王曉培　程家鳳　鄭茜茜

232001　安徽省淮南市，安徽理工大學(xué)附屬東方醫(yī)院

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·論著·

JAK2V617F突變陽性骨髓增殖性腫瘤患者凝血功能異常及伴發(fā)血管性疾病的臨床分析

王曉培程家鳳鄭茜茜

232001安徽省淮南市，安徽理工大學(xué)附屬東方醫(yī)院

【摘要】目的探討JAK2V617F基因突變陽性骨髓增殖性腫瘤(MPN)患者常規(guī)凝血功能的改變及伴發(fā)血管性疾病的關(guān)系。方法收集2008年4月至2015年4月共68例MPN患者的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，其中伴發(fā)血管性疾病28例，無血管性疾病40例。回顧性分析JAK2V617F基因突變與各項(xiàng)指標(biāo)及血管性疾病間的關(guān)系。結(jié)果(1)68例MPN患者中存在JAK2V617F基因突變45例(66%)，其中27例(79%)真性紅細(xì)胞增多癥(PV)，16例(53%)原發(fā)性血小板增多癥(ET)，2例(50%)原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)。(2)MPN患者與正常健康對照組比較，血細(xì)胞計(jì)數(shù)及常規(guī)凝血指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。其中JAK2V617F基因突變陽性患者與JAK2V617F基因突變陰性患者比較，血細(xì)胞計(jì)數(shù)及常規(guī)凝血指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)28例合并血管性疾病的MPN患者中，JAK2V617F基因突變陽性患者的血管性疾病發(fā)生率更高(P<0.05或<0.01)，且JAK2V617F基因突變陽性患者與JAK2V617F基因突變陰性患者比較，血細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論MPN患者中JAK2V617F基因突變發(fā)生率較高，且JAK2V617F基因突變陽性患者的血細(xì)胞計(jì)數(shù)及凝血功能存在明顯異常。JAK2V617F突變陽性患者的血栓危險(xiǎn)因素如白細(xì)胞的升高較陰性者更顯著，血管性疾病的發(fā)生率更高。初診MPN患者檢測JAK2V617F基因突變、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、常規(guī)凝血指標(biāo)可初步評估患者凝血功能，預(yù)防血管性并發(fā)癥的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】骨髓增殖性腫瘤；JAK2V617F基因突變；血栓形成；血常規(guī)；凝血功能

骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPNs)是一組以骨髓增殖為主要表現(xiàn)的血液系統(tǒng)疾病，主要包括真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythaemia，ET)及原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)。近年來，多個(gè)MPN的分子生物學(xué)標(biāo)志陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如JAK2V617F、MPL、CALR等。其中，JAK2V617F突變的發(fā)現(xiàn)極大地影響了MPN患者的診斷和治療，2008年WHO將有無JAK2V617F基因突變列為MPN主要的診斷指標(biāo)之一。MPN患者壽命接近一般人群，死亡率升高主要由于并發(fā)血管性疾病。除了高齡、糖尿病等已知高危因素外，血細(xì)胞、凝血功能異常及JAK2V617F突變也在并發(fā)血管性疾病的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究回顧性分析了我院近7年收治的MPNs患者，對其伴發(fā)血管性疾病及有無JAK2V617F突變狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行分析報(bào)道，提高對MPNs伴血管性疾病診斷、危險(xiǎn)因素的認(rèn)識。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1MPN組:收集2008年4月至2015年4月在安徽理工大學(xué)附屬東方醫(yī)院血液科門診及住院患者68例，其中男35例，女33例；年齡33～82歲，中位年齡65歲；PV患者34例，ET 30例，PMF 4例；合并血管性疾病的患者28例，PV 16例，ET 12例。

1.1.2健康對照組:均為門診體檢人員，共28例，男14例，女14例；年齡23～72歲，中位年齡45歲，均無高血壓病、糖尿病及出凝血性疾病史，就診前無服用相關(guān)藥物史。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)所有MPNs(PV、PMF、ET)診斷均符合2008年世界衛(wèi)生組織有關(guān)MPN新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類[1]。血管性疾病包括腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作、深靜脈血栓形成、腦出血、下肢動脈血栓形成。

1.3方法MPN患者及健康對照組人員均于清晨空腹采集靜脈血，129 mmol/L枸櫞酸鈉9∶1抗凝，2 h內(nèi)以3 000 r/min離心10 min，分離血漿，用于止凝血指標(biāo)檢測。PT、APTT、Fbg、D-D采用法國STAGO公司提供的試劑盒，在STA-Compact血凝儀上測定。PT、APTT檢測采用磁珠凝固法，F(xiàn)bg檢測采用Glass法。采集EDTA 9∶1抗凝，靜脈血1 ml用于血常規(guī)檢測(WBC、RBC、PLT、Hb)。血常規(guī)采用美國Coulter公司提供的試劑盒，在Coulter公司血球計(jì)數(shù)儀上測定。采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR)技術(shù)。(1)基因組DNA提?。喝』颊咄庵苎? ml，按BIOMIGA血液基因組DNA提取試劑盒說明書抽提基因組DNA，DNA終濃度100～200 g/ml。(2)PCR擴(kuò)增：參考文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和PCR檢測。(3)瓊脂糖凝膠電泳：產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外光透視儀分析圖像并拍照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，僅出現(xiàn)364 bp條帶者為野生型，同時(shí)出現(xiàn)364 bp和203 bp條帶者為突變型。

2結(jié)果

2.1JAK2V617F突變68例MPN患者中，共檢出45例存在JAK2V617F突變，總突變率66%。34例PV患者中，JAK2V617F突變陽性27例，占79%。30例ET患者中，JAK2V617F突變陽性16例，占53%。4例PMF患者中，JAK2V617F突變陽性2例，占50%。正常對照組未檢出JAK2V617F突變。

2.2MPN組與健康對照組血細(xì)胞計(jì)數(shù)及常規(guī)止凝血指標(biāo)比較

表1　MPN組與健康對照組比較　±s

注：與健康對照組比較,*P<0.05,#P<0.01；與JAK2(-)比較,△P<0.05，☆P<0.01

2.2.1PV患者血細(xì)胞計(jì)數(shù)及常規(guī)止凝血指標(biāo)檢測:PV患者與正常健康對照組比較，PV組無論有無JAK2V617F突變，WBC、RBC、Hb及Fbg、D-D均較正常健康對照組升高(P<0.05或<0.01)，其中JAK2V617F突變陽性患者的WBC、RBC、Hb計(jì)數(shù)及Fbg、D-D升高更明顯(P<0.01)。PV患者中有JAK2V617F突變者與無突變者比較，JAK2V617F突變陽性者的上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PT、APTT及PLT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2.2ET患者血細(xì)胞計(jì)數(shù)及常規(guī)止凝血指標(biāo)檢測:ET患者與正常健康對照組比較，WBC、PLT及Fbg、D-D均較正常健康對照組升高(P<0.05或<0.01)。其中，ET組中JAK2V617F突變陽性患者的WBC、PLT計(jì)數(shù)及Fbg、D-D升高更加顯著(P<0.01)。有無JAK2V617F突變者比較，突變陽性患者WBC、D-D升高明顯(P<0.05)，PLT升高更顯著(P<0.01)。PT、APTT、RBC、Hb差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2.3PMF患者血細(xì)胞計(jì)數(shù)及常規(guī)止凝血指標(biāo)檢測:與健康對照組比較，PMF患者Hb、PLT明顯下降，WBC、D-D、Fbg升高(P<0.05或<0.01)，有JAK2V617F突變陽性患者，PLT下降及D-D、WBC升高更明顯(P<0.01)。JAK2V617F突變陽性與突變陰性患者比較，陽性患者WBC、D-D變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。PT、APTT、RBC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3MPN合并血管事件患者有無JAK2V617F突變的血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較共有28例MPN患者合并血管性疾病，其中JAK2V617F突變陽性22例，JAK2V617F突變陰性6例。2組患者比較，JAK2V617F突變陽性者WBC及PLT計(jì)數(shù)均明顯高于陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Hb計(jì)數(shù)在2組患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。22例JAK2V617F突變陽性患者中，PV 13例(81%)，ET 9例(75%)。6例JAK2V617F突變陰性患者中，PV 3例(19%)，ET 3例(25%)。PV患者和ET患者，JAK2V617F突變陽性患者的血管性疾病發(fā)生率更高(P<0.05或<0.01)。6例JAK2V617F突變陰性患者中，既往發(fā)生過血管性疾病1例(14.3%)，22例JAK2V617F突變陽性者，既往發(fā)生過血管性疾病6例(85.7%)，JAK2V617F突變陽性患者血管性疾病再發(fā)率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　MPN合并血管事件患者有無JAK2V617F突變的血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

注：與JAK2(-)比較，*P<0.05，#P<0.01

3討論

MPNs是一組克隆性疾病，有克隆增殖的能力，可轉(zhuǎn)化為骨髓纖維化或急性白血病，同時(shí)有發(fā)生諸如深靜脈血栓等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。JAK2V617F基因突變已成為Ph陰性MPNs的診斷性標(biāo)志。JAK2V617F發(fā)生于JAK2基因12號外顯子第1 894位堿基，該突變引起JAK/STAT信號通路異常激活，導(dǎo)致一系列調(diào)節(jié)細(xì)胞生存的細(xì)胞因子過度生成并最終引起疾病的發(fā)生。研究顯示，JAK2V617F突變存在于65%～97%的PV患者，23%～57%的ET患者和35%～57%PMF患者中。在我們此次研究中，66%(45/68)的患者檢測到存在JAK2V617F突變，其中PV組79.4%(27/34)，ET組53.3%(16.30)，PMF組50.0%(2/4)，符合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2-5]。

血栓形成是MPN患者就診及死亡的主要原因之一。這類疾病的易栓狀態(tài)發(fā)生機(jī)制包括正常血管細(xì)胞的異常和克隆的血細(xì)胞異常。除了高齡、血栓形成史、高血壓、高脂血癥、吸煙及糖尿病等MPNs易栓的高危因素，白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板的異常在血栓形成的過程中也發(fā)揮重要作用。

很多回顧性研究已經(jīng)確定，白細(xì)胞增多是PV及ET患者血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其作用機(jī)制可能與粒細(xì)胞、血小板和(或)內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互交叉作用有關(guān)。此外，白細(xì)胞通過促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊中的炎癥過程，也增加了血管性疾病發(fā)生率。在針對PV患者的ECLAP研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)>15×109/L時(shí)，血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于白細(xì)胞<10×109/L 患者[6]。在一項(xiàng)包含776例ET患者的回顧性研究中，ET患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)與血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有顯著相關(guān)性[7]。在PMF患者，白細(xì)胞計(jì)數(shù)>15×109/L時(shí)，血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加。本次研究中發(fā)現(xiàn)，PV、ET及PMF患者無論有無JAK2V617F突變，白細(xì)胞數(shù)量均較健康對照組明顯升高。在PV患者中，紅細(xì)胞增多可通過增加血液粘稠度導(dǎo)致血栓形成，PV患者腦血管中尤為顯著。除了紅細(xì)胞數(shù)量增加外，在最近的CYTO-PV研究中發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)容物的生化改變可能導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集，血流阻斷，并誘發(fā)血小板-白細(xì)胞相互作用增強(qiáng)，最終導(dǎo)致缺血及梗塞[8]。本次研究中亦發(fā)現(xiàn)PV患者無論有無JAK2V617F突變，紅細(xì)胞數(shù)量均較健康對照組升高，符合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

MPN患者可因MPN克隆的血細(xì)胞活化，宿主血管細(xì)胞通過獲得性APC抵抗使凝血酶產(chǎn)生持續(xù)增加及促凝微粒在循環(huán)中水平升高，導(dǎo)致高凝狀態(tài)。JAK2V617F突變陽性患者的游離PS、凝血素、因子V和組織因子通路抑制劑水平明顯下降，尤其是等位基因負(fù)荷>50%的患者，可獲得更多的APC抵抗，促進(jìn)凝血系統(tǒng)的激活，參與動靜脈血栓的形成。

多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)JAK2V617F突變與血栓形成有關(guān)，其影響血栓形成機(jī)制有：(1)通過修飾表面粘附分子引起紅細(xì)胞粘附的增加，促進(jìn)血栓形成；(2)通過改變TPO誘導(dǎo)的血小板啟動中C-MPL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)，導(dǎo)致血小板高反應(yīng)性；(3)JAK2V617F活化通過MAPK和P13K通路也參與了中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的TF表達(dá)。在ET及PV患者中，JAK2V617F突變陽性患者的動靜脈血栓風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，且突變等位基因負(fù)荷與血栓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。一項(xiàng)包括ET及PV患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，JAK2V617F突變等位基因負(fù)荷>50%的患者血管并發(fā)癥的發(fā)生率最高，等位基因負(fù)荷>75%的患者總血栓相對風(fēng)險(xiǎn)可增加3.56倍[9]。同樣有研究表明JAK2V617F突變是PMF患者動靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。

本次研究通過對68例MPN患者的分組研究，分別檢測外周血細(xì)胞、常規(guī)凝血功能，并與正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)無論有無JAK2V617F突變，均存在外周血細(xì)胞數(shù)量的異常，同時(shí)有凝血亢進(jìn)、纖溶激活及抗凝血的抑制等止凝血功能的改變。在對患者有無JAK2V617F突變進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)上述改變在JAK2V617F突變陽性患者中更為顯著。而進(jìn)一步通過對14例合并血管性疾病的MPN患者進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)JAK2V617F突變陽性患者的血栓危險(xiǎn)因素如白細(xì)胞的升高較陰性者更顯著，血管性疾病的發(fā)生率更高。

MPNs除了JAK2V617F突變外，存在其它眾多基因突變，如JAK外顯子12、MPL、CALR、IZF1、TP53、TET2、ASXL1、IDH1/2及EZH2和SRSF2突變。大約10%PMF患者和1%的ET患者具有MPL基因突變(MPL W515)，伴MPL突變ET與高血小板計(jì)數(shù)、微血管癥狀及診斷后動脈血栓高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。2013年研究發(fā)現(xiàn)，在無JAK2V617F突變或MPL突變的ET、PMF及不典型慢性粒細(xì)胞白血病患者中，部分存在CALR突變[11,12]。相比較于JAK2V617F突變陽性患者，CALR突變陽性的ET及PMF患者血栓發(fā)生率較低[13]，且白血病轉(zhuǎn)化率低，對IFN-α治療反應(yīng)較好，提示更佳的預(yù)后[13-15]。

綜上所述，MPN患者的外周血細(xì)胞及凝血功能檢測異常與其高凝狀態(tài)是一致的。這類疾病血液活化的機(jī)制是多因素的，是血栓形成的基礎(chǔ)，而JAK2V617F突變及高JAK2V617F突變等位基因負(fù)荷與血栓危險(xiǎn)增加密切相關(guān)，是血栓形成新的危險(xiǎn)因素。初診MPN患者檢測JAK2V617F突變、血常規(guī)及常規(guī)凝血指標(biāo)，可有效評估凝血狀態(tài)及發(fā)生血栓的風(fēng)險(xiǎn)。JAK2V617F突變陰性的ET及PMF患者，如條件允許，需行CALR突變及MPL突變的檢測，幫助更好的判斷預(yù)后。

參考文獻(xiàn)

1Vardiman JW,Thiele J,Arber DA,et al.The 2008 revision of the World Health Organization(WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia:rationale and important changes.Blood,2009,114:937-951.

2Baxter EJ，Scott LM，Campbell PJ，et al.Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders.Lancet，2005，365：1054-1061.

3Levine RL,Wadleigh M,Cools J,et al.Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera essential thrombocythemia,and myeloid metaplasia with myelofibrosis.Cancer Cell， 2005，7：387-397.

4James C,Ugo V,Le Couedic JP,et al.A unique clonal JAk2 mutation leading to constitutive signaling causes policythaemia vera.Nature，2005，434：1144-1148.

5Kralovics R，Passamonti F，Buser As，et al.A gain-of-function mutation of JAk2 in myeloproliferative disorders.N Engl J Med，2005，352：1779-1790.

6Landolfi R,Di Gennaro L,Barbui T,et al.Leukocytosis as a major thrombotic risk factor in patients with polycythemia vera.Blood,2007,109:2446-2452.

7Campbell PJ,Maclean C,Beer PA,et al.Correlation of blood counts with vascular complications in essential thrombocythemia: analysis of the prospective PT1 cohort.Blood,2012,120:1409-1411.

8Marchioli R,Finazzi G,Specchia G,et al.Cardiovascular events and intensity of treatment in polycythemia vera.N Engl J Med,2013,368:22-33.

9Vannucchi AM,Antonioli E,Guglielmelli P,et al.Prospective identification of high-risk polycythemia vera patients based on JAK2(V617F) allele burden.Leukemia,2007,21:1952-1959.

10Barbui T,Carobbio A,Cervantes F,et al.Thrombosis in primary myelofibrosis: incidence and risk factors.Blood,2010,115:778-782.

11Nangalia J，Massie CE，Baxter EJ，et al.Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.N Engl J Med，2013，369：2391-2405.

12Klampfl T，Gisslinger H，Harutyunyan AS，et al.Somatic mutations of calreticulin in myelopmliferative neoplasms.N EnglJ Med，2013，369：2379-2390.

13Rumi E，Pietra D，F(xiàn)erretti V，et al.JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes.Blood，2014，123：1544-1551.

14Rumi E，Harutyunyan AS，Pietra D，et al.CALR exon 9 mutations are somatically acquired events in familial cases of essential thrombocythemia or primary myelofibrosis.Blood，2014，123：2416-2419.

15Geyer HL，Mesa RA.Therapy for myeloproliferative neoplasms：when，which agent，and how.Hematology Am Soc Hematol Edu Program，2014，2014：277-286.

Analysis for the coagulation disorder and complicated vascular diseases in patients with JAK2V617F mutation-positive myeloproliferative neoplasms

WANGXiaopei,CHENGJiafeng,ZHENGQianqian.

DongfangHospitalAffiliatedtoAnhuiUniversityofScienceandTechnology,Anhui,Huainan232001,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of routine blood coagulation function of patients with JAK2V617F mutation-positive myeloproliferative neoplasms (MPN) and its relationship with vascular diseases.MethodsThe clinical data and laboratory examination results of 68 patients with MPN from April 2008 to April 2015 were collected, including 28 patients with complicated vascular diseases (case group) and 40 patients without vascular diseases (control group). The correlation between JAK2V617F gene mutation and different parameters as well as vascular diseases was retrospectively analyzed.ResultsAmong 68 patients with MPN, there were 45 cases (66%) with JAK2V617F gene mutation,including 27 cases of polycythemia vera (PV,79%), 16 cases of essential thrombocythemia (ET, 53%) and 2 cases of primary myelofibrosis (PMF,50%). There were significant differences in blood cell count and routine blood coagulation parameters between case group and control group (P<0.05 or P<0.01).Moreover there were significant differences in blood cell count and routine blood coagulation parameters between JAK2V617F mutation-positive patients and JAK2V617F mutation-negative patients (P<0.05). Among 28patients with MPN complicated by vascular diseases, the incidences of vascular diseases in JAK2V617F mutation-positive patients were significantly higher than those in JAK2V617F mutation-negative patients (P<0.05 or P<0.01). ConclusionThe incidence of JAK2V617F gene mutation in patients with MPN is relatively higher,moreover, there exist significant abnormalities in blood cell count and blood coagulation function of JAK2V617F mutation-positive patients. The risk factors of thrombosis pathogenesis in JAK2V617F mutation-positive patients are more higher than those in JAK2V617F mutation-negative patients,moreover,the incidences of vascular diseases are relatively higher. To detect JAK2V617F mutation, blood cell counts and routine blood coagulation parameters in patients with MPN of preliminary diagnosis can evaluate blood coagulation function of patients initially and prevent the occurrence of vascular complications.

【Key words】myeloproliferative neoplasms;JAK2V617F mutation; thrombosis;blood routine test;blood coagulation function

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.11.005

【中圖分類號】R 733.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)11-1617-04

(收稿日期：2015-11-07)