吳穎虹 王仁杰 柳萬江 賈志紅 張玨

熒光原位雜交法應(yīng)用于胃癌Her-2基因檢測及其臨床意義

吳穎虹 王仁杰 柳萬江 賈志紅 張玨

目的 探討熒光原位雜交法(FISH)應(yīng)用于胃癌Her-2基因檢測及其臨床意義。方法 選取54例胃癌組織標(biāo)本，采用免疫組化法(IHC)及FISH對標(biāo)本中胃癌Her-2蛋白表達與基因擴增情況進行測定，并比較測定結(jié)果。結(jié)果 （1）FISH測定結(jié)果：14例表現(xiàn)為標(biāo)本擴增，40例表現(xiàn)為標(biāo)本無擴增，Her-2基因擴增率為25.93%；（2）IHC測定結(jié)果：10例Her-2表達為+++，8例Her-2表達為++，16例Her-2表達為+，20例Her-2表達為0，Her-2蛋白表達率為18.52%；（3）擴增符合率：Her-2蛋白表達為0時，Her-2擴增符合率為5.00%；Her-2蛋白表達為+時，Her-2擴增符合率為6.67%；Her-2蛋白表達為++時，Her-2擴增符合率為37.50%；Her-2蛋白表達為+++時，Her-2擴增符合率為90.00%；總符合率為25.93%，且呈現(xiàn)為正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 在胃癌篩查中，可將IHC作為初步篩查手段，而針對晚期胃癌患者則建議行FISH檢測，以便進一步了解Her-2基因狀態(tài)，為臨床靶向治療提供明確信息。

胃癌；Her-2基因；熒光原位雜交法；免疫組化法

胃癌是近幾年來發(fā)病率較高的一種腫瘤疾病，并以每年新發(fā)

100余萬的速度遞增，而在新發(fā)病例中超過42%的病例為中國病例，加之其較高的死亡率，如今，我國已成為了胃癌發(fā)病率和死亡率均較高的國家[1]。隨著對胃癌發(fā)病原因、機制等研究的深入，人類表皮生長因子受體2（Her-2）隨之成為了胃癌靶向治療的新焦點，Her-2是位于人類染色體17q12-21.3上的原癌基因，是表皮生長因子受體（EGFR）家族中非常重要的成員之一，其在細胞分化、生長以及增殖中均有參與，為此，Her-2基因表達有無表達，直接關(guān)系著胃癌靶向治療藥物的選擇，特別是靶向性基因治療。故對胃癌Her-2基因進行測定，了解其表達情況，對臨床治療、預(yù)后判斷有著重要意義。鑒于此，本科室在課題研究中，采用免疫組化法(IHC)及熒光原位雜交法(FISH)對胃癌Her-2基因進行測定，并分析其臨床意義。現(xiàn)將有關(guān)情況報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究胃癌組織標(biāo)本均來自江西省景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院2013年1月～2015年12月接診的54例胃癌手術(shù)患者，其中女21例，男33例，患者年齡55～73歲，平均年齡（65.23±2.15）歲。所有患者術(shù)前均未行放化療治療。

1.2 方法

1.2.1 FISH 取17號染色體著絲粒（CEP17），可將其標(biāo)記為綠色，并將Her-2基因標(biāo)記為紅色。具體操作步驟為：取組織切片，依次對其進行脫蠟，無水酒精中室溫10min去除二甲苯，梯度酒精脫水后，純化水煮沸處理20min，室溫晾干，在37℃條件下，行200mg/L胃蛋白酶反應(yīng)，持續(xù)消化進行5～15min，多次SSC洗滌，再依次梯度酒精脫水，向其中加入探針混合液

10μL，85℃雜交儀行5min變性處理，37℃環(huán)境下行過夜雜交處理。采用0.3%NP-40/0.4×SSC66℃處理1min，采用

0.11 %NP-40/2×SSC室溫環(huán)境下行1min處理，采用乙醇進行3min洗片處理，對其進行干燥處理，放置到10μLDAPI復(fù)染劑中進行復(fù)染處理，封片，靜置于避光處，20min后取出，放置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 IHC 取胃癌病理組織標(biāo)本，采用中性甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋處理，切片，厚度4μm，運用IHCEliVision Plus二步法行染色處理，放置于高倍顯微鏡下觀察10個視野，并將Her-2蛋白表達定位在細胞膜，陽性反應(yīng)物呈現(xiàn)為棕黃色顆粒狀。

1.3 評價標(biāo)準

1.3.1 FISH評價標(biāo)準 經(jīng)熒光顯微鏡下對60個細胞進行計數(shù)，并對Ratio值進行統(tǒng)計，若Ratio值低于1.8即可視為陰性，這表明該樣本并不存在Her-2基因擴增；若Ratio值控制在1.8～2.2范圍內(nèi)，則將細胞計數(shù)增加到100個或者再次進行FISH實驗，并根據(jù)結(jié)果進行判定；若Ratio值超過2.2即可視為陽性，這表明該樣本中存在Her-2基因擴增；若觀察發(fā)現(xiàn)，紅色信號點呈現(xiàn)為成簇擴增，同樣也表明該樣本為Her-2基因擴增陽性。

1.3.2 IHC評價標(biāo)準 （1）0/陰性：細胞膜均未染色或者＜10%腫瘤細胞膜染色；（2）+/陰性：腫瘤細胞超過10%，細胞膜表現(xiàn)不完整，且呈現(xiàn)為弱染色；（3）++/不確定：腫瘤細胞超過10%，細胞膜表現(xiàn)輕度到中度完整；（4）+++/陽性：腫瘤細胞超過10%，細胞膜表現(xiàn)非常完整，且呈現(xiàn)為強染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS15.0進行分析處理，運用Kendall行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FISH檢測結(jié)果 54例胃癌患者胃癌組織中，14例表現(xiàn)為標(biāo)本擴增，40例表現(xiàn)為標(biāo)本無擴增，Her-2基因擴增率為25.93%（14/54）。

2.2 IHC檢測結(jié)果 54例胃癌患者胃癌組織中，10例標(biāo)本測定結(jié)果Her-2表達為+++，8例標(biāo)本測定結(jié)果Her-2表達為++，16例標(biāo)本測定結(jié)果Her-2表達為+，20例標(biāo)本測定結(jié)果Her-2表達為0，Her-2蛋白表達率為18.52%（10/54）。

2.3 FISH與IHC測定結(jié)果比較 Her-2蛋白表達為0時，Her-2擴增符合率為5.00%(1/20)；Her-2蛋白表達為+時，Her-2擴增符合率為6.67%(1/15)；Her-2蛋白表達為++時，Her-2擴增符合率為37.50%；Her-2蛋白表達為+++時，Her-2擴增符合率為90.00%。兩種方法檢測結(jié)果總符合率為25.93%（14/54），且呈現(xiàn)為正相關(guān)（r=0.761，P＜0.05）。見表1。

表1 FISH基因擴增與IHC蛋白表達擴增結(jié)果比較（n）

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)也日漸成熟，并在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛運用，在幫助人類進一步了解細胞生活活動中發(fā)揮了重要作用[2]。隨著對細胞生長、分化、增殖以及癌變等認識的逐漸深入，關(guān)于參與其變化的調(diào)節(jié)分子機制的研究也隨之增多，這使得本研究從更新的角度和層面了解胃癌的病變和發(fā)展過程，同時也將分子生物學(xué)技術(shù)逐漸發(fā)展到了腫瘤臨床診斷、預(yù)后判斷等方面[3]。

自1987年首次報到Her-2過表達的預(yù)后意義以來，Her-2基因成為了臨床應(yīng)用較為廣泛的腫瘤標(biāo)記物[4]。當(dāng)人體Her-2基因呈現(xiàn)為大量擴增時，必然會導(dǎo)致蛋白產(chǎn)物P185呈現(xiàn)為過表達，從而致使Her-2受體異源二聚體形成數(shù)量快速增多，致使細胞內(nèi)酪氨酸激酶的活性呈現(xiàn)為快速增多，并致使酪氨酸自身磷酸化，致使多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑快速激活，出現(xiàn)細胞大量增殖的情況，引起癌變反應(yīng)[5]。在卵巢癌、肺腺癌以及乳腺癌等惡性腫瘤疾病中，Her-2蛋白或者基因擴增均呈現(xiàn)為過表達。有文獻報道表示[6]，在胃癌中，Her-2基因擴增陽性率為7.1%～42.6%，而過表達率為6.8%～34%。而Her-2基因非常容易接近抗體，故將其作為腫瘤免疫治療靶位是目前學(xué)界公認觀點。

目前，在Her-2檢測中，主要采用FISH與IHC兩種方法，其中IHC由于其操作簡單方便，且成本低廉，同時通過顯微鏡能夠觀察到腫瘤組織中Her-2陽性變化，故被視為Her-2檢測的首選方法。但IHC在檢測中極易受到各方面因素的干擾，并且方法相對較為間接，故其準確性和穩(wěn)定性有待進一步考察[7]。FISH是一種分子遺傳學(xué)檢測技術(shù)，作為分子生物學(xué)技術(shù)中逐漸成熟起來的新技術(shù)，F(xiàn)ISH是一種用于胃癌診斷的分子水平分析技術(shù)，其主要通過細胞表型、組織病理學(xué)和基因型三方面的結(jié)合，來實現(xiàn)對腫瘤疾病的診斷，具有較高靈敏度、準確性和穩(wěn)定性，其測定結(jié)果更為客觀[8]。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH檢測Her-2基因擴增率為25.93%，該結(jié)果表明，F(xiàn)ISH在Her-2基因擴增陽性率明顯更高，且呈現(xiàn)為正相關(guān)。

綜上所述，在胃癌Her-2狀態(tài)篩查中，F(xiàn)ISH與IHC均具有一定的臨床應(yīng)用價值，能夠客觀、準確地反應(yīng)出Her-2狀態(tài)，但實際運用中，建議將IHC作為初步篩選方法，針對晚期胃癌患者則建議采用FISH作進一步檢查。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.22.011

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江西 333000 江西省景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院病理科 （吳穎虹王仁杰 柳萬江 賈志紅 張玨）

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