉(zhuǎn)P5CS基因植株可以通過(guò)降低細(xì)胞膜損傷提高干旱耐性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)P5CS基因玉米的抗旱性得到了一定提高。后續(xù)將對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行田間抗旱性分析，篩選抗旱性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因玉米新材料，為玉米抗旱育種提供中間材料。
近年來(lái)，P5CS基因?qū)μ岣咧参锟购的芰υ诳鼓婊蚬こ躺系膽?yīng)用不斷得到研究探討與證實(shí)，這些研究應(yīng)用將為抗旱植物的培育及真正運(yùn)用于大田生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前，我國(guó)玉米產(chǎn)量和品質(zhì)雖有一定提高但仍繼續(xù)進(jìn)行改良，考慮到目前轉(zhuǎn)基因玉米的應(yīng)用主要集中在抗蟲(chóng)、抗除草劑方面，而對(duì)于中國(guó)北方大面積的缺水現(xiàn)狀而言，利用不同遺傳背景的P5CS基因轉(zhuǎn)化玉米，增加玉米的抗旱性，獲得具有優(yōu)良性狀并能穩(wěn)定遺傳的耐旱玉米新品種將具有重要的經(jīng)濟(jì)和實(shí)踐意義，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。
4 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)的研究表明，豇豆P5CS基因已整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因玉米基因組中并能夠在植株中表達(dá)。干旱脅迫下，轉(zhuǎn)P5CS基因玉米植株的脯氨酸含量比對(duì)照高，而丙二醛含量比對(duì)照要低，轉(zhuǎn)基因玉米植株的抗旱性得到提高。
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（責(zé)任編輯 狄艷紅）
The Transformation of Drought-resistant Gene into Maize by Microprojectile Bombardment
LI Zhi-liang1，2，5WU Zhong-yi2YANG Qing3ZHANG Xi-tai4YE Jia1，5XING Hao-chun1，5CHEN Jian-zhong1，5HUANG Cong-lin2
（1. College of Life Sciences and Engineering，Handan University，Handan 056005；2. Beijing Research Center of Agro-Biotechnology，Beijing 100097；3. College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；4. Handan Academy of Agricultural Sciences in Hebei Province，Handan 056001；5. Application Technology Research and Development Center of Wild Resource Plants in Taihang Mountain Area of Southern Hebei for Hebei Institutions of Higher Education，Handan 056005）
A drought-resistance function gene，VaP5CS，was cloned from mothbean（Vigna aconitifolia）. Plant expression vector pBPC-P5CS-F129A was constructed using gene engineering strategy，then the genetic transformation of young embryo callus in maize inbred line Jing 501 was performed by microprojectile bombardment. Further，the transformed explants were directly selected on the medium containing 10 mg/L glufosinate，and the glufosinate-resistant plantlets were confirmed by PCR amplification and Northern blot identification. Finally，the different drought resistance indexes of P5CS-transgenic maize plants were analyzed. The results showed that the transgenic plants presented the improved drought resistance comparing to control plants. Under drought stress，the proline content in the P5CS-transgenic maize plant was higher than that in the control，while the MDA content was lower than that in the control.
Zea mays；callus；microprojectile bombardment；glufosinate；genetic transformation；drought resistance
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.008
2015-08-05
國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2009ZX08003-009B），邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（1322101065），邯鄲學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13208）
李志亮，男，博士，副教授，研究方向：植物生理、植物細(xì)胞工程和分子生物學(xué)；E-mail：zhiliangli09@126.com
黃叢林，男，博士，研究員，研究方向：植物抗旱、抗寒、耐鹽分子生物學(xué)及基因工程改良；E-mail：huangconglin@hotmail.com
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