韓春艷,何曉琳,李安文,黃詩達(dá),歐桂麗,黃李勇

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州 514011)

酸堿脅迫對(duì)奧尼羅非魚幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)及Na+-K+-ATP酶活力的影響

韓春艷,何曉琳,李安文,黃詩達(dá),歐桂麗,黃李勇

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州 514011)

摘要[目的]探討酸堿脅迫對(duì)奧尼羅非魚幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)及Na+-K+-ATP酶活力的影響。[方法]將初始體質(zhì)量(6.81±0.85)g奧尼羅非魚(Oreochromis aureus×Oreochromis niloticus)幼魚暴露于不同酸堿度(pH分別為4.5、6.0、7.5、9.0、10.5，依次設(shè)為試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組、對(duì)照組及試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組)的水體中，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚。脅迫后0、12、24、48、72 h采集魚鰓樣本，采用HE染色石蠟組織切片及分光光度法比較酸堿脅迫對(duì)魚鰓組織結(jié)構(gòu)及其中Na+-K+-ATP酶活力的影響。[結(jié)果]對(duì)照組魚鰓的組織結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)有明顯病變的癥狀，且鰓中的Na+-K+-ATP酶活力維持在一定水平；各脅迫組魚鰓組織結(jié)構(gòu)均不同程度發(fā)生病變，出現(xiàn)鰓絲融合，動(dòng)脈血管破損，鰓小片腫脹彎曲，頂端與末端粘充血和腫脹，黏液細(xì)胞增多，上皮細(xì)胞增生、脫落，泌氯細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)空泡化等一系列病態(tài)癥狀，且其癥狀會(huì)隨著酸堿程度的加深、暴露時(shí)間的延長而加重；酸堿脅迫后各脅迫組魚鰓中Na+-K+-ATP酶活力均出現(xiàn)先升高后降低的變化，其中酸脅迫的峰值出現(xiàn)在48 h，而堿脅迫出現(xiàn)在12 h。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為奧尼羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞酸堿脅迫；奧尼羅非魚；鰓；組織結(jié)構(gòu)；Na+-K+-ATP酶活力

水體的酸堿度是影響魚類生活的重要環(huán)境因素，其直接影響魚類的滲透調(diào)節(jié)、生長和存活等生理機(jī)能。與海水相比，淡水的緩沖能力較差，因此其酸堿度波動(dòng)范圍范圍更大。研究表明，由于水生植物白天的光合作用及夜間動(dòng)植物對(duì)CO2的釋放，池塘水體的pH可在6.6～10.2范圍內(nèi)波動(dòng)[1]。近年來，我國工業(yè)快速發(fā)展而導(dǎo)致的酸雨已成為水體酸化的重要因素[2]。同時(shí)，河流兩岸堿性粉煤灰、氧化鈣等的排出使水環(huán)境堿化嚴(yán)重[3]。此外，由于水體中水溶性有機(jī)物含量的增加，導(dǎo)致養(yǎng)殖池塘赤潮的形成，赤潮發(fā)生時(shí)池塘的pH可達(dá)到9.0[4]。

鰓作為魚類呼吸的主要器官，其結(jié)構(gòu)的完整性直接影響到機(jī)體的氣體交換、滲透壓調(diào)節(jié)及其廢物排泄等功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[5]。特別是鰓絲上皮細(xì)胞中Na+-K+-ATP酶起著離子載體和通道的初動(dòng)力的作用，除了穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡外，還可以為離子逆濃度梯度的跨膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)提供驅(qū)動(dòng)力[6-7]，由于它與膜上磷脂結(jié)合狀態(tài)的變化能夠影響膜的其他功能，因此，Na+-K+-ATP酶活性也是評(píng)價(jià)污染壓力[8]和離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力[9]的重要生物學(xué)指標(biāo)之一。大量研究表明，水體酸堿度對(duì)魚鰓組織結(jié)構(gòu)及魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)均具有重要影響[10-12]，關(guān)于水體鹽度、酸堿性、氨氮、碳源、重金屬等對(duì)魚類魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響有一些研究報(bào)道[13-16]，但關(guān)于不同養(yǎng)殖水體酸堿度對(duì)奧尼羅非魚魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響及Na+-K+-ATP酶活性的變化則鮮見報(bào)道。筆者通過蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色石蠟組織切片及Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定的方法，檢測(cè)酸堿脅迫條件下奧尼羅非魚的魚鰓組織結(jié)構(gòu)及Na+-K+-ATP酶活性的變化，旨在了解酸堿脅迫對(duì)奧尼羅非魚魚鰓造成損傷狀況及鰓中Na+-K+-ATP酶活性的變化，為奧尼羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)管理試驗(yàn)幼魚為奧尼羅非魚，初始體質(zhì)量為(6.81±0.85)g，購自虎門沙田魚苗場。試驗(yàn)前暫養(yǎng)于室外水池中，馴化14 d，日投喂商業(yè)飼料2次(8:00和17:00)。待攝食和生長正常后，選擇體質(zhì)量基本一致的健康幼魚進(jìn)行試驗(yàn)，正式試驗(yàn)前停食24 h，試驗(yàn)期間不投喂。

使用2 moL/L鹽酸溶液和2 moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)經(jīng)曝氣處理過的自來水，將水體pH分別調(diào)整為4.5、6.0、7.5、9.0、10.5(分別設(shè)為試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組、對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅲ組及試驗(yàn)Ⅳ組)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚。試驗(yàn)在80 L的水族箱中進(jìn)行，充入自來水后曝氣3 d后使用。試驗(yàn)期間水溫維持在(28±1)℃，24 h連續(xù)充氧。

1.2樣品采集分別于脅迫后12、24、48、72 h分別從各水族箱中隨機(jī)取出5尾幼魚，經(jīng)過MS-222麻醉后，立即切取右側(cè)第二鰓弓，分成若干大小約為0.3 cm3小段后，用Bouin’s試液固定，4 ℃下保存?zhèn)溆?。將兩?cè)鰓余下部分全部取出置于-20 ℃冷凍保存，以供測(cè)定鰓絲Na+-K+-ATP酶活力的測(cè)定。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1HE染色石蠟組織切片的制備及觀察。將Bouin’s液固定的鰓絲樣品進(jìn)行梯度乙醇脫水，經(jīng)水楊酸甲酯透明，分離2片半鰓，將單個(gè)半鰓進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度6 μm，HE染色，中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.3.2魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活力的測(cè)定。羅非魚幼魚鰓絲樣品經(jīng)生理鹽水潤洗后，在冰水浴中勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液，用超微量Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定試劑盒 (購自南京建成生物工程研究所)測(cè)定。Na+-K+-ATP酶活性的測(cè)定采用比色法，活性單位定義為1 h在含有1 mg組織蛋白的組織中ATP酶參與分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1個(gè)酶活性單位(U)。

2結(jié)果與分析

2.1酸堿脅迫對(duì)奧尼羅非魚幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響從圖1可以看出，對(duì)照組奧尼羅非魚的鰓絲發(fā)達(dá)，排列緊密，細(xì)胞間無明顯間隙；鰓絲向兩側(cè)伸出半圓形扁平囊狀的鰓小片，平行排列，窄且長，均勻分布在鰓絲兩側(cè)。鰓絲上皮由多層上皮細(xì)胞組成，包括黏液細(xì)胞、泌氯細(xì)胞、和扁平細(xì)胞等。在鰓小片上皮中有扁平細(xì)胞、柱細(xì)胞即支持細(xì)胞以及血管道等，血道內(nèi)存在血細(xì)胞。鰓小片上泌氯細(xì)胞的分布出現(xiàn)以下明顯特征：主要在鰓小片的基部區(qū)域，泌氯細(xì)胞數(shù)量較少，且多相鄰分布，并與鰓小片柱狀毛細(xì)血管相鄰，胞體和胞核均較大而明顯，多為長柱形或卵圓形；同時(shí)，黏液細(xì)胞豐富，胞體較大，胞質(zhì)透明，廣泛分布于鰓絲上皮中；鰓小片上皮中的扁平細(xì)胞薄且呈長梭型，排列緊密，且泌氯細(xì)胞呈現(xiàn)相鄰狀態(tài)(圖1A～D)。

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組奧尼羅非魚的鰓絲組織結(jié)構(gòu)(圖1E～H)，鰓絲中間的動(dòng)脈血管出現(xiàn)明顯的破損以致血管內(nèi)血細(xì)胞呈現(xiàn)散亂分布(圖1G～H)；鰓小片有顯著的變形呈彎曲狀態(tài)，其頂端和末端也有明顯的充血和腫脹，相鄰的鰓小片出現(xiàn)融合現(xiàn)象，有部分鰓小片出現(xiàn)脫落(圖1E、H)；鰓絲上皮中的黏液細(xì)胞數(shù)量增多，上皮細(xì)胞增生，扁平細(xì)胞排列松散雜亂，出現(xiàn)脫落；泌氯細(xì)胞腫脹，同時(shí)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞質(zhì)空泡化(圖1F)；試驗(yàn)Ⅱ組也出現(xiàn)了血管破損、鰓小片彎曲或融合、頂端和末端也有明顯的充血和腫脹、上皮細(xì)胞增生等病變現(xiàn)象(圖1I～L)，但試驗(yàn)Ⅱ組魚鰓組織損傷和病變程度較試驗(yàn)Ⅰ組輕。

從組織切片觀察表明，試驗(yàn)Ⅲ組(圖1M～P)鰓絲的輸出動(dòng)脈血管出現(xiàn)明顯的破損，血管內(nèi)血細(xì)胞呈現(xiàn)散亂分布(圖1M、P)；鰓小片有顯著的變形呈彎曲狀態(tài)，其頂端和末端也有明顯的充血和腫脹，相鄰的鰓小片出現(xiàn)融合現(xiàn)象；鰓絲上皮中的黏液細(xì)胞數(shù)量增多，上皮細(xì)胞增生，扁平細(xì)胞排列松散雜亂，出現(xiàn)脫落(圖1N)；泌氯細(xì)胞腫脹，同時(shí)出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞質(zhì)空泡化(圖1O)；這些現(xiàn)象隨著水體pH的增大而加重，試驗(yàn)Ⅳ組魚鰓組織病理變化更加嚴(yán)重(圖1Q～T)。

2.2酸堿脅迫對(duì)奧尼羅非魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活性的影響由表1可知，對(duì)同一試驗(yàn)組不同的脅迫時(shí)間比較發(fā)現(xiàn)，與脅迫前相比，除對(duì)照組外，各組幼魚鰓中的Na+-K+-ATP酶活性均出現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)，其中堿脅迫組最高點(diǎn)均出現(xiàn)在脅迫后24 h，此后顯著下降至72 h達(dá)到脅迫前水平；而酸脅迫組最高點(diǎn)則出現(xiàn)在48 h，其中試驗(yàn)Ⅱ組隨后顯著下降，但顯著高于脅迫前水平，試驗(yàn)Ⅰ組則顯著低于脅迫前水平。對(duì)不同處理同一脅迫時(shí)間的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，脅迫12 h時(shí)除試驗(yàn)Ⅰ組外，其余各組Na+-K+-ATP酶活性顯著高于對(duì)照組，其中堿脅迫(試驗(yàn)Ⅲ和Ⅳ組)顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組；脅迫24 h，魚鰓內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性從高到低依次為試驗(yàn)Ⅳ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅰ組、對(duì)照組，其中試驗(yàn)Ⅰ組和對(duì)照組差異不顯著，其余各組間差異顯著；脅迫48 h，Na+-K+-ATP酶活性從高到低依次為試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅲ、試驗(yàn)Ⅳ組、對(duì)照組，其中試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著；脅迫72 h，試驗(yàn)Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組魚鰓內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性顯著低于試驗(yàn)Ⅱ組，而顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組。

表1　酸堿脅迫對(duì)奧尼羅非魚鰓Na+-K+-ATP酶活力的影響

注：肩標(biāo)不同小寫字母表示同一處理不同暴露時(shí)間差異顯著，肩標(biāo)不同大寫字母表示不同處理同一暴露時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercases stand for significant difference in the same treatment at different exposure time(P<0.05), different capital letters indicate significant difference among different treatments at the same exposure time(P<0.05).

注：A～T分別為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組魚體暴露于脅迫條件后12、24、48及72 h鰓組織結(jié)構(gòu)。GF.鰓絲；GL.鰓小片；B.血管道和血細(xì)胞；EC.上皮細(xì)胞群；CC.泌氯細(xì)胞；MC.黏液細(xì)胞；GLB.鰓小片彎曲；GLD.鰓小片脫落；GLF.鰓小片融合； HEC.上皮細(xì)胞增生；CCS.泌氯細(xì)胞腫脹；HMC.黏液細(xì)胞增多；US.終端充血腫脹；K.空泡；PCD.扁平細(xì)胞脫落。Note:A-T are control group,test 1, 2, 3, 4 group,gill structure of fish exposed under stress conditions for 12,24,48 and 72 h.GF.Gill filament; GL.Gill lamella; B.Blood vessel and blood cell; EC.Epithelial cell group; CC.Chloride cell; MC.Mucous cell; GLB.Gill lamella blending; GLD.Gill lamella drop; GLF.Gill lamella fusion; HEC.Epithelial cell hyperplasia; CCS.Chloride cell swelling; HMC.Mucous cell hyperplasia; US.Terminal congestion and swelling; K.Vacuole; PCD.Pinacocyte detachment.圖1　酸堿脅迫對(duì)奧尼羅非魚幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響(1 000×)Fig.1　Effects of pH stress on gill structure of tilapia juvenile

3討論與結(jié)論

鰓作為魚類和其他水生動(dòng)物的呼吸器官，擔(dān)負(fù)機(jī)體的氣體交換、滲透調(diào)節(jié)及排泄等功能。魚鰓組織病理的變化大多與污染物或不利環(huán)境因素有關(guān)。觀察水體環(huán)境對(duì)魚類的影響，除了生化標(biāo)記物、免疫學(xué)標(biāo)記物以外，近年來開始采用組織病理變化的方法進(jìn)行標(biāo)記物檢測(cè)[17-18]。水環(huán)境條件的變化可導(dǎo)致魚鰓產(chǎn)生損傷，主要表現(xiàn)為2類：一是對(duì)魚鰓直接造成的損傷，包括鰓上皮細(xì)胞的壞死與脫落等；另外，會(huì)產(chǎn)生因防御反應(yīng)而產(chǎn)生的損傷，包括鰓絲上皮細(xì)胞增生、鰓小片呼吸上皮水腫等[18]。王雙耀等[19]對(duì)大菱鲆幼魚在不同PH水體內(nèi)飼養(yǎng)54 d后發(fā)現(xiàn)，pH為6.8和7.8時(shí)鰓上皮細(xì)胞未見明顯變化，而在pH為6.3時(shí)鰓小片上皮細(xì)胞角質(zhì)化較為嚴(yán)重；pH 8.3 時(shí)上皮細(xì)胞出現(xiàn)脫離，部分出現(xiàn)角質(zhì)化；pH為8.8時(shí)上皮細(xì)胞角質(zhì)化較為嚴(yán)重。該試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組中整個(gè)試驗(yàn)期間魚鰓均未出現(xiàn)組織損傷和病變。在試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組中，魚鰓明顯出現(xiàn)了鰓小片彎曲腫脹，粘液分泌增多，頂端與末端有充血和腫脹；鰓絲融合，上皮細(xì)胞增生；扁平細(xì)胞排列松散雜亂，出現(xiàn)脫落；泌氯細(xì)胞腫脹，同時(shí)出現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)空泡化等一系列的病態(tài)癥狀，癥狀隨暴露時(shí)間的延長而加重；在試驗(yàn)1和4組中，其組織病變程度發(fā)生了明顯的加重，甚至出現(xiàn)組織壞死，同時(shí)癥狀隨暴露時(shí)間的延長而加重。由此可見，在水體pH越低或越高和暴露時(shí)間的延長的情況下，都會(huì)造成魚鰓組織的損傷，破壞了鰓的功能。

鰓不僅是魚類的呼吸器官，也是調(diào)控機(jī)體滲透壓和離子運(yùn)輸?shù)闹匾鞴?。鰓上皮的泌氯細(xì)胞中含有大量Na+-K+-ATP酶，其是橫跨質(zhì)膜的一種酶類，通過消耗ATP來維持Na+、K+離子的交換，在機(jī)體離子調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，對(duì)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)、物質(zhì)吸收(葡萄糖、氨基酸等)和跨細(xì)胞離子運(yùn)動(dòng)有重要影響[20-22]。魚類大多偏于適應(yīng)中性或弱堿性環(huán)境，pH為7.0～8.5。pH過高或過低會(huì)導(dǎo)致魚類的耗氧率增加，同時(shí)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)酶的構(gòu)象、功能及其酶活性產(chǎn)生不良影響。如，破壞氧化磷酸化偶聯(lián),影響線粒體ATP合成與釋放,減少細(xì)胞ATP的合成來源[20]。對(duì)牙鲆[23]及鮸魚[24]鰓絲的體外研究表明，二者鰓絲內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性的最適pH為7～8，高于或低于該范圍其活力則顯著下降。該研究結(jié)果表明，酸堿脅迫后各脅迫組魚鰓中Na+-K+-ATP酶活力均出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，其中酸脅迫的峰值出現(xiàn)在48 h，而堿脅迫出現(xiàn)在12 h，其在峰值時(shí)的活力是正常值的2～4倍，其主要原因可能是在酸堿脅迫的條件下魚的耗氧量增加，需要更多的能量提供給鰓以保證機(jī)體氧的供應(yīng)。

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Effects of pH Stress on Structure,Activity of Na+-K+-ATPase in Gill of Tilapia (Oreochromisaureus×Oreochromisniloticus)

HAN Chun-yan,HE Xiao-lin,LI An-wen et al

(School of Life Science,Jiaying University,Meizhou,Guangdong 514011)

Abstract[Objective] The aim was to study effects of pH stress on structure,activity of Na+-K+-ATPase in gill of tilapia.[Method] Tilapia juvenile (initial average weight was 6.81±0.85)g was exposed in different pH water (pH were:4.5,6.0,7.5,9.0 and 10.5,arranged as experiment 1,2,control,3 and 4 group),with 3 repetition,each repeated 30 fish.Samples were collected at 0,12,24,48 and 72 h,HE staining and absorptiometry were used to compare the effects of pH stress on the structure and Na+-K+-ATP activity of the gill tissues.[Result] The results showed that there was no obvious displayed histopathologic alteraions in gill,the Na+-K+-ATPase activity of control group in gill was maintained at a certain level.The structures of the gill of the stress groups were pathological changes in different degree,such as fusion,arterial blood vessel damage,swelling and swelling of the gill lamellae,swelling of the cells in the apical and terminal,the symptoms can be aggravated by prolonged exposure time.Na+-K+-ATPase activity in gill of the stress groups was increased and then decreased,the peak of acid stress group appeared at 48 h,while the alkali stress group appeared at 12 h.[Conclusion] The study results can provide theoretical basis for aquaculture production of tilapia.

Key wordspH stress; Tilapia;Gill;Tissue structure;Na+-K+-ATPase activity

基金項(xiàng)目廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020307016)；2015年廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)(pdjh2015b0496)。

作者簡介韓春艷(1973- )，女，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，博士，從事水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)研究。

收稿日期2016-03-23

中圖分類號(hào)S 912

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)11-273-04